专利名称：：一种与草甘膦抗性相关的ⅱ型epsp合酶保守模体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种II型EPSP合酶的序列模体。
背景技术：
：EPSP合酶(5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶，EC2.5丄19)作为莽草酸合成途径的第六位酶，是除草剂草甘膦作用的靶标酶，对植物、真菌、细菌和部分病原寄生虫合成芳香族氨基酸及其它芳香族代谢产物必不可少的。由于哺乳动物体内不存在莽草酸途径，因此EPSP合酶成为研发新型除草剂和新型抗菌素等的靶标酶。EPSP合酶分I型和II型两种类型，其中II型EPSP合酶通常都源于草甘膦耐受的微生物，有较高的底物PEP亲和性和催化效率。如源自根癌脓杆菌CP4的EPSP合酶，不受草甘膦抑制并且为耐受草甘膦转基因作物提供了一个新的作用模式。如果能发现II型EPSP合酶的高度保守序列模体，可以为研发新型抗草甘膦植物、研发新型除草剂和新型抗菌素等提供方便的手段。已有人做了此方面的工作，如Monsanto公司利用定点突变方法对CP4EPSP合酶与草甘膦抗性相关的模体进行了研究，发现了Arg-X-His-X-Glu、Gly-Asp-Lys-X、S-A-Q-X-K和Asn-X-Thr-Arg四个序列模体在II型酶中高度保守，通过替换X位点氨基酸会极大影响该型酶对草甘膦的抗性。
发明内容本发明的目的是提供一种新的II型EPSP合酶序列模体。本发明在II型EPSP合酶中发现了一个新的高度保守的序列模体(sequencemotif)，其氨基酸序列是Arg-Pro-Met-X-Arg，所述X选自以下氨基酸中任意一种Ala，Val，Leu，Ile，Met，Phe，Trp，Pro，Gly，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr，Arg，Lys，His,Asp或Glu。实验证实，除X外，所述序列模体中其它四个氨基酸对酶活力至关重要。可作为化合物攻击的靶位点，为抗菌新药物的合成奠定基础；所述序列模体中，X是不保守位点氨基酸，实验证实，用不同的氨基酸替换后可提高或降低除草剂草甘膦的抗性。为II型EPSP合酶应用于抗除草剂草甘膦提供新的改造位点。如本发明使用A1501EPSP合酶作为研究实例，其X位点Asn替换为Ser等氨基酸可提高除草剂草甘膦抗性，替换为Trp后对草甘膦抗性减弱。为证实本发明的效果，进行了如下实验1、II型EPSP合酶多序列比对所有II型EPSP合酶氨基酸序列比对后，发现了新的序列模体Arg-Pro-Met-X-Arg。(见实施例1)此模体存在于已知的所有II型EPSP合酶中，其中Arg、Pro、Met、Arg四个氨基酸在所有II型EPSP合酶序列中完全保守。X位点可为二十种氨基酸替换。2、保守位点氨基酸的替换新序列模体中四个保守的氨基酸进行任意氨基酸替换，酶功能互补试验结果显示均失去酶活力。(见实施例2)3、非保守位点氨基酸替换非保守位点氨基酸替换后，酶功能互补试验结果显示功能可互补。(见实施例3)4、草甘膦抗性测定将X位点逐个进行草甘膦抗性测定，结果显示此位点的替换可提高或降低酶对除草剂草甘膦的抗性。(见实施例4)经测定，保守位点氨基酸替换后，酶失去功能；非保守氨基酸替换后，酶功能存在，对除草剂草甘膦抗性提高或降低。本发明所提供的新EPSP合酶具有如下用途1、培育高抗草甘膦植物由于非保守位点X氨基酸替换后可提高EPSP合酶对除草剂草甘膦的抗性，故此可用于培育高抗草甘膦植物。比如，新II型EPSP合酶构建与pUC18载体构建的新重组载体可用于酶功能互补实验，以及草甘膦抗性实验。2、研发新的抗菌素新II型EPSP合酶模体可作为设计抗菌药物攻击的靶位点。由于据目前报道的II型EPSP合酶均源自微生物，人和其它动物不存在此酶，故此可将新II型EPSP合酶新模体中的保守氨基酸作为新抗菌化合物攻击的靶位点，为研发新的抗菌素奠定基础。图1是pUCaroAA1501重组载体具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明本发明的方法，而不用于限制本发明的范围。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件。实施例1II型EPSP合酶多序列比对本发明在NCBI非冗繁数据库中，检索并下载所有II型EPSP合酶氨基酸序列，目前为止共有482条，使用MEGA4.0软件的CLUSTAL程序进行多序列比对。