嗜热球菌属某种(菌株9°n-7)dna连接酶的发现、克隆和纯化的制作方法

专利名称：：嗜热球菌属某种(菌株9°n-7)dna连接酶的发现、克隆和纯化的制作方法嗜热球菌属某种(菌株9°N-7)DNA连接酶的发现、克隆和纯化
背景技术：
：嗜热球菌属(777wmococcM力是古细菌门(^r/2aea)的一个属。这些古老的生物在包括高温的极端条件下的多种环境中生长。在实验室中培养这些生物的能力是非常有限的，以致关于它们的生物化学或它们的代谢鲜为人知。连接酶是在双链体DNA中的单链切口位点上催化磷酸二酯键形成的酶。连接酶也催化双链体DNA的共价键，一般是平末端对平末端，或者一个粘末端对另一个粘末端。连接酶已经从多种细菌中克隆，包括一种热稳定连接酶——水生栖热菌(777^mz^a^fl"cw力(％《连接酶)。该连接酶已在美国专利第6,054,564号中描述。仅一些嗜热球菌已被分离，关于它们可能含有的连接酶的特性或者编码这类蛋白的基因知之甚少(参见，例如Nakatani等，BacfenWogy182:6424-6433(2000))。从不同属的古细菌——热球菌属(p,ococcw)——得到的连接酶例如在美国专利第5，506，137和5,700,672号以及在Keppetipola等J!5acfen'o/ogy187:6902-6908(2005)中已被描述。连接酶已被用于分子生物学的许多技术中，包括DNA扩增、测序和单核苷酸多态性的检测。寻找在高温下稳定并且具有快速动力学和严格特异性的改善的连接酶一直是所需求的。发明概述在本发明的一实施方式中，提供了具有DNA连接酶活性的基本上纯的重组蛋白质，其中该蛋白质与SEQIDNO:13具有至少91%的氨基酸序列同一性。在本发明的进一步实施方式中，提供具有DNA连接酶活性的基本上纯的蛋白质，其中DNA连接酶用选自下列的DNA序列编码(a)与SEQIDNO:2基本上相同的序列；(b)与SEQIDNO:2基本上互补的序列；(c)在严格条件下，与SEQIDNO:2基本上杂交的序列；和(d)编码SEQIDNO:13的序列。在上述实施方式中指出的蛋白质的进一步的特征在于在大约10(TC的温度下温育30分钟后，连接酶保留了至少25%的连接酶活性。而且，该连接酶可能的进一步特征在于在连接过程中其使用ATP作为辅因子，然而就这一目的而言，NAD+没有提供可检测的效用。在进一步的实施方式中，提供了编码DNA连接酶的DNA，该DNA具有选自下列的序列(a)与SEQIDNO:2基本上相同的序列；(b)与SEQIDNO:2基本上互补的序列；(c)在严格条件下，与SEQIDNO:2基本上杂交的序列；禾卩(d)编码SEQIDNO:13的序列。在进一步的实施方式中，描述了含有上述DNA的载体。另外，提供了能从载体表达连接酶的宿主细胞。在进一步的实施方式中，提供了连接磷酸二酯键的方法，该方法包括选择上述类型的DNA连接酶；将连接酶与DNA混合，所述DNA在该DNA的至少一条链上含有切口；并且在所述切口连接所述磷酸二酯键。在该方法的一实例中，DNA连接酶是从古细菌分离物，具体为嗜热球菌属某种(7/^mococc船平)(菌株9。N-7)得到的热稳定连接酶。附图简述图la-l至la-5示出9。N-7DNA连接酶变体(SEQIDNOS:l-7)的DNA序列比对。图lb-l至lb-2示出嗜热球菌属某种(菌株9°N-7)DNA连接酶变体(SEQIDNOS:8-15)的蛋白质比对。图2示出插入到litmus28i内的嗜热球菌属某种(菌株9°N-7)DNA连接酶基因的质粒图。图3示出插入到pMalC2x内的嗜热球菌属某种(菌株9。N-7)DNA连接酶基因的质粒图。图4示出嗜热球菌属某种(菌株9。N-7)(SEQIDNO:15)和喜烟嗜热球菌(772^7wococcw/i/脂'co/a"力(SEQIDNO:16)、克达卡拉嗜热球菌(7Tzermococciw^^zferae"w;s)(SEQIDNO:17)、深海热球菌(尸yracoccwsa肌〕(SEQIDNO:18)禾卩激烈热球菌(pyracocc附/mh'om力(SEQIDNO:19)的蛋白质比对。图5示出磷酸纤维素柱组份(phosphocellulosecolumnfraction)的SDSPAGE。