一种α-半乳糖苷酶及其编码基因的制作方法

专利名称：：一种α-半乳糖苷酶及其编码基因的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种a-半乳糖苷酶及其编码基因。
背景技术：
：a-半乳糖苷酶(alpha-galactosidase，EC3.2.1.22)是催化a-半乳糖苷键水解的酶类，广泛的分布于植物、动物和微生物体内。它不但可以催化a-半乳糖苷类的寡糖，还可以催化含a-半乳糖苷键的多聚糖。该酶在饲料、食品、造纸和医药工业等领域具有广泛的应用前景。目前，已分离筛选出许多产a-半乳糖苷酶的微生物，如大肠杆菌、芽胞杆菌、链霉菌、青霉、红曲霉、米曲霉、黑曲霉、焦曲霉、泡盛曲霉、葡酒色被抱霉、毛霉、根霉、黄曲霉、啤酒酵母等等。微生物a-半乳糖苷酶有较高的产量，特别是丝状真菌，每升培养基可以分泌30g蛋白质，它们产生的ct-半乳糖苷酶可以分泌到胞外、具有合适的酸碱度和良好的稳定性从而最有利于技术应用。因此产生a-半乳糖苷酶的真菌受到越来越广泛的关注。豆粕是饲料工业中应用最广的植物性蛋白质原料，一般在日粮中的用量为2530%。在豆类饼粕词料中，含有57%的单胃动物不能消化的8-半乳糖苷的低聚糖，占豆粕中碳水化合物总量的40%左右，它们是一种抗营养因子，主要包括水苏糖、棉子糖和毛蕊花糖。在单胃动物的肠道内缺乏a-半乳糖苷酶，较高浓度的此类游离的水溶性低聚糖可能造成食糜黏度增高，对营养物的吸收和消化产生不利影响；同时这些低聚寡糖不能被家禽消化道的内源酶降解，只有经过消化道微生物发酵以后才能被利用。不仅消化能大大降低，而且在发酵过程中会产生C02、CH,和H2等气体，使畜禽的采食量下降，还产生胀气等疾病；另外，这些低聚寡糖还能剌激肠道蠕动，提高词料通过消化道的速度，从而降低营养物质的利用率；豆粕中还含有约14%的果胶，而果胶具有高度的粘性。这些粘性的多糖不但抑制营养物质的消化和吸收，而且还能和肠道分泌的消化酶结合，降低消化酶活性，甚至还会引起肠粘膜形态和功能的变化。果胶中约7%的&-半乳糖苷具有良好的热稳定性，在普通的饲料调制加工过程也不会失活，同时亦不能被单胃动物的内源酶消化。如果所有这些半乳糖苷都被a-半乳糖苷酶水解掉，则豆粕的代谢能含量会增加250千卡，即如果每千克日粮的代谢能含量为3000千卡，则总能量含量的增加为8.0%以上。在豆粕类饲料中添加a-半乳糖苷酶可以提高豆粕的代谢能，消除肠道的胀气现象，增加动物的采食量。把a-半乳糖苷酶作为复合酶制剂的一个成分添加到饲料中会起到明显的效果。在食品工业上，a-半乳糖苷酶可用于豆奶的发酵，水解豆奶中易使胃胀气的蜜二糖和水苏糖，从而获得低a-半乳糖基寡聚糖含量的豆奶制品，有利于人体消化。一种非处方的a-半乳糖苷酶口服液Beano，利用a-半乳糖苷酶缓解诸如胀气等胃肠疾病。这些疾病是由高纤维的饮食所致。临床研究表明，a-半乳糖苷酶对预防胃肠不适应某些寡糖有极好疗效。在制糖工业上，由于棉子糖的存在，造成糖蜜黏度增加，阻碍蔗糖晶体析出，产生大量废糖蜜。使用a-半乳糖苷酶一方面可去除废糖蜜中的棉子糖，产生半乳糖和蔗糖，提高蔗糖得率，另一方面可以减少在制糖过程中降温与再加热的费用，降低生产成本。a-半乳糖苷酶用于甜菜制糖工业中，可使甜菜废糖蜜中所含的610%棉子糖水解7687%，分解生成的蔗糖和废糖蜜中原来所含的蔗糖均能提取出来，使蔗糖产率提高34%。因此，这种工艺被称为"无废糖蜜制糖法"。甜菜上部因含棉子糖过多，往往不能利用而废弃，采用酶法制糖后，则能充分利用，并且节约能源，縮短结晶时间，使加工能力和设备周转率都有很大提高。在造纸工业中，使用a-半乳糖苷酶也是一种令人感兴趣的选择。阿拉伯木聚糖和半乳葡聚甘露聚糖是软木中主要的半纤维素组分，a-半乳糖苷酶可以水解半纤维素类的半乳葡聚甘露聚糖，使a-半乳糖从其碳链骨架上分离下来。尽管单独使用a-半乳糖苷酶处理造纸加工过程中的软木纸浆对纸张的漂白没有什么影响，但是软木纸浆被木聚糖酶、甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶的处理后，可以提高纸张的漂白效果。目前，a-半乳糖苷酶在医学界也引起广泛的兴趣。许多ct-半乳糖苷酶可以从B血细胞表面的糖蛋白水解a-1，3-D连接的末端半乳糖苷残基，从而造成B型血到0型血的转换。通过把B型血转换成的0型血可以增加通用血型。Fabry疾病(X性连锁隐性遗传性溶酶体a-半乳糖苷酶缺乏性疾病)是一种糖代谢缺陷遗传病，该疾病不但会导致疼痛，还影响肾脏、心包、中枢神经系统和皮肤，还会造成胃肠道症状。这种疾病是由人体的溶酶体a-半乳糖苷酶A缺乏造成的，从而造成糖磷脂的逐渐增加。a-半乳糖苷酶可以水解糖磷脂的末端a-半乳糖残基，这种功能可以用于治疗Fabry疾病。a-半乳糖苷酶作为一种新型的酶制剂，在许多领域都有广阔的应用前景。目前，a-半乳糖苷酶主要是利用原菌株的发酵生产，产量较低，成本较高。a-半乳糖苷酶的基因工程菌株目前报道也较少，主要还是在实验室研究阶段。因此，不断提高菌种产酶水平，研究a-半乳糖苷酶合成的调控机制、酶基因的克隆和异源高效表达，进行产业化推广应用是今后发展的发展的主要方向。随着分子生物学的发展，各种微生物来源的a-半乳糖苷酶基因从细菌、真菌中克隆并进行了功能表达分析，研究了这些基因的表达调控，并使其异源表达。许多表达系统已经成功的用于a-半乳糖苷酶的异源表达，如大肠杆菌系统、毕赤酵母系统、啤酒酵母系统、丝状真菌表达系统、昆虫表达系统等。a-半乳糖苷酶主要是利用微生物发酵法生产的，菌种主要来源于曲霉和犁头酶。据报道，美国、丹麦和日本已有这方面的基因工程菌，并且还发酵了少量产品。