专利名称：用于降解黄曲霉毒素b1的粘球菌菌株及其活性蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及粘球菌，特别是，涉及一种用于降解黄曲霉毒素B1 的粘球菌菌株及其活性蛋白。
背景技术：
自从1960年黄曲霉毒素被发现以来，科学工作者便不断地研究该 类毒素的预防和去毒方法。目前对黄曲霉毒素解毒方法的研究大部分 集中在化学处理法，和物理脱毒法等。传统的理化方法去毒都存在一 些问题，如导致甸料中的营养损失，影响饲料的感官品质，有些方法 所需要的设备价格昂贵等等，从而限制了实际生产中的应用。利用微生物脱毒的报道，多集中在近十年。国内研究不多，只有 刘大岭发现一种真菌代谢产物具有降解毒素的作用。国外的研究报道 比较多的集中在乳酸菌，双歧杆菌，酵母菌和白腐真菌等，还有橙色 黄杆菌，红球菌，假密环菌，根霉菌等的报道。对于乳酸菌，双歧杆 菌和酵母菌的研究表明，大部分去除毒素的效率在50%以下，而且最 关键的是这种去除机制是可逆的结合，而不是对毒素的降解。其他一 些细菌和真菌的解毒研究表明，大部分菌的降解效率不高，降解效率 受作用时间，溶液pH值，菌体数量，毒素浓度，金属离子浓度等 影响，还没有发现一种微生物能完全的不可逆的降解饲料中的黄曲霉 毒素。至今为止，还没有关于粘细菌及其代谢产物降解黄曲霉毒素的 报道。发明内容本发明的目的是提供一种粘球菌菌株及其活性蛋白，以解决现有 技术中存在的上述问题。本发明提供一种能产生降解黄曲霉毒素B1的活性蛋白的粘球菌菌株M^:ococcw/"/v附ANSM068 CGMCC No. 3194。本发明还提供一种制备能降解黄曲霉毒素Bl的活性蛋白的方 法，包括利用上述粘球菌菌株，进行摇瓶发酵，用溶剂提取发酵液中 的活性蛋白。所述摇瓶发酵的培养基包括下述组分酵母粉5-10g, CaCl2'2H20 0.5-1.5g， VB12 0.3-lmg,蒸馏水800-1200 mL; pH值为7.0-8.0。优选 地，包括酵母粉7g, CaCl2'2H20 1 g, VB120.75 mg,蒸馏水1000mL, pH值为7.5。所述摇瓶发酵的条件为发酵温度为20-35'C，发酵时间30-60h， pH值7.0-8.0，转速100-200r/min。优选地，所述发酵温度30。C，发酵 时间50h, pH值7.5，转速160r/min。摇瓶发酵结東后，过滤掉发酵液中的菌体得上清液，用冰预冷的 体积比为95%的乙醇溶液沉淀提取活性蛋白，沉淀时间可为30min。本发明还提供一种从粘球菌菌株Mjaoc0ccw /w/v^ ANSM068 CGMCC No. 3194中制备得到的能降解黄曲霉毒素B 1的活性蛋白(又 称解毒酶)。本发明进一步提供降解黄曲霉毒素B1的方法，包括下述步骤取 粘球菌菌株M^wcocc^y^vw ANSM068 CGMCC No. 3194中得到的 发酵液或活性蛋白，加入黄曲霉毒素B1溶液，将反应体系调整至pH 值为5.0-9.0,在20-40 °C反应48-72h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素。优选地，将反应体系调整至pH值7.5,在3(TC反应72h后即可去除 溶液中的黄曲霉毒素。上述菌株是以特异性方法筛选得到的橙色粘球菌ANSM068,已 于2009年7月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其简称 为CGMCC，保藏编号为CGMCCNo. 3194。粘球菌菌株ANSM068具有下述性质l)形态特征营养细胞呈杆状、两端尖、细胞略屈；粘孢子球形、有折射性、直径1.5微米；子实体为橙色球形孢囊、下端收缩、 并有一根明显的柄、不分支；菌落橙色、滑动生长、成薄的扩展菌落 群。