泳道如下标记FT(柱流通)指组份编号23-34;MW指分子量标准。箭头指出凝胶上与DNA连接酶相应的带的位置。图6示出9°N-7DNA连接酶的热稳定性。30pl、pH7.5的10mMTrisHCl、2.5mMMgCl2、2.5mMDTT、300ATP和0.1%TritonX-100——其含有3(il以1:100稀释的纯9°N-7DNA连接酶，在pH7.5的10mMTrisHCl、2.5mMMgCl2,、2.5mMDTT、300ATP和0.1%TritonX-100进一步连续三倍稀释。四组相同的稀释液在4°C、80°C、90。C或IO(TC下温育30分钟。为了终止反应，将样品置于冰上并且将等体积的pH7.5的10mMTrisHC1、2.5mMMgCl2，、2.5mMDTT、300|uMATP、0.1%TritonX-100和50|ng/mlBstEIIXDNA加入到每支管中。然后在45。C下温育反应物15分钟，在此之后将0.15体积的50%的甘油、lOOmMEDTA和溴酚兰加入到每支管中。然后在75'C下温育反应物5分钟，并且在1%琼脂糖TBE凝胶上进行电泳。图A示出在冰上温育30分钟的结果。图B示出在8(TC下温育30分钟的结果。图C示出在9(TC下温育30分钟的结果。图D示出在10(TC下温育30分钟的结果。对于每一个图，泳道如下指定泳道1表示没有进一步稀释；泳道2以1:3稀释；泳道3以1:9稀释；泳道4以1:27稀释；和泳道5以1:81稀释。图7示出的凝胶中，9°N-7聚合酶与r"《聚合酶在含有大肠杆菌(E.co")聚合酶和大肠杆菌内切酶IV(EndoIV)的修复混合物中比较。该修复混合物与脱嘌呤的DNA—起温育，并且进行扩增。泳道1是对照。泳道2是在没有修复混合物下的DNA;泳道3和4是DNA和含有480单位T"《连接酶的修复混合物的复制样品；和泳道5和6是DNA和含有500单位9°N-7连接酶的修复混合物的复制样品。实施方式详述这里使用的术语"热稳定连接酶(thermostableligase)"指催化DNA连接和在IO(TC下、30分钟后保持其至少25%活性的酶。在极端温度下的热稳定性是将嗜热球菌属连接酶(古细菌)和嗜热菌属(77^扁"连接酶(细菌)区分开的特征。嗜热球菌属某种(菌株9。N-"是从水热喷口(hydrothermalvent)分离的嗜热球菌的一个种(Southworth等/WAS93:5281(1996))。嗜热球菌属某种(菌株9°N-7)DNA连接酶的两个已知的最接近的亲属(relative)是喜烟嗜热球菌连接酶和克达卡拉嗜热球菌连接酶(JP2000308494-A/1),其在氨基酸水平分别具有88%和90%的同一性。这两个连接酶都被报道利用NAD+或ATP作为辅因子，从而构成一组新类型连接酶。喜烟嗜热球菌连接酶被Nakatani等(J.Bacteriology182:6424-6433(2000))报道利用NAD+或ATP同样好，并且克达卡拉嗜热球菌连接酶在利用NAD+代替ATP时具有减低水平的活性，然而嗜热球菌属某种(菌株9。N-7)利用NAD+时没有可检测的活性(实施例2)。术语"基本上相同"和"基本上互补"拟指DNA或氨基酸序列与鉴定的序列很大的相同性或同一性，或者与互补序列很大的相同性或同一性。该术语拟包括在氨基酸或DNA序列中含有与在图中规定的最小差异的序列。这种差异可由不明显干扰蛋白质连接功能的诱变事件引起。在本发明的一实施方式中，在下列条件下进行严格杂交a)杂交0.75MNaCl、0.15TrisHC1、10mMEDTA、0.1%NaCl、0.1%SLS、0.03%BSA、0.03%Ficoil400、0.03%PVP和100jig/ml煮沸的小牛胸腺DNA，在5(TC下大约12小时，禾口；b)用O.IXSET、0.1%SDS、0.1%NaCl和0.1M磷酸盐缓冲液，在45。C下洗涤3次共30分钟，并在DNA印迹(SouthemBlot)上检测双链杂交的DNA的存在。本文引用的所有参考文献以及2005年9月15号提交的美国临时专利申请第60/717,296号被引入作为参考。实施例实施例I:使用简并引物克隆嗜热球菌属某种(菌株9°N-7)DNA连接酶基因首先通过PCR从嗜热球菌属某种(菌株9。