专利名称：用于豆乳制品发酵的嗜热链球菌grx90及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及食品生物技术领域，具体涉及用于豆乳制品发酵的嗜热链球菌grx90 及其用途。
背景技术：
大豆的保健功能众所周知，但是大豆也存在一些营养缺陷，如胰蛋白酶抑制剂影 响蛋白质的消化吸收，凝血素会引起血红细胞凝集，肠胃胀气因子、过敏因子以及大豆豆腥 味等都对大豆蛋白的利用有一定阻碍作用，因而大豆的食用方法与营养价值关系很大。大 豆酸乳就是利用微生物的发酵作用制成的一种酸乳制品，它既能发挥大豆的营养功效，又 能破坏大豆中的抗营养因子，使大豆蛋白质的消化率得到明显提高。目前兼有大豆蛋白质和乳酸菌的酸豆乳饮料在国内迄今仍无有影响的产品上市。 究其原因，主要是乳酸菌在豆乳中生长较差，发酵后的活菌数和酸度均低于酸牛奶，直接影 响了酸豆乳的产品质量。用豆乳生产酸豆乳要达到酸牛乳那样的风味和品质，首先要解决 两个问题，一是制备风味清香、口感舒适、稳定性好的豆乳。二是选育能在豆乳中生长良好， 产酸和活菌数较高，能去除豆腥味，且能产生酸牛乳风味物质的乳酸菌。酸豆乳与酸牛乳相同，其口感与风味与其所使用的乳酸菌的种类密切相关。不同 的乳酸菌产生的酶、代谢的产物等差异很大，由此产生出不同的口感和风味。从众多乳酸菌 中筛选出适合发酵豆乳的菌株具有重要的意义。不仅可以生产出优良口味的大豆发酵制 品，还可以提高大豆中天然保健功能成分的利用率。在食品向天然型和保健型发展的今天， 利用适合在豆乳中发酵的乳酸菌来制备各种大豆发酵制品具有广阔的市场前景。
发明内容
本发明目的在于为了克服前述和其它缺点，发明一种可用于豆乳制品发酵的嗜热 链球菌grx90分离株，制备具有良好口感的发酵豆乳制品。本发明所说的嗜热链球菌grx90，是嗜热链球菌Sti^ptococcus thermophilus (S. thermophilus)CGMCC No :3622。本发明的另一目的在于所述嗜热链球菌grx90的应用可用于制备具有良好口感的发酵豆乳。可用于制备具有良好口感的发酵混合豆乳。可用于制备发酵型即食豆干。
可用于制备具有豆干酪食品。经试验表明本发明的菌株可以有效抑制发酵豆乳制品中不良风味物质的产生，可 以制备具有良好口感的发酵豆乳制品。
图1是嗜热链球菌grx90革兰氏染色显微观察图
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图2是嗜热链球菌grx9016S rDNA-PCR产物的荧光图谱泳道 M :EcoRI+HindIII marker ；1 :grx902 :grx90 ；3 :grx90图3是嗜热链球菌grx90基因组DNA电泳图泳道 M :EcoRI+HindIII marker ；1 :grx90 ；2 :grx90 ；3 :grx90
具体实施例方式发明者通过从我国统发酵制品中分离获得的大量菌株(多数为乳酸菌)，利用研 究α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)活力比较，获得一株最高活力的菌株grx90。再通过细菌形 态学、生理学和培养特征，并通过法国梅埃里公司API系列试剂条及16SrDNA基因测序与 BLAST在线比对，结果证实了菌株grx90是嗜热链球菌(S. thermophilus)。1.样品来源本发明菌株来源于我国新疆民族传统乳制品-酸马奶。酸马奶(Koumiss)是以新 鲜马奶为原料，经乳酸菌和酵母菌等微生物共同自然发酵形成的酸性低酒精含量乳饮料。2.样品采集将样品采集后放入事先准备好的缓冲溶液中，冷藏，2天之内对样品进行分离。3.菌株分离将新疆民族传统乳制品酸马奶样品采用PTYG培养物于37°C培养24小时后。将该 培养物涂布在PTYG琼脂平板上，然后在37°C培养3天，挑取单菌落，并进一步纯化，检测细 菌特征，如下文所述的革兰氏染色如图1所示。