专利名称：具有谷氨酰胺合成酶功能的基因、其编码蛋白及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及一种具有谷氨酰胺合成酶功能的基因、其编码蛋白及其克隆方法。
背景技术：
氮素是作物从土壤中吸收量最多的元素，是高等植物必需的营养元素之一。相对于作物对氮素的需求，土壤圈中天然存在的生物有效氮含量通常很低，而提高氮素施用水平对提高作物产量有显著的效应，这促成了氮素化学合成工业的快速发展以及化学合成氮素肥料在农业中大量而广泛的使用。目前，我国已成为世界氮素化肥的第一生产和消费大国，且施用量仍呈每年递增态势。然而，无机氮肥的应用会造成一系列环境问题，尤其是淡水，进而江河和海水的富营养。正因为如此，如今需要降低氮肥的使用量，并寻找氮利用率更高的植物基因型。更高的氮利用率可以保证在产量不下降的前提下，减少氮肥的使用量。对于生物体的生长和发育而言，氮素的同化是个十分重要的生理过程，无机氮必须同化为谷氨酰胺形式的有机氮才能被生物体所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)是GS-G0GAT氮同化路径上的关键酶，它和谷氨酸合成酶联合作用，催化 NH4+同化成谷氨酰胺，而谷氨酰胺又在谷氨酸合酶的催化下，将其酰胺转移到α -酮戊二酸上，从而生成两分子的谷氨酸。谷氨酰胺在生物体内含氮有机物的生物合成中作为氮供体， 而外界的无机氮元素也通过这个途径进入生物体内的整个氮素循环。因此谷氨酰胺合成酶在生物体氮同化过程中起到了十分重要的作用。盐藻{JJimaliella viridis)属于团藻目、多毛藻科、杜氏藻属生物，是耐盐性最强的真核单细胞藻类。不仅可在高盐海水和盐湖等生长，也能经受外界环境中盐浓度0. 5-5. 5 mol/L剧烈变化。在外界高盐的环境下，盐藻可利用环境中低浓度(毫摩尔)的NO3—和NH4+。 研究盐藻的氮利用途径，有利于搞清楚高盐环境下植物氮利用途径及调控机制。因此，盐藻谷氨酰胺合成酶基因的克隆及功能鉴定对于改善逆境下农作物的性状有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供了一个具有编码谷氨酰胺合成酶功能的基因。该基因是从盐藻中分离的一个DNA分子，称为DvGSl。本发明的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。本发明的目的之三在于提供了该基因的克隆方法。本发明的目的之四在于该基因在提高植株的氮利用率中的应用。为达以上目的，本发明通过下述方案实现
一种具有谷氨酰胺合成酶功能的基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO 1所示的碱基序列。一种上述的具有谷氨酰胺合成酶功能的基因的编码蛋白，该蛋白为SEQ ID NO 2 所示的氨基酸序列。
一种上述的具有谷氨酰胺合成酶功能的基因的克隆方法，其特征在于该方法的具体步骤为利用SMART cDNA construction kit构建了 3个盐藻cDNA文库，通过对该3个文库中cDNA序列的测序，获得对应的EST文库；再通过序列比对，分离到了一个谷氨酰胺合成酶基因，命名为；挑选cDNA文库相应克隆进行测序，获得了含有该基因完整ORF的 cDNA序列。上述的建立3个盐藻cDNA文库的具体步骤为取液氮冻存的盐藻样品，抽提不同盐藻样品的总RNA，通过甲醛变性电泳检测不同总RNA样品的质量，之后用紫外分光光度计测定混合后总RNA的0D260及0拟60/0拟80的值，计算总RNA的浓度及纯度；随后采用SMART cDNA library construction kit进行盐藻全长cDNA的合成，接着利用 TRIMMER-DIRECT cDNA Normalization Kit对盐藻全长cDNA进行均一化处理；将制备好的 pBluescript SK-载体和cDNA片段按1 5的摩尔比在25 μ 体系中，于14°C下连接过夜；连接物经脱盐后，进行电激转化；然后，将所有转化物混合，即得到盐藻的全长、均一化 cDNA文库。一种重组表达载体，该重组载体含有上述的基因。一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述的重组载体。一种上述的具有谷氨酰胺合成酶功能的基因在低氮环境下提高生物氮利用效率方面的应用。一种上述的基因编码的蛋白在低氮环境下提高生物氮利用效率方面的应用。本发明的具有谷氨酰胺合成酶功能的基因具有合成谷氨酰胺合成酶功能，能恢复大肠杆菌突变体合成谷氨酰胺的能力，同时也显示了它在农作物氮高效利用方面的应用价值。