N-7)的基因组DNA扩增基因。从Nakatani等J.Bact.182(22):6424-6433(2000)(克达卡拉嗜热球菌)和Rolland等FEMSMicrobiologyLett.236(2):267-273(2004)(喜烟嗜热球菌)的参考文献获得正向引物序列。具有指定简并性的共有序列设计如下正向引物5'CGGTGGTGCATATGRGCGAYATGMRSTACTC(SEQIDNO:20)反向引物5'ATAAACTCTAGATTACYTCTTCGCCTTGAACCTCTCCTGG(SEQIDNO:21)使用嗜热球菌属某种(菌株9。N-7)的引物从嗜热球菌属某种(菌株9。N-7)的基因组DNA扩增DNA连接酶的基因。用来克隆基因的PCR反应条件如下100|il反应混合物——含有pH8.8的20mMTris-HCL、10mMKC1、10mM(NH4)2S04和4mMMgSO4、0.1%TritonX陽100、200的每种dNTP、50ng嗜热球菌属某种(菌株9。N-7)的基因组DNA、正向和反向引物每种500ng、2.5单位的ragDNA聚合酶和0.02单位的VentDNA聚合酶，被加热到94。Cl分钟，然后在45'C1分钟，并且然后在72'C3分钟。重复30次该温度循环。在完成循环后，将反应温度降低至室温，并且加入5单位大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，并在室温下进一步温育5分钟。然后，将反应物调整为70mMEDTA。PCR产物用苯酚提取、用醇沉淀，并在CL6B琼脂糖自旋柱(sepharosespincolumn)上对其脱盐。将1700bpPCR产物克隆到大肠杆菌中。EcoRV-切割的litmus28i被用作克隆DNA片段的载体。T4DNA连接酶缓冲液中的10pl连接反应物包含80ng插入片段、80nglitmus载体和400单位T4DNA连接酶(NewEnglandBiolabs，Inc.,Ipswich,MA)。连接反应在16。C温育过夜，经电穿孔进入大肠杆菌TBI细胞，并在IPTGXGAL平板上铺板。挑选白色的菌落。9个白色菌落中的一个具有1700bp插入片段。独立的电穿孔产生具有1700bp插入片段的另一个克隆。对这两个克隆中的插入片段进行测序。从这些克隆的序列，新的具有较少简并性的正向引物设计如下9。N正向引物5'cggtggtgcatatgggcgayatgaggtactccgagctgg(SEQIDNO:22)(2)使用比在实施例(l)中的引物具有较少简并性的第二正向引物克隆嗜热球菌属某种(菌株9。N-7)的连接酶使用9°N-7正向引物实施另外4个独立的PCR反应，其仅包含一个简并碱基代替了上述(l)中的正向引物——其含有5个简并碱基。100^1含有50ng嗜热球菌属某种(菌株9。N-"基因组DNA、正向和反向引物每种500ng、200pM的每种dNTP和1|alPhusionDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,Inc,Ipswich，MA)的PhusionHF缓冲液(NewEnglandBiolabs,Inc，Ipswich,MA)被加热到98。C持续30秒，然后作25个下列过程的循环98°C10秒，然后70。C30秒，接下来72°C1分钟。然后在72。C温育反应物5分钟。每一PCR反应的产物作为初始PCR反应物处理，并被克隆到litmus28i中，如上所述。通过小量制备DNA，从PCR反应得到的两个独立克隆(A1和A3)被证实含有1700碱基对插入片段，以及从其它三个PCR反应(B2、C3、D3)的每一个得到的一个克隆同样被证实含有1700碱基对插入片段。然后培养这些克隆，并将它们的粗提物在SDSPAGE上电泳。每一克隆表达60kd的蛋白质。从克隆Al、A3、B2、C3、D3得到的质粒和另外的lig7和lig8被纯化，并且对插入片段测序。在图la-l到la-5中提供了DNA序列(SEQIDN0S:l-7)。尽管不希望被理论所限制，但是在序列中观察到的小差异可由嗜热球菌属某种(菌株9。N-7)细胞群内的克隆变异解释。序列变异是所有第三位置变化，或者保守氨基酸变化。