但由于价格较高，目前只是用于实验研究。利用工程菌株高效表达a-半乳糖苷酶，降低生产成本是生产饲料用a-半乳糖苷酶的发展方向。目前研究者已经从黑曲霉，青霉，被孢霉，伞枝犁头霉，里氏木霉等真菌中克隆获得了相关a-半乳糖苷酶的基因，并进行了异源表达。但是，焦曲霉目前多为原菌发酵，还未见焦曲霉来源的ci-半乳糖苷酶基因报道。所以，克隆焦曲霉的a-半乳糖苷酶基因，获得基因保守片段，进一步获得基因全长及异源表达，对于丰富a-半乳糖苷酶的具有重要的分类学理论指导和工业生产的实践意义。随着大量的a-半乳糖苷酶的鉴定，纯化及克隆表达的研究，该酶结构和功能的关系也受到越来越广泛的重视。通过对碱性的a-半乳糖苷酶、27家族的a-半乳糖苷酶和36家族的a-半乳糖苷酶分别进行氨基酸序列的一致性分析，发现这三类a-半乳糖苷酶有两个保守的基序(Motif)，一个是DD(/C)W，另一个为WD。第27家族的a-半乳糖苷酶的活性中心被预测含有两个羧基集团，一个含羧基的氨基酸作为催化亲核子，另一个作为催化质子供体。其中1(*0被认为是27家族最保守基序YLKYDNC的一部分，这个D已经被证明是催化亲核子。在已广泛使用的a-半乳糖苷酶中，仍存在一定缺陷，需要从新来源的菌株中获得不同性质的a-半乳糖苷酶的基因，在不同领域发挥理想作用。焦曲霉属于子囊菌门，盘菌亚门，散囊菌目，发菌科，曲霉属，目前无a-半乳糖苷酶基因的报道，多为原菌发酵生产a-半乳糖苷酶。另外，现有的技术中分离a-半乳糖苷酶的手段有限，主要是构建基因组文库或者是纯化蛋白入手。这两种方法都费时费力，效率较低，而且价格昂贵。不同物种中a-半乳糖苷酶的相似性较低，针对这样的从未报道过a-半乳糖苷酶的菌株，要获的基因序列比较困难。这也是一个种对于现有的方法去获得未知新基因的挑战。
发明内容本发明的一个目的是提供一种a-半乳糖苷酶及其编码基因。本发明所提供的a-半乳糖苷酶，来源于焦曲霉，是如下a)或b)或c)的蛋白质a)由序列表中序列1中自N端起第21-438位氨基酸残基组成的蛋白质；b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)将a)或b)限定的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有a-半乳糖苷酶活性的由a)或b)衍生的蛋白质。本发明所提供的a-半乳糖苷酶的编码基因为如下l)、2)、3)或4)的基因1)序列表中序列2所示DNA分子；2)序列表中序列3所示DNA分子；3)在严格条件下与l)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述a-半乳糖苷酶的DNA分子；4)与l)或2)限定的DNA序列具有90X以上的同源性且编码所述a-半乳糖苷酶的DNA分子。上述3)和4)所示的基因可以是由自然变异产生的，也可以是人工诱变产生的。本发明的编码基因中包括在序列2和3基础上由于遗传密码子的兼并性而产生的新序列，遗传密码子的兼并性并不影响新序列编码a-半乳糖苷酶。为了使上述(a)或(b)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列l所示的氨基酸序列组成的蛋白质或序列l中自N端起第21-438位氨基酸残基组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表l所示的标签。表l标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>Poly-His2-10(通常为6个)H朋HHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc—myc10EQKLISEEDL上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(c)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2或3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。扩增上述任一所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。所述引物对具体可为如下任一所述引物对1)一条引物序列如序列表中序列4所示，另一条引物序列如序列表中序列5所示；2)—条引物序列如序列表中序列6所示，另一条引物序列如序列表中序列7所示；3)—条引物序列如序列表中序列8所示，另一条引物序列如序列表中序列9所示。含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。所述重组载体为在表达载体pET-30a(+)的多克隆位点插入序列表中序列2所示核苷酸序列得到的重组表达载体。所述载体可为表达载体或病毒载体。本发明的重组载体中可以含有增强子等调节序列，可以根据欲转化的宿主细胞、所需的蛋白质表达水平等因素迸行了灵活改造。所述重组菌可以是通过将上述任一所述重组表达载体导入大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母得到的。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌Rosetta。本发明的最后一个目的是提供一种制备a-半乳糖苷酶的方法。本发明所提供的制备a-半乳糖苷酶的方法，包括如下步骤发酵上述任一所述重组菌得到a-半乳糖苷酶。