2)理化特性表1试验项目试验结果试验项目试验结果刚果红吸附试验+淀粉水解+酵母菌消化试验+氧化酶-水解纤维素-接触酶+水解酪素+本发明粘球菌菌株得到的活性蛋白及其解毒方法具有以下有益 效果1) 该活性蛋白添加在饲料中，能够降低黄曲霉毒素对小鼠的毒 性，提高小鼠血清中蛋白含量及免疫能力，部分消除毒素其对免疫功能、抗氧化能力等的不良影响；2) 生物酶法降解黄曲霉毒素效率高，特异性强，对铜料和环境 没有污染，有效地解决了传统去毒方法存在的问题。3) 本发明方法解毒活性高，作用专一，作用效果温和，不会破 坏铜料中的营养成分，适用于在饲料工业中黄曲霉毒素的去除。
图l对照组黄曲霉毒素B1图谱；图2蛋白酶处理组黄曲霉毒素B1图谱。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 黄曲霉毒素B1为巿购，购于Sigma公司；PBS (0.01mol/L)的制备过程称取8g NaCl、 0.2g KC1、 1.44g Na2HPO4和0.24gKH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调节溶液的pH值至7.5，最后加蒸馏水定容至1L即可。 实施例1本发明活性蛋白的制备利用粘球菌菌株il^xococcws /w/v附 ANSM068 CGMCC No. 3194，摇瓶发酵做种子液，其发酵温度为30 。C， pH值7.5，转速160r/min，发酵时间50h。其中摇瓶发酵培养基包括下述组分酵母粉7g， CaCl2*2H20 lg, VB12 0.75mg,蒸馏水1000ml; pH值为7.5。将种子液以20% (占总发酵培养基体积)的接种量接种到10L发 酵罐中，其发酵温度为30。C， pH值7.5，溶氧量60%，转速200r/min, 发酵时间30h，发酵培养基的组成同上述摇瓶发酵培养基。发酵结束后，用8层纱布过滤除去菌体，得到的上清液用3倍体积 冰预冷的乙醇(体积比为95% )溶剂沉淀，冷冻离心(转速4000r/min， 离心15min)，得到粗酶液，溶于冰预冷的0.01mol/LPBS缓冲液中，冻 干浓缩得到活性蛋白。 实施例2本发明活性蛋白的制备利用粘球菌菌株M^cococc^ /w/v附 ANSM068 CGMCC No. 3194，摇瓶发酵做种子液，其发酵温度为25 。C,发酵时间60h， pH值7.0，转速100r/min;其中摇瓶发酵培养基包括下述组分酵母粉5g, CaCl2'2H20 1.5， VB12 0.3mg，蒸馏水1000ml; pH值为7.0。将种子液以20% (占总发酵培养基体积)的接种量接种到10L发 酵罐中，其发酵温度为35。C, pH值8.0，溶氧量60%,转速200r/min， 发酵时间30h，发酵培养基的组成同上述摇瓶发酵培养基。发酵结束后，用8层纱布过滤除去菌体，得到的上清液用3倍体积 冰预冷的乙醇(体积比为95% )溶剂沉淀，冷冻离心(转速4000r/min， 离心20min)，得到粗酶液，溶于冰预冷的0.01mol/LPBS缓冲液中，冻 干浓縮得到活性蛋白。实施例3本发明活性蛋白的制备利用粘球菌菌株M少jwcoccm >/vw ANSM068 CGMCC No. 3194，摇瓶发酵做种子液，其发酵温度为35 °C， pH8.0值，转速200r/min，发酵时间30h。其中摇瓶发酵培养基包括下述组分酵母粉10g, CaCl2'2H20 0.5g， VB12 l.Omg，蒸馏水1000ml; pH值为7.0。将种子液以20% (占总发酵培养基体积)的接种量接种到10L发 酵罐中，其发酵温度为20。C, pH值7.0,溶氧量60%,转速100r/min， 发酵时间60h，发酵培养基的组成同上述摇瓶发酵培养基。