专利名称：一种贝类凝集素基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种贝类凝集素基因及其应用。
背景技术：
马氏珠母贝(Pinctada martensii)又称合浦珠母贝，是中国及世界上海水珍珠培育的最主要贝类之一，广泛分布于热带、亚热带的太平洋和印度洋沿岸。其中在中国主要分布在广东、广西、海南和台湾沿海。在中国，自从1965年马氏珠母贝人工育苗成功地推广以来，海水珍珠养殖的面积不断扩大，产量逐年增加，海水珍珠已成为我国重要的出口产品。以其培育的珍珠被称为“南珠”，闻名于国内外。但是由于长期的人工养殖和繁育，育珠贝变小，死亡率增加，马氏珠母贝种质已呈现明显退化现象、珍珠的产量和质量都明显下降。研究其先天性免疫机制将有助于其疾病防治和增加珍珠产量。贝类属于无脊椎动物软体动物门，其种类多达115000，是动物界的第二大门， 也是世界上最重要经济类群之一。在贝类中，免疫包括体液免疫和细胞介导的免疫。这二者协同作用，共同抵御微生物对机体的入侵。血细胞通过受体介导的包吞作用和各种细胞毒性反应(例如释放溶酶体酶、抗菌肽、经由呼吸爆发而产生的活性氧)杀伤入侵微生物。参与贝类细胞免疫的受体主要包括两大类一类是细胞表面受体，例如血细胞膜上的凝集素； 另一类是具有调理作用的调理素，例如血清凝集素。目前在马氏珠母贝中分离的凝集素还极为有限，因此有必要分离更多的相关因子，以更深入的了解其抗病机理。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，提供一种贝类凝集素基因。本发明另一目的在于提供上述贝类凝集素基因在体外的重组表达方法。本发明还有一个目的在于提供上述贝类凝集素基因在介导细胞凝集中的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
本发明所述的HMG基因(贝类凝集素基因)是从马氏珠母贝抑制性差减杂交文库中筛选出来的。在随机挑选并测序的2000个克隆中，共检测到该基因的一个克隆。该基因cDNA 全长819bp，其cDNA序列如SEQ ID NO: 1所示；自41bp至52!3bp区段为其开放阅读框，编码173个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示；5，非编码区长40bp，3，非编码区长 296bp,有多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和多聚腺苷酸尾巴。一种表达载体，含有上述的贝类凝集素基因。本发明所述贝类凝集素基因编码的蛋白的表达过程中，使用的表达载体为 pMAL-c2X，使用的细胞系为BL21 (DE3)。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明使用实时定量PCR技术分析了马氏珠母贝/M mRNA在血细胞、消化腺、腮、外套膜、心脏、闭壳肌、性腺组织中的表达水平。结果表明—在血细胞、消化腺、腮中有高水平的表达，在性腺和外套膜中有中度表达，在心脏和闭壳肌中几乎无表达。当病原体入侵机体
3后，机体会产生免疫应答反应，与免疫相关的基因的表达会产生明显的变化。运用实时定量 PCR技术检测了马氏珠母贝在受弧菌刺激后，其血细胞中的的表达水平的变化。结果表明，在受弧菌刺激后48小时，血细胞中的· mRNA达到最高水平(P<0. 05)，之后表达水平逐渐下降，在刺激后7 恢复到正常水平。使用原核表达方法制备该基因的重组蛋白，用于研究该基因在介导血细胞凝集和细菌凝集方面的作用。
图1为实时定量PCR检测· mRNA在不同组织中的分布；血细胞haemocytes ； ffl it 1/1 :hepatopancreas ； :heart ； Ig :gill ；夕卜· H :mantle ； f生 gonad ； 1 Ul adductor muscle。结果表明·在血细胞、消化腺、腮中有高水平的表达，在性腺和外套膜中有中度表达，在心脏和闭壳肌中几乎无表达；
图2为弧菌刺激后，血细胞中·的表达模式；星号(*)指示与Oh对照组之间有显著性差异；
图3为纯化的HMG重组蛋白；Lanel 蛋白标记；Lane 2 重组表达的MBP-HMG ；Lane3: 纯化的MBP标签；箭头指示重组表达的目的蛋白MBP-HMG。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1. RNA 提取
总RNA的提取使用SV Total RNA Isolation System (Promega)提取，具体步骤如下 A、取少量组织(不超过30 mg)于液氮预冷的研钵中，将组织磨成粉末之后，转移到装有 175 μ L RNA Lysis Buffer的离心管中并混勻。B、向裂解产物中加入350 μ L RNA Dilution Buffer (RDA)0颠倒3-4次混合溶液。在70°C干浴锅上处理3 min。C、在13，OOOXg离心10 min。转移上清到一个新的离心管。向上清中加入200 μ L乙醇，通过颠倒3-4次混勻。将混合物转移到离心柱，在13，OOOXg离心1 min。D、丢弃收集管中的液体。将离心柱重新放回到收集管。加入600 μ L RLA，在 13，000 Xg 离心 1 min。Ε、倒掉收集管中的液体。F、制备DNase 反应混合物40 μ L Yellow Core Buffer, 5 μ L 0. 09 M MnCl2 和 5 μ L DNase I溶液(冰上解冻)。通过轻轻的吹打混勻溶液。向每一个离心柱加入50 μ L 新鲜制备的DNase I孵育混合物。G、在室温孵育 15 min 之后，加入 250 μ L DNase Stop Solution (DSA)，在 13，OOOXg 离心 1 min。H、加入 600 μ L RNA Wash Solution (RWA)，在 13，000Xg 离心 1 min。