所述方法中，在所述发酵后，还可包括纯化的步骤。所述纯化是用Ni柱亲合层析纯化，其中用到的洗脱缓冲液具体可以为NTA-200缓冲液；所述NTA-200缓冲液由终浓度为20mmol/L的Tris-Cl缓冲液、终浓度为10%(体积百分含量)的终浓度200mmol/L的咪唑组成；NTA-200缓冲液的pH值为8.0;所述终浓度为各物质在NTA-200缓冲液中的浓度。实验证明，本发明制备a-半乳糖苷酶的方法中，重组菌产酶的能力为13.242ug/ml发酵液，得到的a-半乳糖苷酶的比活为3.02U/mg。该酶在42-50°C的温度范围内都具有高的酶活性，最适作用温度为5(TC;该酶具有很好的温度稳定性，在37。C保温l小时，酶活仍保持在82.5%，在50。C保温2min，酶活保持在78%，在50"C保温4min，酶活保持在61%。该酶在PH值为6.0-9.0的范围内都具有高的酶活性，最适pH值为9.0;在pH值为6.0的条件下保温l小时后，酶活为93.7%;在pH值为7.0的条件下保温l小时后，酶活为79%;在pH值为8.0的条件下保温1小时后，酶活为84.7%;在pH值为9.0的条件下保温l小时后，酶活为85.3%。相对于其它的丝状真菌来源的a-半乳糖苷酶，本发明酶具有中性偏碱性的特点。因此，本发明酶可应用于更广泛的工业生产中，为进一步工业化高产工程菌株的构建也提供了实验的素材，为丰富a-半乳糖苷酶来源的多样性也提供了对比的序列和性质研究参考。所以本发明酶及其编码基因具有非常好的商业应用价值的应用潜力。图1为a-半乳糖苷酶基因cDNA基因的琼脂糖凝胶电泳图。图2为蛋白表达及纯化的SDS电泳结果。图3为酶学性质曲线。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中使用的焦曲霉是焦曲霉(Aspergillusustus)(CGMCCNO.3.3534)，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。实施例l、a-半乳糖苷酶编码基因的获得1、通过设计简并引物获得酶编码基因的部分序列焦曲霉属于曲霉菌属，因此搜寻现有的来源于曲霉菌属的a-半乳糖苷酶基因蛋白序列，用多序列比对程序BLOCKS[http:〃blocks.fhcrc.org/block/make—blocks,html]分析，发现了两段保守序列W(G/E)IDYLKYD和HPAEYWSGP。基于这两段保守序列，设计一对简并引物，通过PCR从焦曲霉基因组DNA中扩增获得部分a-半乳糖苷酶序列。根据两个保守区域设计简并引物，使用DNA合成仪合成。以焦曲霉(Aspergillusustus)基因组DNA为模板进行PCR扩增。除了简并引物和基因组DNA模板外，其他用于PCR扩增的试剂都购自上海申能博彩生物科技有限公司。通过PCR扩增。简并引物序列如下-5，TGGGGCATCGACTAC(T/C)T(A/T/C/G)AA(A/G)TA(T/C)GA3，(序列4)5，GGGGCCGGACCAGTA(T/C)TC(A/T/C/G)GC(A/T/C/G)GG(A/G)TG3，(序列5)聚合酶链式反应(PCR)的试剂与条件10XPCRbuffer(含MgCl2)5u1d證mix(2.5画1/U4u1Taq纖polymerase(3u/u1)1P1F(10Wnol/L)3u1R(10Mmol/L)3n1Template(焦曲霉基因组DNA)1u1ddH2033n1:§^1^TH~~PCR扩增条件194°C5min294°C45S362°C30s472°Clrainto230cycles572。ClOmin琼脂糖电泳检测，回收获得约600bp片段，PCR产物直接测序，结果确定了570bp的DNA序列为部分a-半乳糖苷酶基因。2、完整的a-半乳糖苷酶编码基因的克隆通过反向PCR(IPCR)、热不对称交错PCR(Tail-PCR)克隆获得了以上570bp基因片段的上下游区域。IPCR和Tail-PCR都是获得已知序列两端未知序列的有效手段，特别是Tail-PCR效率高，简单，便宜，更是值得应用的好方法。1)反向PCR获得570bp序列的上游序列根据以上获得的570bp的中间序列，设计了反向PCR的两对嵌套引物，分别是:反向第一轮引物FNZTCTCCTCCGCATTAACCAAGACCFNFCACTCGCACAGGGAGAACTGGAA反向第二轮引物FWZCGAAACTCATCCCGCCGAATACTFWFTCCGCCATCCTCTTGTATCGTCCPCR程序反应体系2XPCRbuffer(高GC)10u1dNTPmix(10mmol/L)1Taq(3u/u1)1u1Primerf(10Mmol/L)1U1Primerr(10Wnol/U1y1模板DNA1u1ddH202u1总体系20u1扩增条件(touch-downPCR)3rain94。C94°C60°C72°C94°C50°C72°C72°C45S30S90S45S30S90S5min-0.5s220cycles30cycles2)热不对称交错PCR扩增570bp的下游序列根据以上获得的570bp的中间序列，设计Tail-PCR的巢式特异引物对下游片段进行扩增。同时，用到的简并引物(AD，arbitrarydegenerateprimers)也是成功的关键。它们分别为下游Tail-PCR:特异引物DSP1ACGACTTGGGCACTGCTAAA,(downspecialprimer)DSP2ACAAGGATCTCCTCCGCATT,DSP3AACCCGGACTATACCTTCAA.