发酵结束后，用8层纱布过滤除去菌体，得到的上清液用3倍体积 冰预冷的乙醇(体积比为95% )溶剂沉淀，冷冻离心(转速4000r/min， 离心15min)，得到粗酶液，溶于冰预冷的0.01mol/LPBS缓冲液中，冻 干浓缩得到活性蛋白。 实施例4本发明活性蛋白的制备利用粘球菌菌株Mjxococc船/w/vw ANSM068 CGMCC No. 3194，摇瓶发酵做种子液，其发酵温度为30 。C， pH值7.5,转速160r/min,发酵时间50h。其中摇瓶发酵培养基包括下述组分酵母粉7g， CaCl2'2H20 lg, VB12 0.75mg,蒸馏水1000ml; pH值为7.5。将种子液以20% (占总发酵培养基体积)的接种量接种到10L发 酵罐中，其发酵温度为30。C， pH值7.5，溶氧量60%，转速200r/min, 发酵时间30h，发酵培养基的组成同上述摇瓶发酵培养基。发酵结束后，用8层纱布过滤除去菌体，得到的上清液用3倍体积 冰预冷的乙醇(体积比为95%)溶剂沉淀，冷冻离心(转速4000r/min， 离心15min),得到粗酶液。 实施例5利用实施例1得到的活性蛋白降解黄曲霉毒素B 1:将冻干浓缩的蛋白酶称取0.01g,溶于lml PBS (0.01mol/L)缓冲液，吸取800ul与 200ul黄曲霉毒素Bl (500ppb)反应；对照组为800ul PBS缓冲液中加 入200ul黄曲霉毒素Bl (500ppb);各处理在30。C反应72h后，用高效 液相色谱柱后衍生测黄曲霉毒素B1的浓度。进样前，对样品进行前处 理，首先将各样品离心5min,再用0.22um滤膜进行过滤，上机。上机 检测条件流动相为甲醇水=1: 1，流速lml/min,激发波长350nm, 发射波长440nm,上样量10ul，黄曲霉毒素的出峰时间为9.56s左右。 检测结果与对照组相比蛋白酶处理组黄曲霉毒素B1的降解率为 83.5%，图1为对照组黄曲霉毒素B1的检测图谱，图2为蛋白酶处理组 黄曲霉毒素B1的检测图谱。 实施例6
利用实施例2得到的活性蛋白降解黄曲霉毒素B1:将冻干浓缩的 蛋白酶称取0.01g,溶于lml PBS (0.01mol/L)缓冲液，吸取800ul与 200ul黄曲霉毒素Bl (500ppb)反应；对照组为800ul PBS缓冲液中加 入200ul黄曲霉毒素Bl (500ppb);各处理在35。C反应48h后,用高效 液相色谱柱后衍生测黄曲霉毒素B1的浓度。进样前，对样品进行前处 理，首先将各样品离心5min,再用0.22um滤膜进行过滤，上机。上机 检测条件流动相为甲醇水=1: 1，流速lml/min，激发波长350nm， 发射波长440nm,上样量10ul，黄曲霉毒素的出峰时间为9.56s左右。 检测结果与对照组相比蛋白酶处理组黄曲霉毒素B1的降解率为 81.5%。 实施例7
利用实施例3得到的活性蛋白降解黄曲霉毒素B 1:将冻千浓缩的 蛋白酶称取0.01g,溶于lml PBS (0.01mol/L)缓冲液，吸取800ul与 200ul黄曲霉毒素Bl ( 500ppb)反应；对照组为800ulPBS缓冲液中加 入200ul黄曲霉毒素Bl ( 500ppb);各处理在3(TC反应56h后，用高效 液相色谱柱后衍生测黄曲霉毒素B1的浓度。进样前，对样品进行前处理，首先将各样品离心5min，再用0.22um滤膜进行过滤，上机。上机 检测条件流动相为甲醇水=1: 1，流速lml/min，激发波长350nm, 发射波长440nm，上样量10ul，黄曲霉毒素的出峰时间为9.56s左右。 检测结果与对照组相比蛋白酶处理组黄曲霉毒素B1的降解率为 82.0%。 实施例8