比对结果显示共有五个保守序列模体即Arg-X-His-X-Glu、Arg-Pro-Met-X-Arg、Gly-Asp-Lys-X、S-A-Q-X-K禾PAsn-X-Thr-Arg，其中发现Arg-Pro-Met-X-Arg(其中X为如下二十种常见氨基酸的任意一种Ala，Val，Leu，Ile，Met，Phe，Trp，Pro，Gly，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr，Arg，Lys，His，Asp，Glu。)为新序列模体。实施例2保守位点氨基酸的替换本发明选用A1501EPSP合酶作用研究实例，使用Stratagene公司的QuickChange^定点突变试剂盒，根据该试剂盒说明，使用QuickChang/'引物设计程序4设计重叠引物，将突变位点设计在对其核苷酸序列进行碱基突变，达到氨基酸替换的目的。将Argl27，Pro128，Metl29，Argl31(序列位置按照A1501EPSP合酶氨基酸序列标记)四个氨基酸分别替换为任意其它常见氨基酸。并采用酶功能互补试验验证，结果显示转化子未能生长，即酶功能均不能回补。具体替换氨基酸见表l。所述酶功能互补试验方法为大肠杆菌EPSP合酶缺失突变株ER2799作为受体菌。将野生型或突变体酶与pUC18用限制性内切酶BamHI和HindlII双酶切，然后16。C连接过夜，构建功能互补载体(见图l)。采用热激转化的方法，将重组载体导入受体菌，涂于M9固体限制性培养基平板，培养48小时。实施例3非保守位点氨基酸替换本发明选用A1501EPSP合酶作用研究实例，采用定点突变PCR方法对其核苷酸序列进行碱基突变，达到氨基酸突变的目的。将Asnl30位点(序列位置按照A1501EPSP合酶氨基酸序列标记)采用任意常用氨基酸替换四个氨基酸分别替换为任意，并采用酶功能互补试验验证，结果显示酶功能均可回补。具体替换氨基酸见表l。酶功能互补试验方法参见实施例2方法部分。表1新II型EPSP合酶序列模体氨基酸替换实验结果5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注新序列模体氨基酸位置按照A1501EPSP合酶位置标记；[O(HO]"-"表示功能不能互补；"+"表示功能可互补。实施例4草甘膦抗性测定将导入野生型或突变体酶的受体菌接种至M9液体限制性培养基中。分别加入终浓度为O，20，50，100，200mM草甘膦钠盐。37°C，200rpm培养48小时，用分光光度计在OD6。。nm检测菌液浓度。Asnl30位点氨基酸替换结果显示突变可使酶的抗性提高或降低。具体数据见表2。表2非保守位点X突变结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求一种II型EPSP合酶中的序列模体，其氨基酸序列是Arg-Pro-Met-X-Arg，所述X选自以下氨基酸中任意一种Ala，Val，Leu，Ile，Met，Phe，Trp，Pro，Gly，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr，Arg，Lys，His，Asp或Glu。2.—种II型EPSP合酶氨基酸序列，其特征是含有权利要求1所述模体的氨基酸序列。3.权利要求2所述EPSP合酶在培育高抗草甘膦植物中的用途。4.权利要求2所述EPSP合酶在设计抗菌药物靶位点中的用途。5.—种重组载体，包含编码权利要求2所述合酶氨基酸序列的基因。全文摘要本发明涉及一种与草甘膦抗性相关的II型EPSP合酶保守模体，其中高度保守的四个氨基酸对酶活力至关重要，可作为化合物攻击的靶位点，其氨基酸序列是Arg-Pro-Met-X-Arg，所述X选自以下氨基酸中任意一种Ala，Val，Leu，Ile，Met，Phe，Trp，Pro，Gly，Ser，Thr，Cys，Asn，Gln，Tyr，Arg，Lys，His，Asp或Glu。不保守位点氨基酸可进行替换，以提高或降低除草剂草甘膦的抗性。本序列模体的发现为新药物的合成奠定了基础，为II型EPSP合酶应用于抗除草剂草甘膦提供了新的改造位点。文档编号C12N15/82GK101691563SQ20091009352公开日2010年4月7日申请日期2009年10月12日优先权日2009年10月12日发明者平淑珍,张维,李亮,林敏,燕永亮,陆伟,陈明申请人:中国农业科学院生物技术研究所