将分离获得的菌株用含11%脱脂乳的培养物培养后，加入保护剂，冻干、保存 在-18°C，然后用于各种检测细菌特征的试验。4.菌株筛选将分离的菌株按3%的接种量接入50mL MRS培养基中培养一发酵液于4°C， 5000r/min离心20min收集菌体一0. 85 %的NaCl溶液洗涤，并离心一pH6. 0柠檬酸-磷酸 盐缓冲液悬浮进行超声波细胞破碎一离心得上清为所要酶液一200 μ L新配制底物Ci-乙 酰氧基-α -甲基-乙酰乙酸乙酯+200 μ L酶液30°C水浴20分钟后加入显色剂一15-20°C 显色50分钟，于522nm处测吸光度。5.菌株的鉴定(1)生理生化鉴定从纯化好的本发明菌株固体培养基上挑单菌落接种到糖发酵微量鉴定管中用无 菌石蜡油封口。放入37°C恒温培养箱培养。分别于24h和48h后观察各管中液体颜色变化 情况，若变色为阳性，反之阴性，结果如表1。对照《伯杰氏细菌鉴定手册》初步确定分离菌 株的属种。初步鉴定该菌株为嗜热链球菌，命名为嗜热链球菌grx90。表1本发明菌株生理生化鉴定结果 注“ + ”表示阳性反应，“_”表示阴性反应。(2) API 鉴定在37°C，在厌氧条件下将嗜热链球菌grx90在MRS琼脂平板上培养48小时，然后 用悬浮培养基将所得培养物悬浮，悬浮液的浊度与McFarland 2的相同。然后，将该培养细 胞接种到API20Str印试剂条中，在测定糖发酵的试剂条的上层覆盖一层无菌石蜡，37°C厌 氧培养以便检测酶活和对各种糖的发酵能力(表2)。使用API识别软件程序分析了酶活和糖发酵能力。结果显示，该菌株的酶活和糖 发酵能力与嗜热链球菌类似，符合率为98. 5%。表2本发明菌株API20Str印鉴定系统反应结果
编号12345678VPHIPESCPYRAα GALGURβ GALPALgrx90++------编号910111213141516LAPADHRIBARAMANSORLACTREgrx90+-----+-编号1718192021222324INURAFAMDGLYGHEM45 °C *grx90-----+-注“ + ”表示阳性反应，“_”表示阴性反应。*为补充实验(3)菌株16SrDNA序列鉴定采用细菌基因组DNA小量抽提试剂盒，按照说明进行操作，所提嗜热链球菌grx90 基因组DNA电泳条带清晰，说明基因组DNA完整性较好可用于PCR等分子生物学操作(如 图2所示)，其16SrDNA测序结果如SEQ ID NO. 1所示。以基因组DNA作为模板，采用50 μ 1反应体系进行PCR扩增，其中模板DNA5 μ 1 (大 约 IOOng)，2. 5mM dNTP 4 μ 1, IOXbuffer 5 μ 1，IOpmol 上下游引物各 1. 5 μ 1，Taq 酶 1. 5U， Mg2+3y 1,以 ddH20 补至 50μ 1。PCR 循环参数为:94°C 预变性 5min ；94°C 变性 lmin，64°C 退 火 45s，72°C延伸 lmin，循环 35 次；72°C延伸 8min。吸取 PCR 产物 5 μ 1 与 1 μ 1 Loading buffer混合，用1. 0%琼脂糖凝胶电泳，电压为80V。电泳结束后用溴化乙锭(EB)染色 20-30min，拍照。可见约1500bp的条带即为目标条带(如图3所示)。测序工作由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，测序结果嗜热链球菌 grx90的16SrDNA序列长度为1456bp。与Genbank中发表的序列比对，表明本发明菌株以 同源性高达99. 65%被证实属于嗜热链球菌。API鉴定与16SrDNA序列测定结果一致，本发明菌株为嗜热链球菌 (S. thermophilus)grx90o6.