克隆B2是连接酶共有序列的代表。DNA连接酶首次在紧密控制的表达载体中表达(图2)。(3)在大肠杆菌中表达连接酶基因(B2)通过用NdeI和XbaI切割，从litmus载体上剪切B2片段。从琼脂糖凝胶上切下1700bp片段，并且用琼脂糖酶消化凝胶切片以释放所述片段。通过用Ndel禾BXbal切割制备表达载体pMalC2X(NewEnglandBiolabs,Inc.，Ipswich，MA)，并且使其去磷酸化。在10^1含有400ng插入片段和100ngT4DNA连接酶缓冲液中的载体以及200单位T4DNA连接酶的反应物中，在16°〇温育16小时，将切割的1700bp碱基对PCR片段连接到pMalC2X载体。将连接反应物电穿孔入大肠杆菌TB1细胞，并且携带1700bp片段的克隆被分离并且命名为嗜热球菌属某种(菌株9。N-7)B2-1(图3)。在LB培养基中生长克隆，并且用IPTG进行诱导。诱导的细胞的样品被裂解，并且在SDSPAGE凝胶上电泳，以显示出与约60kd大小的蛋白质相应的带。对从DNA序列得到的蛋白质序列的分析表明基因编码带有26个罕用精氨酸密码子的蛋白质。因此，含有用于精氨酸的罕用tRNA的宿主细胞(大肠杆菌BL-2(DE3)RIL)(Stratagene，LaJoIIa,CA)被用来获得更高水平的表达。在嗜热球菌属某种(菌株9°N-7)诱导后，宿主样品中的B2-1质粒通过SDSPAGE进行分析，并且观察到明显的60kd带。(4)嗜热球菌属某种(菌株9。N-7)连接酶与其它热稳定DNA连接酶的比较通过CLUSTAL多序列比对，将嗜热球菌属某种(菌株9°N-7)DNA连接酶氨基酸序列与其它4种嗜热DNA连接酶进行比较。CLUSTALW(1.82)多序列比对(MultipleSequenceAlignments)序列形式为Pearson。序列1:9。N-7-B2(SEQIDNO:15)564aa序列2:克达卡拉嗜热球菌(SEQIDNO:16)562aa序列3:深海热球菌(SEQIDNO:17)559aa序列4:激烈热球菌(SEQIDNO:18)561aa序列5:喜烟嗜热球菌(SEQIDNO:19)559aa同一性得分序列(1:2)比对得分90序列(1:3)比对得分81序列(1:4)比对得分78序列(1:5)比对得分88序列(2:3)比对得分80序列(2:4)比对得分80序列(2:5)比对得分87序列(3:4)比对得分:90序列(3:5)比对得分:78序列(4:5)比对得分:77图4中给出比对。嗜热球菌属某种(菌株9°N-7)DNA连接酶已知最接近的亲属是克达卡拉嗜热球菌DNA连接酶，其中具有90%的氨基酸同一性和80.9%的核苷酸同一性。(5)嗜热球菌属某种(菌株9。N-7)DNA连接酶的纯化使用含有从嗜热球菌属某种(菌株9。N-7)得到的DNA连接酶的B2片段的pMalC2X质粒(NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich，MA)转化大肠杆菌BL-21(DE3)-RIL(Stratagene，LaJolla,CA)。在含有50|ig/ml的氨苄青霉素和25吗/ml的氯霉素的100mlLB培养基中，在37。C下，生长细胞。在温育过夜后，将培养物转移到10升发酵罐中，并且在37°C下温育，直到达到0.59的OD600，并且加入O.l克的IPTG。温育培养物另外的5.75小时，并且收获。在-20。C，贮藏该细胞团(cellpaste)。在40mlpH7.5的10mMTrisHC1、20mMNaCl、0.1mMEDTA和l.OmMDTT中的10克细胞团被解冻并通过超声波裂解。将提取物置入0.3mMPMSF和200mMNaCl。通过离心净化提取物。将净化的提取物通过0.2MNaCl中的DEAE琼脂糖柱。然后收集流过该柱的蛋白质，并且将其稀释为100mM的NaCl。将其施用到磷酸纤维素柱，并且用100mM到1.1M的NaCl梯度洗脱被吸收的蛋白质。通过SDSPAGE分析该级分(图5)，收集60kd的主峰，并且将其加热到75°C，30分钟。通过离心净化该溶液，将净化的溶液稀释为100mMNaCl，并且将其施用到羟磷灰石柱。