专利名称：高抗草甘膦特变基因及其改良方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体的说，本发明涉及一种改良抗草甘膦基因的 方法、抗草甘膦基因及其编码的蛋白质，以及利用这些改良的抗草甘膦基因获得转基因抗 草甘膦植物的方法。本发明可以运用在作物的育种、也可以运用在植物细胞培养的筛选。
背景技术：
草甘膦是一种非常重要的除草剂，它是抑制植物中芳香族氨基酸生物合成中的一 种重要的酶，即5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)。草甘膦是一种极广谱的除草 剂，对农作物也同样具备杀伤力。因此为了能够在农作物生长时选择性地除草，农作物需要 获得具有抗草甘膦的能力。草甘膦能够抑制大部分细菌中芳香族氨基酸生物合成中的5-烯醇丙酮莽草 酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)。但部分细菌的EPSPS已发现对草甘膦具有抗性，并且被分 离获得。植物可以通过转基因表达细菌的抗性EPSPS而获得抗草甘膦的能力。农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens sp CP4)禾口 Salmonella typhimurium CT7 的 EPSPS 在植物 中表达而获得的抗性已在生产中应用(美国专利453590，4769061，5094945)。但是为了提 高转基因农作物的抗性水平和增加抗性基因的多样性，生产应用中仍然需要新的抗草甘膦 基因和以此为基础的转基因抗草甘膦植物。hkDeinococcus radiodurans Rl获得的EPSPS基因具有相当的抗草甘膦能力(中 国专利2009100981 . X)。2009年申请的申请号2009100981 . X的发明专利《一种抗草甘 膦基因及其应用》提供了抗草甘膦基因，其中基因G1174所编码的蛋白质的氨基酸序列如该 专利的SEQ ID NO :2所示。尽管Λ radiodurans Rl的EPSPS的抗草甘膦能力比较高，但是 获得抗性更高的EPSPS改良基因仍然十分必要。提供转基因植物的抗性水平能够提高草甘 膦的使用剂量，从而可以减缓抗性杂草的发生，避免使用过程中由于剂量问题而造成药害。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种改良抗草甘膦EPSPS基因的方法和提供一 种抗草甘膦基因。这种抗性基因具有比Λ radiodurans Rl天然的EPSPS基因更高的抗草 甘膦能力。利用这种基因可以用来产生转基因抗草甘膦植物，也可作为植物细胞培育中的 蹄选标记O为了解决上述技术问题，本发明是通过这样的技术方案来实现的本发明提供一种通过特变获得高抗草甘膦的G1174特变基因(高抗草甘膦特变基因)的方法，在第95到 114位的氨基酸序列(Pro Gly Asn Ala Gly Ala Val Ala Arg Phe Leu Met Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly)中引入2个或者2个以上的氨基酸特变，然后选择高抗草甘膦的突 变体。特别是引入2个或者2个以上如下位点的特变1)第99号甘氨酸；幻第100号丙氨 酸；3)第104号苯丙氨酸；4)第106号甲硫氨酸；5)第107号甘氨酸。本发明同时也提供一种G1174抗草甘膦特变基因(高抗草甘膦特变基因)，其编码的蛋白质包括至少2个以下位点的特变1)第99号氨基酸从甘氨酸特变成为丙氨酸；2)第 100号氨基酸从丙氨酸特变成为苯丙氨酸，或者苏氨酸，或者甲硫氨酸，或者丝氨酸；3)第 104号氨基酸从苯丙氨酸特变成为亮氨酸或者丝氨酸；4)第106号氨基酸从甲硫氨酸特变 成为亮氨酸或者丝氨酸；5)第107号氨基酸从甘氨酸特变成为丙氨酸。