所用简并引物ADWCAGNTGWTNGTNCTGTail-PCR程序反应体系2XPCRbuffer(高GC)12.5n1dNTPmix(10mmol/L)lu1LATaq(5u/u1)1ti1SP(10Wnol/L)0.5ulAD(lOMmol/L)4ul模板DNA1u1ddH20_5.6u1总体系25ul扩增条件TAIL--PCR1(引物为:DSP1和AD)194°Clmin225°C2min59s-O.2s372°C2min30s494°Clmin566°C30s672°C2min30s794°Clmin866。C30s972°Clmin30s1094°Clmin1144°Clmin1272°C2min30s41372°ClOminTAIL-PCR2(引物为DSP2和AD)194°Clmin294。Clmin366°C30s472°Clmin594°Clrain666°C30s772°Clmin894°Clmin942°C30S1072°Clfflin1172°ClOminTAIL--PCR3(引物为D;194°Clmin294°C30s366°C30s472°Clmin594°C30s666。C30s772°Clmin894°C30s942°C30S1072°Clmin1172°ClOrain224cycles224cycles将TAIL-PCR3获得的PCR产物利用胶回收试剂盒(购自上海申能博彩生物技术有限公司)回收，连入PEASY-T3CloningVector(购自北京全式金生物技术有限公司)，转化大肠杆菌T0P10细胞，分离含有基因的菌株，测序。通过IPCR进一步获得上游766bp的序列。通过TAIL-PCR确定获得下游1221bp的序列。三序列被输入DNASTAR软件，并通过序列拼接程序组装。获得序列全长为2832bp。该2832bp为编码基因的基因组序列，如序列表中SEQIDN0.3所示。将上述2832bp序列经过内含子分析[http:〃genes.mit.edu/GENSCAN.html]，发现拼接获得的基因含有多段内含子区域。将内含子部分去除，通过DSGENE软件进行0RF查找，发现1314bp的开放阅读框(SEQIDNO.2)。3、cDNA结构分析用QIAGENRNeasyPlantMini试剂盒(RNeasyPlantMiniKit,Cat.no.74903)，提取焦曲霉(Aspergillusustus)CGMCCNO.3.3534的总RNA;利用MBI反转录i式剂盒(Fermentas:RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit,#K1621)进行反转录，获得cDNA;以cDNA为模板，用如下引物进行PCR扩增QF:ATGTTACTTTCAGTGATCGTCATTA，(序列6)QR:TTAGTTGCTATAATATGTCCCATTC(序列7)，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，获得的片段大小1.3Kb左右，标示为J-gale。PCR产物胶回收，连入PEASY-T3CloningVector,转化大肠杆菌T0P10细胞，分离含有基因的菌株，测序，获得的cDNA序列如序列表中SEQIDN0.2所示。SEQIDNO.2所示核苷酸序列编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示。SEQIDNO.1所示由438个氨基酸组成，自N端起第1-20位氨基酸残基为信号肽，第21-438位氨基酸残基为酶。该阅读框编码了一段信号肽和一个成熟蛋白，通过SignalP程序和多序列比对，确定信号肽N端的可能切割位点为Ala20-Leu21。该关于成熟活性蛋白的N端位置的数据对于蛋白质在异源表达系统中的表达是必要的。利用P印tideMass程序确定了成熟蛋白的分子量。成熟蛋白的预测分子量为49kDa。通过ProtPar柳[http:〃us.expasy.org/tools/protparam.html]予贞测该成熟蛋白的理论等电点约为5.36。IPCR获得基因中间序列的上游至起始密码子534bp，TAIL-PCR获得基因中间序列的下游直至终止密码子前318bp。在NCBI的GeneBank中利用BLAST服务器[http:〃blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast]进行相似性分析。结果表明酶的氨基酸序列(SEQIDNO.1自N端起第1-438位氨基酸残基)显示与褐腐菌(Postiaplacenta)的假定蛋白(Genebank号为XP—002469401)的低一致性(58%)，与双色蜡蘑(Laccariabicolor)的糖基水解酶第27家族的蛋白(Genebank号为XP—001881346)的低一致性(54。/。)，并且具有和简青霉(Penicilliumsimplicissimum)的已知a-半乳糖苷酶(Genebank号为CAA08915)的低一致性(37%)。因此可以确定这个来源于焦曲霉的开放阅读框编码了一个新的a-半乳糖苷酶，将该酶命名为J-GALC。