图1为本发明的基因编码的蛋白亚细胞定位预测图，表明该编码蛋白定位在细胞质的可能性很大。图2为本发明的基因编码的蛋白的进化分析图，表明该编码蛋白属于谷氨酰胺合成酶家族。图3为本发明的基因在野生型拟南芥中过表达后，与未转基因的拟南芥相比，出现根长明显增长的现象，表明能够显著增加拟南芥的生长速度。图4为本发明的基因编码的蛋白在野生型拟南芥中过表达后，与未转基因的拟南芥相比，地上部分重量显著增加的数据统计，表明々⑷幻能够显著增加拟南芥的生物量。图5为本发明的基因编码的蛋白在野生型拟南芥中过表达后，与未转基因的拟南芥相比，地上部分总氮含量测定的数据统计，表明々⑷幻能够显著增加拟南芥的氮含量。
具体实施方案下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)》，或按照制造
厂商所建议的条件。
实施例一盐藻全长均一化cDNA文库的构建取液氮冻存的盐藻样品，用TRIzoI试剂分别抽提不同盐藻样品的总RNA。通过甲醛变性电泳检测不同总RNA样品的质量。之后用紫外分光光度计测定混合后总RNA的0D260及0拟60/0拟80的值，计算总RNA的浓度及纯度。随后采用 Clontech 公司的 Creator SMART cDNA library construction kit 进行盐藻全长cDNA的合成，接着利用Evrogen公司的TRIMMER-DIRECT cDNA Normalization Kit对盐藻全长cDNA进行均一化处理。将制备好的pBluescript SK-载体和cDNA片段按1 5的摩尔比在25 μ 体系中 ，于14°C下连接过夜。连接物经脱盐后，进行电激转化。然后，将所有转化物混合，即得到盐藻的全长、均一化cDNA文库(数据未发表)。
实施例二 ..DvGSl基因全长编码区的克隆与分析通过对文库中cDNA的序列进行大规模测序，获得对应的EST文库(数据未发表)。通过序列比对，分离到了一个盐藻谷氨酰胺合成酶基因，命名为。挑选cDNA文库相应克隆进行测序，获得了含有该基因完整ORF的 cDNA序列。测序结果表明-.DvGSl的cDNA全长1874bp，含有绿藻基因特异的加尾信号TGTAA 及poly(A)结构。Vector NTI9. 1. O软件的分析结果显示该基因编码一个含385个氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小约为43kDa，等电点为6. 18。利用Cell-PLoc网站的Euk-mPLoc 2.0对基因编码的蛋白进行亚细胞定位预测，预测数据显示该蛋白定位在细胞质的可能性很大，参见图1，这与其它物种中的谷氨酰胺合成酶的定位信息相符。进化分析表明， DvGSl基因编码的蛋白属于谷氨酰胺合成酶家族，参见图2。
实施例三转拟南芥植株的获得和鉴定将基因正确构建于植物表达载体 PBI121中，获得含目的基因的植物表达载体pBI 121 DvGSl。在根癌农杆菌(^rohcieriws tumefaciens) Qn1HQI的介导下，通过浸花法(Floral-dip)将构建的植物表达载体转入野生型拟南芥Mra力ii/oAsis中。通过浸花法(Floral-dip)转基因操作的拟南芥植
株的种子成熟后收获，用75%的乙醇对表面灭菌后，撒播于加有卡那霉素筛选标记的1/2MS 培养基上，约一周时间，非转基因苗因对卡那霉素敏感无法合成叶绿素逐渐死亡。而Tl代抗性苗却正常生长，并长出真叶，被筛选出来。实验结果说明成功的将基因转入拟南芥植株中。
实施例四在野生型拟南芥中过表达后拟南芥的生长速度分析将纯合的T4代转基因植株种子与同批次种植的野生型种子经表面灭菌后，共同点播在1/2MS培养基上，4°C 春化72hrs，竖直放置于拟南芥培养间(光周期=Whrs光/Shrs暗，温度22士3°C)中。在种子萌发4天后拍照记录1/2MS平板上幼苗的生长情况，并用Image-Pro plus软件进行根长分析。如图3所示，在统计了共计80个样本量的总根长后发现，DvGSl过表达的转基因拟南芥的总根长比WT的总根长在总长度上增加16%。该根长分析实验说明，过表达的转基因拟南芥在幼苗期与野生型相比有明显的生长优势，同时也预示了它在农作物氮高效利用方面的应用价值。
实施例五在野生型拟南芥中过表达后拟南芥的生物量分析本实验室将纯合的T4代转基因植株种子与同批次种植的野生型种子经表面灭菌后，共同点播在1/2MS 培养基上，4°C春化72hrs，竖直放置于拟南芥培养间(光周期=Whrs光/Shrs暗，温度 22士3°C)中。在种子萌发4天左右，根长长至1-1. 5cm时转移至拟南芥水培体系中，水培所用的营养液为PNS (营养液配方为每升含5ml IM KNO3, 2ml IM Ca(NO3)2 . 4H20, 2ml IM MgSO4 · 7H20, 2. 5ml 20mM Fe · EDTA, 2. 5ml IM 磷酸缓冲液(pH5. 5)，Iml MS 微量元素)在拟南芥培养间共培养M天，取地上部分植株称量鲜重，其中野生型拟南芥样本量为30株(6 株一组称重)，DvGSI-TLI拟南芥的样本量为42株(6株一组称重)。如图4所示，DvGSl过表达的转基因拟南芥的地上部分比WT的地上部分在鲜重上增加33%，差异显著。该生物量分析实验说明，々⑷幻过表达的转基因拟南芥与野生型相比有明显的生长优势，同时也预示了它在农作物氮高效利用方面的应用价值。