本发明进一步提供一种抗草甘膦G1174的特变基因(高抗草甘膦特变基因)，其编 码的蛋白质的第95到114位的氨基酸序列特变成为如下的任何一种1) SEQ ID NO 4 ； 2) SEQ ID NO 5 ； 3) SEQ ID NO 6 ； 4) SEQ ID NO 7 ； 5) SEQ ID NO 8 ； 6) SEQ ID NO 9 ； 7) SEQ ID NO: 10; 8) SEQ ID NO :11; 9) SEQ ID NO :12; 10) SEQ ID NO 13; 11) SEQ ID NO 14; 12)SEQ ID NO 15; 13)SEQ ID NO :16， 14)SEQ ID NO 17, 15)SEQ ID NO: 18,16)SEQ ID NO 19, 17)SEQ ID NO :20, 18)SEQ ID NO :21, 19)SEQ ID NO :22, 20)SEQ ID NO :23, 21) SEQ ID NO :24。本发明还提供了一种高抗草甘膦特变基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID N0 26 SEQ ID NO 30中的任意一种。本发明还提供了 一种载体，其包含上述高抗草甘膦特变基因。本发明还提供了上述高抗草甘膦特变基因的用途通过转基因在植物中表达，从 而使植物获得抗草甘膦能力。植物为水稻、玉米、棉花、小麦、大麦、高粱、油菜、大豆、草坪草 或牧草等。来自 Deinococcus deserti VCDl 15 和 Deinococcus geothermalis 的 EPSPS S@ (基因库YP_002785524 和 ΥΡ_604470,专利申请 200910098129. X 中提供的多肽 SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO 5)和本发明所用的G1174同源性比较高，它们所编码的蛋白质和G1174 相比，在相应于G1174的第95到114位的氨基酸序列是完全相同的。本发明同时也提供 一种改良这些同源基因以及其他与Gl 174氨基酸序列相同性至少有75%的抗草甘膦多肽的 方法。这些多肽中相对应于G1174中如下位点可以引入至少如下2个位点的特变从而筛 选获得抗草甘膦能力更高的蛋白质1)第99号氨基酸从甘氨酸特变成为丙氨酸；幻第100 号氨基酸从丙氨酸特变成为苯丙氨酸或者苏氨酸或者甲硫氨酸或者丝氨酸；3)第104号氨 基酸从苯丙氨酸特变成为亮氨酸或者丝氨酸；4)第106号氨基酸从甲硫氨酸特变成为亮氨 酸或者丝氨酸；5)第107号氨基酸从甘氨酸特变成为丙氨酸。本发明进一步提供了编码高抗性的EPSPS蛋白质突变体的代表性核苷酸序列 SEQ ID NO 26,或者 SEQ ID N0:27，或者 SEQ ID N0:28，或者 SEQ ID N0:29，或者 SEQ ID NO :30。这些基因在5，端包含了编码叶绿体信号肽的DNA片段。利用本发明提供的抗草甘膦基因氨基酸序列可以设计并且合成有利于在植物中 表达的核苷酸序列(Campbell和Gowri，Plant Physiol. 92:1-11)，并进一步构建能够 在植物中表达的人工基因表达框。能够在植物中表达的人工基因表达框包括启动子、带有 叶绿体信号肽的抗草甘膦基因和终止子。在植物中表达和产生抗草甘膦能力所需要的启动 子、叶绿体信号肽和终止子是已经有的技术。例如，在转化单子叶植物时启动子可以是玉米 WDiqutin-I启动子，或者水稻Actin启动子；而终止子可以是来自根癌农杆菌终止子(Nos) 或者其他终止子；引导抗草甘膦蛋白质进入叶绿体的信号肽可以是Rubisco的亚基的信号 肽(de Castro Silva Filho 1996 Plant Mol. Biol. 30 767-780)、植物 EPSPS 基因信号 肽(Archer 1990 J. Bioenerg. Biomemb. 22 (b) 789-810)等。编码叶绿体信号肽的 DNA片段连接在一个抗草甘膦基因在5’端，并且在一个表达阅读框内。这个表达构件可以通过 农杆菌(如^ro如cteri 菌株LAB4404)、基因枪方法或则其他方法整合到植物的基因组 中并且获得表达，从而获得抗草甘膦转基因植株。