实施例2、基因工程表达获得a-半乳糖苷酶及该酶的酶学性质分析一、基因工程表达获得a-半乳糖苷酶1、a-半乳糖苷酶编码基因的制备用QIAGENRNeasyPlantMini试剂盒(RNeasyPlantMiniKit,Cat.no.74903)，提取焦曲霉(Aspergillusustus)(CGMCCNO.3.3534)的总RNA;利用MBI反转录试齐U盒(Fermentas:RevertAidFirstSt環dc腿SynthesisKit,瓶1621)进行反转录，获得cDNA;以cDNA为模板，用如下引物进行PCR扩增JYF:(￡<%RI)GAATTCATGTTACTTTCAGTGATCGTCAT(序列8)JYR:(淑I)GCGGCCGCTTAGTTGCTATAATATGTCCCAT(序列9)将PCR扩增产物进行测序鉴定，测序结果表明，PCR产物的序列如序列表中SEQIDNO.2所示。2、重组表达载体构建回收步骤1获得的PCR产物，连接PEASY-T3CloningVector,挑取克隆测序鉴定。将测序结果序列如序列表中SEQIDN0.2所示的阳性重组质粒记作pT3-J-galo将阳性重组质粒pT3-J-gal用EcoRI，Notl双酶切，回收约1.3kb的片段，以EcoRI、Notl双酶切原核表达载体pET-30a(+)并回收；基因片段与载体片段16'C过夜连接，得到重组表达载体pET-J-gal。热击转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布于含有100ugkan/mL的LB培养基平板上。挑取阳性克隆，用液体LB(Kan)培养基培养，提取质粒，进行测序鉴定，得到插入基因序列和结构正确的重组表达载体pET-J"-galo3、重组菌的构建大肠杆菌Rosetta购自北京全式金生物技术有限公司。将鉴定正确的重组表达质粒pET-J-gal及pET-30a(+)空载体分别转化大肠杆菌Rosetta，涂于含卡那霉素的LB(简称LB-kan)平板，37。C至长出单菌落。分别挑单菌落培养，提质粒酶切鉴定正确，得到阳性重组菌。将转入pET-J-gal的阳性重组菌记作R-pET-J-gal。将转入pET-30a(+)的重组菌记作R-pET-30a(+)。4、重组菌的发酵培养过夜。按l兔体积转接于100mlLB-kan液体培养基，摇床培养至OA。。为0.60.8。加入IPTG(终浓度O.2mmol/L)在25。C诱导培养，转速为200rpm，诱导培养1.5小时，得到100ml发酵液。5、蛋白的提取取步骤4中诱导培养后的100ml发酵液，离心收集菌体，按菌液Tris-HC1缓冲液(20Mra，pH8.0)=10:1的比例重悬菌体，超声波破碎细胞，破碎后离心收集上清液和菌体，得到10ml上清液。6、a-半乳糖苷酶r-J-GALC的Ni柱纯化及SDS-PAGE检测将步骤5得到的上清液用Ni柱亲合层析纯化。步骤如下1)取亲和层析树脂Ni-NTAAgarose1.5-2ml，加入已放好垫片的塑料管中，待树脂全部沉积到一起时，放入上层垫片，压紧，这样就灌好一个亲和层析柱，备用。2)将柱子垂直摆放在4"C冰箱中，加入水15-20ml。3)流尽后加入23ml0.lmol/L硫酸镍(第一次使用时可以不加)。4)流尽后加入1520mlNTA-O缓冲液平衡柱子。5)流尽后即可加入上清液，此时带有组氨酸标签的蛋白可以与树脂上的镍结合。6)上清液全部流尽后，仍用NTA-0缓冲液20ml清洗柱子。7)取IOmlNTA-200缓冲液冲洗柱子，洗脱液回收，得到10ml洗脱液。分别收集重组菌R-pET-30a(+)和重组菌R-pET-J-gal在诱导前和诱导后的菌体，用相应等体积的Tris-HC1缓冲液重悬，得到菌体悬浮液，用于SDS-PAGE检测；分别收集重组菌R-pET-J-gal菌体破碎后上清和沉淀，然后进行SDS-PAGE检测；收集重组菌R-pET-J-gal菌体破碎后上清用NTA-200洗脱的洗脱液，然后进行SDS-PAGE检测。取20uL洗脱液加入2X蛋白电泳缓冲液20uL混合，5min煮沸，SDS-PAGE检测；各取20u1上清液和菌体悬液做SDS-PAGE检测。实验设3次重复，结果如图2所示。表明，经诱导后有蛋白的诱导表达，纯化后得到单一条带，且分子量与预测的理论分子量一致。图2中，泳道1表示重组菌R-pET-30a(+)在诱导结束的菌体悬浮液，泳道2表示重组菌R-pET-J-gal在诱导前的菌体悬浮液，泳道3表示重组菌R-pET-J-gal在诱导后的菌体悬浮液，泳道4表示重组菌R-pET-J-gal菌液离心收集菌体后经缓冲液重悬破碎后的菌体，泳道5表示重组菌R-pET-J-gal菌液离心收集菌体后经缓冲液重悬破碎后的上清，泳道6表示重组菌R-pET-J-gal菌体破碎后上清经NTA200纯化洗脱液，泳道M表示Marker。将NTA200纯化洗脱液中的蛋白进行定量分析。实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，每毫升洗脱液中含有a-半乳糖苷酶132.42!ig，换算得到每毫升发酵液中含有活性a-半乳糖苷酶13.242wg。每毫升发酵液中活性a-半乳糖苷酶量=(132.42ug/ml洗脱液X10)/100ml发酵液43.242wg/ml发酵液。7、酶活的测定以对硝基酚-a-D-吡喃半乳糖(pNPG)为底物，经酶解后测定释放的对硝基酚(pNP)含量，获得a-半乳糖苷酶活力。a-半乳糖苷酶活性定义为l分钟内分解pNPG产生lymolpNP的酶量作为1个酶活单位(1U)。具体的检测方法如下PNPG溶于O.1M、pH值为9.0的(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液中，使其终浓度为20腿ol/L。将步骤6得到的10ml洗脱液用0.1M、pH值为9.0的(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液稀释100倍，作为酶活测定的酶液。