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I、倒空收集管，加入 250 μ L RNA Wash Solution (RWA)，高速离心 2 min。J、丢掉收集管，将离心柱装入1.5 ml的离心管，加100 PL无核酸酶水，然后，在13，OOOXg离心1 min，弃离心柱，使用分光光度计测量RNA的浓度，分装后，贮存于_80°C。2.差减杂交文库构建
差减杂交文库使用 PCRIelect cDNA Subtraction Kit (Clontech, USA)试剂盒进行构建。马氏珠母贝受弧菌刺激他后，收集血细胞，按照上述的方法提取血细胞总RNA，并使用同样的方法提取对照组(未受弧菌处理)血细胞总RNA。以刺激后马氏珠母贝作为tester， 对照组作为driver，进行扣除杂交。将差减杂交后的cDNAs亚克隆到pGEM-T-easy载体 (Promega, USA)并转化到 Esctwrichis coli JM109 (Promega, USA)感受态细胞。随机挑选2000个克隆并进行测序。3.反转录
cDNA 的制备使用 STOR PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time) (TaKaRa)试剂盒。反应总体积为20mL。在200mL薄壁管中依次加入以下成份5 XI^rimeScript buffer 4mL, PrimeScript RT Enzyme mix :lmL,随机六碱基核苷酸2mL，总 RNA :300ng，RNA 酶抑制剂(TaKaRa) :20U。将上述成份混勻，在37°C处理30分钟，85°C处理10秒，一 20°C保存。4.实时定量PCR
进行实时定量PCR (qRT-PCR)所使用的试剂盒为STOR PrimeScriptTM RT-PCR Kit (Perfect Real Time) (TaKaRa)，所使用的仪器为 LightCycler 480 System (Roche), 所使用的模板为上述所获得的反转录产物，所使用的内参为A-adi ，所使用的引物有 qRT-HMG For (SEQ ID NO:3), qRT-HMG Rev (SEQ ID NO:4) ；qRT-β -actin For (SEQ ID NO: 5), qRT-β -actin Rev (SEQ ID N0:6)。qRT-PCR 的反应体系如下2XMix :10mL, qRT-HMG For :0. 2mM ；qRT- HMG Rev :0. 2mM ；反转录产物(cDNA) :50ng。热循环条件如下95°C 处理10 min ；接下来运行40个循环95°C变性5秒，60°C退火延伸20秒。qRT-PCR运行完成后，进行溶解曲线分析以确定PCR扩增是否特异。使用2 —DDCT方法对转录本进行相对定量。对于每一份样品，实验组和对照组均设置3个平行反应。5.重组蛋白的原核表达和纯化
以编码HMG蛋白的核苷酸序列和pMAl_c2X载体制备表达质粒，然后转化BL21 (DE3)。 挑选单克隆并培养至OD=O. 6，然后加入IPTG至终浓度为0. ImM,在22°C，220rmp的条件下诱导表达。4h后收集菌液，4°C，12，000Xg离心10分钟。加入Column Buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4，200 mM NaCl, 1 mM EDTA)，超声破碎，离心，取上清，使用 Amylose resin column (NEW ENGLAND BioLabs)进行亲和纯化。使用SDS-PAGE胶检测纯化产物的大小和纯度。
权利要求
1.一种贝类凝集素基因，其特征在于其CDNA序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.根据权利要求1所述的贝类凝集素基因，其特征在于基因的cDNA全长819bp，自 41bp至52!3bp区段为开放阅读框，编码173个氨基酸，5’非编码区长40bp，3’非编码区长 296bp,有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴。
3.权利要求1所述的贝类凝集素基因编码的蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQID N0:2所示。
4.一种表达载体，其特征在于含有权利要求1所述的贝类凝集素基因。
5.权利要求3所述贝类凝集素基因编码的蛋白的表达方法，其特征在于使用的表达载体为 pMAL-c2X，使用的 fecAericAia coli 细胞系为 BL21 (DE3)。
6.权利要求3所述贝类凝集素基因编码的蛋白在介导细菌凝集中的应用。
7.权利要求3所述贝类凝集素基因编码的蛋白在介导红细胞凝集中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种贝类凝集素基因及其应用。本发明所述贝类凝集素基因的cDNA全长819bp，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，自41bp至523bp区段为开放阅读框，编码173个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；5’非编码区长40bp，3’非编码区长296bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴。本发明所述贝类凝集素基因在贝类免疫反应过程中发挥了重要的作用。
文档编号C12N15/12GK102250909SQ20111014862
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者喻子牛, 张扬, 陈金辉 申请人:中国科学院南海海洋研究所