植物转化的技术和方法是已知和成熟的。 不同植物的转化的方法和步骤有所不同。但是，通常通过农杆菌或基因枪导入植物的未成 熟胚、成熟胚、未分化的愈伤组织或原生质体。然后用1到5 mM的草甘膦培养基进行筛选培 养。再进行分化而获得转化芽，经过生根培养基培养就可以获得可以种植的转基因苗。进 一步，抗草甘膦转基因植物可以通过喷施草甘膦筛选。本发明还提供了一种质粒，这种质粒包含上述抗草甘膦的核苷酸序列分子，并且 功能性地与控制植物中表达的核苷酸序列连接而构成表达框。本发明还提供了一种对植物进行改造的方法包括利用植物基因转化技术将上述 抗草甘膦基因表达框导入植物细胞，再将其分化培育成相应的转基因植株。所获得的植株 具有抗草甘膦能力。植物可以是水稻、玉米、棉花、小麦、大豆、油菜、高粱、大麦、草坪草或牧 草。这些植物的转化技术是已经现有的技术。本发明还提供了利用上述抗草甘膦基因的核苷酸序列分子，在植物转基因细胞培 养中作筛选标记。本发明的又一个方面是提供抗草甘膦基因用来作为植物转基因的筛选标志。上述 能够在植物细胞中表达的抗草甘膦人工基因可以与目的基因表达框构建在同一个植物转 化质粒的同一个DNA转化片段上。目的基因可以是任何有价值的基因。这个植物转化质粒 可以通过基因枪、农杆菌方法或则其他方法导入植物组织，而含有合适浓度的草甘膦(如 1-5 mM)培养基则可以选择性地杀死没有导入DNA转化片段的植物细胞，从而选择了含有 目的基因的植物细胞。本发明的抗草甘膦基因的核苷酸序列可以有多种不同的变异，包括但不限于1) 利用同一个氨基酸的不同密码子而获得的不同的核苷酸序列，这些序列编码相同活性的蛋 白质多肽；2)通过导入核苷酸序列的其他变异但是仍然编码具有抗草甘膦能力的蛋白质 的核苷酸序列。这种变异可以是随机的变异，也可以是针对性的点变异，还可以是插入或者 缺失变异。本领域的一般技术人员就能够通过分子生物学的方法产生上述变异。
本发明适用于所有植物，包括双子叶和单子叶植物。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此。 本发明的以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在 Ausubel 编写的 John Wiley and Sons 公司出片反的 Current Protocols in Molecular Biology,禾口 J. Sambrook 等编写 Co Id Spring Harbor Laboratory Press (2001)出片反白勺 Molecular Cloning: A Labortory Manual, 3rd ED.等文献均有详细的说明。
实施例1、EPSPS基因的表达
ifeiflococciAs rai/ioi/tfra/ ·^的EPSPS基因(核苷酸序列SEQ ID NO 1)通过上海生工(上 海)人工合成获得，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO 2.。这个基因被称为G1174基因， 其核苷酸序列编码第95到114氨基酸的核苷酸片段的二端分别设计了 XmaI和KpnI酶切位点。PMD19载体(购于TAKARA公司)被用来表达Gl 174，以测定其抗草甘膦能力。通 过一般的分子生物学方法将G1174克隆到PMD19，获得了 PMD19-M-1174质粒载体，SEQ ID NO :3是其全部序列，其中插入的G1174基因序列为2218-3531。转化了 PMD19和 PMD19-M-1174的大肠杆菌TG-I细胞分别在LB培养液(酵母提取物5. Og,蛋白胨10. Og, NaCl 10. Og,琼脂15. Og,蒸馏水定容至1. 0L, pH7. 0)中37° C振荡培养16小时以后， 离心收集获得大肠杆菌细胞，经过SDS-PAGE分离，利用Gl 174的抗体进行Western检测，结 果发现PMD19样品没有信号而PMD19-M-1174检测到了明显的信号，说明这个载体能够表达 G1174蛋白质。实施例2、EPSPS突变体文库的获得