将lmL酶液和lmL20mM的pNPG混合，摇匀；在温度为5(TC、pH值为9.0的条件下，温育15min后，加入2mL1M的Na2C(V溶液来终止反应。在nm处测其吸光值，以对硝基酚(pNP)的生成量表示酶活力。对照管以O.1M、pH为9.0的(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液代替酶液进行测定。甘氨酸-氢氧化钠缓冲液由终浓度为3.75g/L的甘氨酸和终浓度为1.28gg/L的NaOH组成；所述终浓度为各物质在缓冲液中的浓度。绘制酶活标准曲线，获得酶活计算公式每毫升洗脱液中酶活的计算公式如下酶活性(U/ml洗脱液)=(196.74X+0.5174)XN/(15X1000)x:405nm处光吸收值；15:反应15min;N:将洗脱液稀释成酶液的稀释倍数(即100)实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，每毫升洗脱液中含有0.4个单位的酶活。本发明发酵表达得到的蛋白具有a-半乳糖苷酶的活性。每毫升发酵液中酶活数量的计算公式如下(0.4U/ml洗脱液)X10ml洗脱液酶活(U/ml发酵液)=-100ral(发酵液总体积)计算得到，每毫升发酵液中含有0.04个单位的酶活，即0.04U/ml发酵液。由步骤6中的"每毫升洗脱液中含有a-半乳糖苷酶的克数"及步骤7中的"每毫升洗脱液中酶活数"换算(+[132.42yg/ml洗脱液])，得到本发明酶比活为3.02U/mg。二、酶学性质分析以下酶活测定中，都是将实验一中步骤6得到的用NTA-200洗脱的洗脱液稀释100倍后，得到的稀释液作为酶液进行测定的。用O.1M、pH值为9.0的(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液进行稀释的。a-半乳糖苷酶活性定义为l分钟内分解pNPG产生lyraolpNP的酶量作为l个酶活单位(1U)。1、酶的最适温度及温度稳定性1)最适温度在不同温度下测定酶活，方法如下pNPG溶于O.1M、pH值为9.0的(甘氨酸-氢氧化钠)缓冲液中，使其终浓度为20mmol/L。将lmL酶液和lmL20mM的pNPG混合，摇匀；在不同温度(37、42、45、50、55、60、65°C)、pH值为9.0的条件下，温育15rain后，加入2mL1M的Na2C03溶液来终止反应。在405nm处测其0D值，以对硝基酚(pNP)的生成量表示酶活力。将温度为50°C、PH值为9.0的条件下，测得的酶活为0.4U/ml洗脱液，记作100%，其余不同条件下的酶活均是其与"温度为5CTC、pH值为9.0的条件下"测得的酶活的相对值。实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，本发明酶在42-5(TC的温度范围内都具有高的酶活性，其中在5(TC时酶的活性最高(图3A)。2)温度稳定性温度稳定性检测将洗脱液在37°(3和5(TC下分别保持0.5min，lmin,2rain，4min，8min,10min,20min，30min,40min，55min,60min后，禾希0.4U/ml洗脱液，记作100%，其余各不同条件下测得的酶活均是与"未经保温的洗脱液在温度为5(TC、pH值为9.0的条件下测得酶活"的相对值。实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，洗脱液在37i:保温l小时，酶活仍保持在82.5%，在50'C保温2min，酶活保持在78%，在5(TC保温4rain，酶活保持在61%(图3B)。2、酶的最适pH值及pH值稳定性1)最适pH值在不同pH值下测定酶活，pH值是通过如下缓冲液调节的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH3.0);乙酸钠-乙酸缓冲液(pH4.0，pH5.0);磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(p服.O，pH7.0，pH8.0)和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0，pH10.0)。酶活测定方法如实验l中1)中所述，温度为5(TC，温育时间为15min。将温度为5(TC、pH值为9.0的条件下，测得的酶活为0.4U/ml洗脱液，记作100%，其余不同条件下的酶活均是与"温度为50'C、pH值为9.0条件测得的酶活"的相对值。实验设3次重复，结果取平均数。结果如图3C所示，表明ci-半乳糖苷酶的活性随pH的变化而变化。酶在pH9.0时表现最佳活性，在pH值为7.0的条件下仍具有55.6%的活性，在pH值为8.0的条件下具有66.6y。的活性。与现有的来源于丝状真菌的a-半乳糖苷酶相比，报道的酶大多最适pH值在4.0至8.0之间，本发明酶在碱性条件下酶活相对较高。2)pH值稳定性方法将洗脱液在不同的pH值条件下37'C温育l小时至冰上，然后在温度为50°C、pH值为9.0的条件下测定其酶活，温育时间为15min。不同的pH值条件为pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。将未处理洗脱液在温度为5(TC、pH值为9.0的条件下，测得的酶活为0.4U/ml洗脱液，记作100%，其余不同条件下的酶活均是其与"未处理洗脱液在温度为50°C、pH值为9.0的条件下测得的酶活"的相对值。实验设3次重复，结果取平均数。