菌株保藏将本发明嗜热链球菌grx90菌株于2010年2月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物 研究所；分类命名为嗜热链球菌(Sti^ptococcus thermophilus)，保藏号为CGMCC No 3622。实施例1、酸豆乳的制作方法精选黄豆一0.25%的NAaHCO3浸泡14h—清水洗两次一1 8的比例用热水 (85°C左右)磨浆一煮浆一加入8%的白砂糖和3%的全脂乳粉一均质(15-20MPa)—灭菌 (90-95°C, 15分钟)一冷却42°C左右接入3%嗜热链球菌grx90 — 42°C恒温发酵6_8h至 PH值为4. 3 4.6—放入4°C冰箱过夜即制成凝固型酸豆乳。发酵结束后经搅拌，添加果 酱果汁等，冷藏，即制成搅拌型酸豆乳。实施例2、酸豆乳酸菌饮料的制作方法按应用实施例1制备好酸豆乳，将酸乳用杀菌并冷却的水、糖浆、乳化稳定剂等混 合物稀释3-4倍左右，制成可直接饮用的酸豆乳饮料。实施例3、发酵豆干的制作方法按实施例2制备好酸豆乳，切割成小凝乳块，阶段性加热，加热到45-50°C促使其 排出乳清，压榨到水分含量为40-43 %，制成发酵豆干。实施例4、大豆再制干酪制作按实施例2、4制备好发酵，接种毛霉26°C培养36h，8°C成熟12天制成大豆干酪。 加入20%胡萝卜汁、3. 5%盐、1. 5%糖、10%人造奶油、10%全脂奶粉、3%乳化稳定剂，85°C 融化后进行包装。实施例5、含嗜热链球菌grx90粉末状食品的制作方法将嗜热链球菌grx90酸乳冷冻至_40°C _60°C，经干燥，至含水量为3% -5%，压 碎成粉末状，可将粉末状产品加入奶粉、低聚糖、麦芽糊精、风味剂等制成粉末状或片块状
产品，用于日常食用。实施例6、含嗜热链球菌grx90冰淇淋的制作方法按应用实施例1制备好酸豆乳，冰淇淋原料配比如表5所示。表5 IOOOkg冰淇淋配方
原料重量(kg)嗜热链球菌grx90酸乳400白砂糖75全脂奶粉62. 5黄奶油31. 25椰子油23糖浆26. 25乳化稳定剂6水276将除酸乳以外的其它物料混合，预热到60 65°C，采用20Mpa 30Mpa进行均质， 然后在80°C /20s杀菌，冷却到40 50°C，与酸乳混合，采用20Mpa 30Mpa进行均质，在 2°C 4°C时，老化时间6h，经凝冻后经过硬化的为硬质冰淇淋，不经硬化的为软质冰淇淋。以上本发明提供的菌株发酵的酸豆乳、大豆发酵豆干、再制干酪等几种产品风味 良好，易为消费者接受。
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以上本发明提供的菌株发酵的酸豆乳、豆乳饮料、大豆发酵豆干、豆乳冰淇淋、粉 末状食品口感风味良好，并有一定的保健作用，易为消费者接受。
权利要求
用于豆乳制品发酵的嗜热链球菌grx90，其特征在于，是嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)CGMCC 3622。
2.如权利要求1所述用于豆乳制品发酵的嗜热链球菌CGMCC3622用于制备发酵豆乳。
3.如权利要求1所述用于豆乳制品发酵的嗜热链球菌CGMCC3622用于制备发酵混合豆乳。
4.如权利要求1所述用于豆乳制品发酵的嗜热链球菌CGMCC3622用于制备发酵型即食豆干。
5.如权利要求1所述用于豆乳制品发酵的嗜热链球菌CGMCC3622用于制备豆乳干酪
全文摘要
本发明涉及食品生物技术领域，具体涉及用于豆乳制品发酵的嗜热链球菌grx90及其用途。所说的嗜热链球菌grx90是嗜热链球菌(S.thermophilus)CGMCC 3622。该菌株可以有效抑制发酵豆乳制品中不良风味物质的产生，可以制备具有良好口感的发酵豆乳制品。
文档编号A23L1/20GK101906391SQ20101013947
公开日2010年12月8日 申请日期2010年4月6日 优先权日2010年4月6日
发明者刘彩平, 徐寅, 顾瑞霞 申请人:扬州大学