利用实施例4得到的粗酶液降解黄曲霉毒素B1:将冻干浓缩的粗 酶液称取0.01g，溶于lmlPBS(0.01mol/L)缓冲液，吸取800ul与200ul 黄曲霉毒素B 1 ( 500ppb )反应；对照组为800ul PBS缓冲液中加入200ul 黄曲霉毒素B1 ( 500ppb);各处理在3(TC反应72h后，用高效液相色谱 柱后衍生测黄曲霉毒素B1的浓度。进样前，对样品进行前处理，首先 将各样品离心5min,再用0.22um滤膜进行过滤，上机。上机检测条件 流动相为甲醇水=1: 1，流速lml/min,激发波长350nm，发射波长 440nm，上样量10ul，黄曲霉毒素的出峰时间为9.56s左右。检测结果 与对照组相比粗酶液处理组黄曲霉毒素B 1的降解率为79.5%。
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权利要求
1、一种能产生降解黄曲霉毒素B1的活性蛋白的粘球菌菌株Myxococcus fulvus ANSM068CGMCC No.3194。
2、 一种制备能降解黄曲霉毒素B1的活性蛋白的方法，其特征在 于，利用权利要求l所述粘球菌菌株，进行摇瓶发酵，用溶剂提取发 酵液中的活性蛋白。
3、 如权利要求2所述的活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述 摇瓶发酵的培养基包括下述组分酵母粉5-10g， CaCl2'2H2O0.5-1.5g， VB12 0.3-lmg，蒸馏水800-1200mL; pH值为7.0-8.0。
4、 如权利要求2所述的活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述 摇瓶发酵的条件为发酵温度为20-35。C,发酵时间30-60h, pH值 7.0-8.0，转速100-200r/min。
5、 如权利要求2所述的活性蛋白的制备方法，其特征在于，摇瓶 发酵结東后，过滤掉发酵液中的菌体得上清液，用冰预冷的体积比为 95%的乙醇溶液沉淀提取活性蛋白。
6、 一种从粘球菌菌株M;;;cococcuy/w/vw ANSM068 CGMCC No. 3194中制备得到的能降解黄曲霉毒素B1的活性蛋白。
7、 一种降解黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，包括下述步骤: 取权利要求1所述菌株的发酵液或权利要求6所述的活性蛋白，加入黄 曲霉毒素B1溶液，将反应体系调整至pH值为5.0-9.0,在20-4(TC反应 48-72h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素。
8、 如权利要求7所述的降解黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于， 将反应体系调整至pH值7.5,在30'C反应72h后即可去除溶液中的黄曲 霉毒素。
全文摘要
本发明涉及一种用于降解黄曲霉毒素B1的粘细菌菌株及其活性蛋白，该活性蛋白由粘球菌菌株Myxococcus fulvus ANSM068 CGMCCNo.3194产生。其降解黄曲霉毒素B1的方法，包括下述步骤取上述得到的活性蛋白，加入黄曲霉毒素B1溶液，将反应体系调整至pH5.0-9.0，在20-40℃反应48-72h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素。本发明得到的活性蛋白解毒活性高，作用专一，作用效果温和，不会破坏饲料中的营养成分，适用于在饲料工业中黄曲霉毒素的去除。
文档编号C12N1/20GK101659929SQ200910092920
公开日2010年3月3日 申请日期2009年9月11日 优先权日2009年9月11日
发明者舒 关, 牛天贵, 成 计, 赵丽红, 马秋刚 申请人:中国农业大学