结果表明，本发明酶在pH值6.0-9.0之间具有较好的稳定性，在pH值为6.0的条件下保温l小时后，酶活为93.7%;在pH值为7.0的条件下保温1小时后，酶活为79%;在pH值为8.0的条件下保温1小时后，酶活为84.7%;在pH值为9.0的条件下保温l小时后，酶活为85.3y。(图3D)。<120>—种a-半乳糖苷酶及其编码基因<160〉9<210〉1<211>438〈212〉PRT<213>曲霉属焦曲霉(A5/ar^'"ys〃Wws)<400〉1MetLeuLeuSerVallieVallieSerSerLeuAlaAlaLeuAlaGly151015ArgAlaSerAlaLeuAspAlaGlyValGlyLysLeuProLysLeuGly202530TyrAsnThrPheAsnAlaPheGlyCysAsnTyrAspGluAspValVal354045LeuSerGinAlaLysAlaMetLysAlaLeuGlyLeuValAspLeuGly505560TyrLysSerPheLeuPheAspAspCysMetThrGluLysThrArgAsp65707580SerAsnGlyArgLeuValAlaAspAlaGluLysPheProHisGlyLeu859095LysGinLeuThrSerGinLeuLysSerLeuGlylieSerSerSerAla100105110TyrSerAspAlaGlyHisTrpThrCysAlaGlyTyrProGlySerTyr115120125GlyHisGluAlaGinAspLeuGluSerTrpGluAsnTrpGlyPheAsp130135140TyrLeuLysTyrAspAsnCysPhelieProPheAspAsnValThrGin145150155160GluAsnValTyrGlyArgTyrLysArgMetAlaAspAlalieAlaAsp165170175ArgAlaAlaArgLysProHisSerLysSerPheGinPheSerLeuCysTrp195200SerTrpArgValAsnGlyAsplie210215SerlielieAsnThrAlaSerPhe225230GlyArgAsnAspPheAsplieLeu245GluProHisGlyAsnMetThrTyr260ThrTrpAlaLeuLeuLysSerPro275280AsnlieThrArgGinSerLeuGlu290295ArglieAsnGinAspProHisVal305310TrpGlylieAsnProAspTyrThr325TyrTrpThrGlyAsnSerSerTyr340ThrLeuAspThrProGinSerMet355360AlalieArgAlaGlyArgLeuTyr370375ThrHisAsnGlyThrAlaTyrArg385390HisGlyValAlaAlaLeuLeuLeu405GlyLeuGluProTyrCysAlaGly420GlyThrTyrTyrSerAsn435<210〉2<211〉1314<212〉DNA185190lieTrpAlaArgGinLeuGlyGin205LysProTrpTrpSerSerlieAla220lieSerSerAlaThrAspPheTyr235240GluValGlyAsnTyrGlyGinGly250255AspGluGluLysSerHisPheThr265270LeuLeulieSerAlaAsnLeuAla285lieLeuSerAsnLysAspLeuLeu300GlyAlaSerlieSerProPheArg315320PheAsnGluThrHisProAlaGin330335GlyValValPheMetLeuLeuAsn345350ThrPheAsnLeuThrGluSerTrp365AspValTyrAspMetTrpSerHis380AsnlieThrValAspLeuProPro395400AsnAspAlaGlyProGluGinGly410415TrpTrpGinCysSerTyrProAsn425430〈213〉曲霉属焦曲霉(As/ei^7'77〃swsz^s)<400>2atgttactttcagtgatcgtcattagtagtcttgctgcccttgctggccgtgcatcggcg60ctcgatgccggtgtcggcaagcttccaeiELgcttggatacaatacgttcaatgccttcgga120tgcaattacgacgaggatgtcgtgctttcccaeigccaaggcsatgasggctxtcggtctc180gtcgacctagggtataagtcgtttctgttcgatgattgcatga_ctg3g33aacccgcgat240tcaaacggccgattsgtsgccgacgccgagaagttccctcatggactgaaacaacttacc300tcacaactcaagtcacttgggatatcgtccagcgcatactccgatgccggcc3ttggax;8360tgtgctgggtatcccggatcatacggccacga^gcgc犯gacctagagtcctggg卿at420tgggggttcgactacctcaagt3Cg3t33Ctgcttcatccccttcgacaacgtcacccag480gagaatgtctatggacgataceiagaggatggcggatgctatagccgatcgcgctgcgaga540aaacctcactccaagtcgttccagttctccctgtgcgagtgggggtggcaacagccctgg600atctgggcgcgccagttgggcc卿gctggcgcgtcaacggcgacattaagccgtggtgg660agttctattgcgsgta_tcatcaacacggca_tcgtttatttcctctgctacggacttttac720ggtcgcaatgactttgatatcctggaggttgggaactacgggcagggcgagccacatggg780朋C3tg3Cttacg3cg3ggaaaagagccactttacgacttgggcactgct3朋gtCgCCg840ttgcttatcagcgccaatctggccasceitc3cccga_C3gaigtcttgagattctttccaac900a_aggatctcctccgcatta_aCC肌g3CCCCcacgtcggagccagca_ttagtxccttccgc960tggggcatcaa_cccggact3taccttcaacga犯ctcatcccgcccagtactggaccggc1020aactcgagttatggtgtggtattcatgctcctgaatacgctcgacacaccccaatccatg1080accttcaatctcacggagagctgggccatccgcgctgggag3C"tgt3Cg3tgtctacgac1140atgtggagccaca_cgca_caa_tgggacggcatatcggaacBttacggttgatttaccgccg1200catggagtcgcggcgctccttctgaatgatgcaggaccag3gC3gggtggcctggagccg1260tactgtgccgggtggtggcagtgttcgtatCCg组gggELcatattatagcaac1314<210>3<211>2832〈212〉DNA〈213〉曲霉属焦曲霉(Aspe2^i77wsf/"ws)<400〉3tacsggtgstCCCCC3tCtttC3tCt33t3cccaattgggagtcaaaatagcttggtccgtctccacggtatgatccccgC3tt3333ttgctgcccttgggatacaatagttcaatgccgaaggctctcggtgctgcacgtacggcacsatactgtctcaccggggtcgaccacggggcgggtctggct3tgstcgacsggatggggcsctggccgtgcgtaggttgggttcggatgcaggtctcgtcgccccccaagtcsgcggggacccgagatgcacccgcagctttgcaaatgccgaggcggcttaaaatcgccgC3C33CC3tgatcggcgctcttggctgcctattacgscgaacctagggtaccctcattcattccgtgtctttggacgcagtcccgcgtggtgtcgctcgagggcctccaa3t3tCCC33tatgtcaggaattactttcaggatgccggtgcaaagttcgtggatgtcgtgtaagtcgttt33C3tttC3ttc3gsggct3gggatctctcgctaagcatttactaggttctgggsaacggtataaggcgctgatcgtcattcggcaagctgttctgatttctttcccasgctgttcgatgtC3tC3C33tgtaatcccagcscggtatatsgstctcatcggcgcactcggtgtgggggtagggcaccgaaccgggcccttagtagtctttccaaagcttgtttcatagcccaaggcaat3ttgc3tgac60120180240300360420彻540600660720780tgagtacgtacttttattgagacagacttcattatgctactctgttaatactatcctcgcaggasaacccgcgsttcaaacggccgattagtagccgscgccgagasgttccctcatggactgasacascttacctcacaactcaagtcacttgggatatcgtccagcgcatactccgatgccggccattggacatgtgctgggtatcccggatcatacggccacgaagcgcaagscctagagtcctgggagaattgggggttcgactacctcaagtscgataactgcttcatccccttcgacaacgtcacccaggagastgtctatggacgettacsagaggatggcggatgctettsgccgatcgcgctgcgagaaaacctcactccaagtcgttccagttctccctgtgcgagtgggggtggcaacsgccctggatctgggcgcgccagttgggccagagctggcgcgtcaacggcgacattaagccgtggtggagttctattgcgagtatcatcaacacggcatcgtttatttcctctgctacggacttttacggtcgcaatgactttgatatcctggaggttgggaactacgggcagggcgagccscatgggaacatgacttacgacgaggaaaagagccactttacgacttgggcactgctasagtcgccgtt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