实施例六在野生型拟南芥中过表达后拟南芥的总氮含量量分析本实验室将纯合的T4代转基因植株种子与同批次种植的野生型种子经表面灭菌后，共同点播在1/2MS 培养基上，4 °C春化72hrs，竖直放置于拟南芥培养间(光周期Whrs光/Shrs暗，温度 22 士 3°C)中。在种子萌发4天左右，根长长至1-1. 5cm时转移至拟南芥水培体系中，水培所用的营养液为PNS，在拟南芥培养间共培养M天，取地上部分植株称量鲜重，其中野生型拟南芥样本量为30株(6株一组称重)，iV6S/-TLl拟南芥的样本量为42株(6株一组称重)。将称好重量的拟南芥在液氮中磨碎后，用凯氏定氮法测量植物组织中的总氮含量。如图5所示，DvGSl过表达的转基因拟南芥的地上部分比WT的地上部分在总氮含量上增加19. 23%， 差异显著。该总氮含量分析实验说明，DvGSl过表达的转基因拟南芥与野生型相比总氮含量上升明显，同时也预示了它在农作物氮高效利用方面的应用价值。尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的， 即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
序列表 <110>上海大学
<120>具有谷氨酰胺合成酶功能的基因、其编码蛋白及其克隆方法
<160> 2
<210> 1
<211> 1874
<212> DNA
<213> HiDunaliella viridis) <400> 1
CACGCGGTGG CGGCGCTCTA TAACTATGGA TCCCCGGGCT GCGGAATCGG CACGAGCACA 60 AACACACACC AACCGGGGTC GCAGGCAGGC ACCTCTCGCA GACTCTCCTA CTCTCCTACA 120
权利要求
1.一种具有谷氨酰胺合成酶功能的基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO 1所示的碱基序列。
2.一种根据权利要求1所述的具有谷氨酰胺合成酶功能的基因的编码蛋白，该蛋白为 SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.一种根据权利要求1所述的具有谷氨酰胺合成酶功能的基因的克隆方法，其特征在于该方法的具体步骤为利用SMART cDNA construction kit构建了 3个盐藻cDNA文库， 通过对该3个文库中cDNA序列的测序，获得对应的EST文库；再通过序列比对，分离到了一个谷氨酰胺合成酶基因；挑选cDNA文库相应克隆进行测序，获得了含有该基因完整ORF的 cDNA序列。
4.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的建立3个盐藻cDNA文库的具体步骤为取液氮冻存的盐藻样品，抽提不同盐藻样品的总RNA，通过甲醛变性电泳检测不同总RNA样品的质量，之后用紫外分光光度计测定混合后总RNA的0D260及0D260/0拟80 的值，计算总RNA的浓度及纯度；随后采用SMART cDNA library construction kit进行盐藻全长cDNA的合成，接着利用TRIMMER-DIRECT cDNA Normalization Kit对盐藻全长 cDNA进行均一化处理；将制备好的pBluescript SK-载体和cDNA片段按1 5的摩尔比在 25 PL体系中，于14°C下连接过夜；连接物经脱盐后，进行电激转化；然后，将所有转化物混合，即得到盐藻的全长、均一化cDNA文库。
5.一种重组表达载体，该重组载体含有上述的基因。
6.一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述的重组载体。
7.一种根据权利要求1所述的具有谷氨酰胺合成酶功能的基因在低氮环境下提高生物氮利用效率方面的应用。
8.一种根据权利要求2所述的基因编码的蛋白在低氮环境下提高生物氮利用效率方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种具有谷氨酰胺合成酶功能的基因、其编码蛋白及其克隆方法。该基因为SEQIDNO1所示的碱基序列。本发明的具有谷氨酰胺合成酶功能的基因具有合成谷氨酰胺合成酶功能，能恢复大肠杆菌突变体合成谷氨酰胺的能力，同时也显示了它在农作物氮高效利用方面的应用价值。
文档编号C12N9/00GK102250926SQ201110148440
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者宋任涛, 朱晨光, 李兆颖, 王维华, 范倩岚, 许政暟 申请人:上海大学