将0-13%梯度的硫酸铵运用到该柱，收集级分，并且通过在含有50吗/ml的HindlII人DNA作为底物的T4DNA连接酶缓冲液(NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich,MA)中温育多个级分，分析这些级分的活性。在37"C下，温育该反应物10分钟。通过加入10%的100mMEDTA和50%的甘油和溴酚兰染料终止反应。将反引物加热到65。C，并且将其负载到1%的琼脂糖凝胶上进行分析。收集含有大约80%连接酶活性的管，并将其在50y。甘油、pH7.5的10mMTrisHCl、50mMKCl、10mM(NH4)2S04、0.1mMEDTA和1.0mMDTT中透析。纯化的嗜热球菌属某种(菌株9°N-7)DNA连接酶被贮藏在-20"C。实施例2:嗜热球菌属某种(菌株9°N-7)DNA连接酶的特性推荐的反应条件是lOmMTris匿HCl，pH7.52.5mMMgCl22.5mMDTT300|iMATP在45'C下，用于分析活性的典型底物是XDNA。适当消化的XDNA可以在XDNA末端示出12-碱基延伸的连接状态。一般地，我们使用HindIII或BstEII预消化的人DNA。在琼脂糖凝胶电泳上实施连接分析。ATP的Km显示在100pM以下。利用TritonX-100刺激该活性。与喜烟嗜热球菌DNA连接酶不同，嗜热球菌属某种(菌株9。N-7)连接酶在存在NAD+的情况下，没有可检测的活性。该酶需要镁离子。2.5mMMgCl2获得比10mMMgCl2多10倍的活性。在大约100。C下温育该酶30分钟后，保留25%至50%之间的活性(图6)。在90。C下，连接酶能封闭带切口的DNA。DNA连接酶与BstNBI带切口的pUC19质粒DNA—起温育，并将松弛的带切口质粒转化成共价闭环DNA，如通过琼脂糖凝胶电泳所确定。在8(TC时反应速率比在45。C时反应速率高。尽管带切口的质粒在9(TC经历变性，但在9(TC在变性前发生大量的切口封闭，这将所有带切口的质粒转变为单链质粒。实施例3:嗜热球菌属某种(菌株9°N-7)DNA连接酶在DNA修复混合物中的应用使用包括菌株9。N-7DNA连接酶的酶的混合物，修复脱嘌呤所破坏的DNA。在实验反应中DNA通过Ide，H等Biochemistry32(32):8276-83(1993)描述的脱嘌呤而受损。XDNA(NEB#N3011,NewEnglandBiolabs，Inc.，Ipswich,MA)被醇沉淀。将DNA以0.5mg/ml的浓度重悬浮在脱嘌呤缓冲液(lOOmMNaCl、lOmM柠檬酸盐，pH5.0)中，并且在70。C下温育120分钟。然后将样品醇沉淀，并且重新悬浮在0.01MTris、0.001MEDTA，pH8.0的溶液中。在用缓冲液对照校准后，通过测量含DNA溶液的A，确定DNA的浓度。在下列酶的混合物中，在室温下温育受损的DNA达10分钟DNA(lng);100|iMdNTPs(NEB#M0447,NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA);1mMATP;480单位ra《连接酶(NEB^M0208，NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA)或者500单位9°N-7DNA连接酶(NEB弁M0238,NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA);0.1单位大肠杆菌DNA聚合酶I(大肠杆菌polI)(NEB#M0209，NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich,MA);10单位大肠杆菌内切酶IV(NEB#M0304，NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich，MA);1xThermopol缓冲液(NEB弁B9004,NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich,MA)，至最终体积47.5pL。在反应结尾，将样品转移到冰上，然后扩增。阴性对照如上处理，但是没有使用酶。DNA扩增反应根据Wang等Nucl,AcidsRes.32:1197-1207(2004)的方法，使用下列引物，实施XDNA的扩增CGAACGTCGCGCAGAGAAACAGG(L72-5R)(SEQIDNO:23)和CCTGCTCTGCCGCTTCACGC(L30350F)(SEQIDNO:24)。将2.5^1的扩增混合物加入到47.5的上述修复混合物中。该扩增混合物含有IOOjiMdNTPs、5单位7b《DNA聚合酶(NewEnglandBiolabs，Inc.,Ipswich,MA)、0.1单位Vent(exo+)DNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich,MA)、5xl(T11M引物L72画5R和5xl0-11M引物L30350F，于lxTherm叩ol缓冲液中。为了矫正酶储存缓冲液的影响，当修复酶从反应中省略时，将适当体积的储存缓冲液加入到反应物中。在所有的情况下，使用下列参数在热循环仪(thermalcycler)中进行扩增反应在95"C下20秒1个循环，接下来在94"C下5秒，然后在72t:5分钟25个循环。被扩增的扩增子的大小为5kb。通过1%琼脂糖凝胶电泳，确定DNA(5kb)扩增的结果。将6x负载染料(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded"eds.SambrookandRussell,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY:2001，pp.5.4-5.17)加入到5(V1扩增反应物中。然后，将20|il该溶液和作为尺寸标准的lpg的2-对数梯度分子量标准(2-logladder)(NEB#N3200，NewEnglandBiolabs,Inc.,Ipswich,MA)—起加载到琼脂糖凝胶上。权利要求1.基本上纯的重组蛋白质，其具有DNA连接酶活性，并且与SEQIDNO13具有至少91％的氨基酸序列同一性。2.基本上纯的蛋白质，其具有DNA连接酶活性，由选自下列的DNA序列编码(a)与SEQIDNO:2基本上相同的序列；(b)与SEQIDN02基本上互补的序列；(c)在严格条件下，与SEQIDNO:2杂交的序列；禾口(d)编码SEQIDNO:13的序列。3.根据权利要求l所述的蛋白质，其中在大约100。C的温度下温育30分钟后，保留了至少25%的连接酶活性。4.根据权利要求2所述的蛋白质，其中在大约IO(TC的温度下温育30分钟后，保留了至少25%的连接酶活性。5.根据权利要求l、2、3或4所述的蛋白质，其在连接过程中利用ATP而不是NAD+作为辅因子。6.编码DNA连接酶的DNA，所述DNA具有选自下列的序列(a)与SEQIDNO:2基本上相同的序列；(b)与SEQIDNO:2基本上互补的序列；(c)在严格条件下，与SEQIDNO:2杂交的序列；和(d)编码SEQIDNO:13的序列。7.载体，含有权利要求6所述DNA。8.宿主细胞，其能表达权利要求l所述的蛋白质。9.连接磷酸二酯键的方法，包括(a)选择根据权利要求1或2所述的连接酶；(b)将所述连接酶与DNA混合，所述DNA在所述DNA的至少一条链上含有切点；和(c)在所述切点连接所述磷酸二酯键。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述连接酶是从古细菌分离物得到的热稳定连接酶。11.根据权利要求9所述的方法，其中所述古细菌分离物为嗜热球菌属某种(777enwococcww.)(菌株9°N-7)。全文摘要描述了从嗜热球菌属某种(Thermococcussp.)(菌株9°N-7)分离的热稳定的DNA连接酶的组合物，以及制备和使用该组合物的方法。在连接过程中，热稳定的DNA连接酶依赖于ATP而不是NAD⁺作为辅因子，并且在100℃下，保持活性。文档编号C12N9/00GK101287828SQ200680038387公开日2008年10月15日申请日期2006年9月15日优先权日2005年9月15日发明者E·希尔德克劳特,I·希尔德克劳特申请人:新英格兰生物实验室公司