为了筛选抗性水平更高的EPSPS突变体，对G1174编码的95-114氨基酸的核苷酸片段 进行突变。合成如下2个核苷酸简并引物
94—114F :Ggg aac gcg NNg NNg gtg gcc cgc NNc ctg NNg gNc gtg gcg gcg ctg acg age ggt ac (N 代表 A\t\g\c)。94-114R: C GCT CGT CAG CGC CGC CAC GNC CNN CAG GNN GCG GGC CAC CNN CGC GTT CCC (N 代表 A\t\g\c)。混合以上2个核苷酸简并引物的Tris-HCl溶液，用T4多聚核苷酸激酶进行5‘端 磷酸化，然后65° C 20分钟，然后冷却到22° C，获得能够和SmaI和KpnI酶切的载体连 接的双链DNA片段。这个DNA片段进一步和经过了 SmaI和KpnI酶切的载体PMD19-M-1174 混合，利用了 DNA连接酶连接，导入大肠杆菌TG-1，从而获得包含不同G1174突变体的突变 体表达文库。实施例3、EPSPS突变体的抗性筛选
配置含60mM或者IOOmM草甘膦的M 63培养基。M63的配方如下每升M63 13. 6g KH2PO4，2 g (NH4) 2S04，0. 5 mg FeS04_7H20，2.4 mg MgCl2, 10 g glucose, 10 mg Thiamine-HCl和25 mg L-Proline,40 g琼脂糖，其余为蒸馏水，ρΗ7· 0。Μ63培养基在完 成高温高压杀菌以后，在温度下降到55° C时，添加草甘膦到最后浓度60mM或者100mM。将包含不同Gl 174突变体的突变体表达文库涂在含60mM草甘膦的M 63培养基上 培养。72小时以后观察生长情况。原始基因Gl 174在60mM草甘膦的M63培养基上生长非 常缓慢，72小时以后不能看到明显的菌落。但是，部分G1174突变体能够在培养72小时以 后长出可以看到的菌落。将抗草甘膦的突变体克隆进一步在草甘膦含量为100 mM的M 63培养基上培育。 如下克隆能够在72小时长出菌落，它们分别是G1174-A，G1174-B, G1174-C，G1174-D, G1174-E，G1174-F; G1174-G, G1174-H, Gl174-1， Gl174-J, G1174-K, G1174-L， G1174-M, G1174-N, G1174-0, G1174—P, G1174-Q, G1174-R, G1174—S, G1174—T, G1174—U, G1174-V, G1174-W。实施例4、高抗草甘膦Gl 174特变位点的分析
在IOOmM草甘膦上能够正常生长的克隆可能包含一个抗草甘膦性能比原始基因G1174 更加高的突变体。因此测定了实施例3获得的抗草甘膦克隆的特变区域的核苷酸序列。结 果发现这些基因的特变结果如下(从第95到114号氨基酸)G1174PGNAGAVARFLMGVAALTSGTG1174--A PGNAGAVARLLMAVAALTSGT(SEQ IDNO4)G1174--B PGNAGMVARSLLGVAALTSGT(SEQ IDNO5)G1174--C:PGNAAAVARLLMAVAALTSGT(SEQIDNO6)G1174--D PGNAAMVARSLMAVAALTSGT(SEQ IDNO7)G1174--E PGNAGLVARSLLGVAALTSGT(SEQIDNO8)G1174--F:PGNAAFVARSLMGVAALTSGT(SEQIDNO9)G1174--G:PGNAASVARFLMGVAALTSGT(SEQ[D NO 10)G1174--I:PGNAATVARLLMGVAALTSGT(SEQIDNO11)G1174-J:PGNAAMVARSLMGVAALTSGT(SEQIDNO12)G1174--K:PGNAGFVARSLMGVAALTSGT(SEQ[D NO 13)G1174--L:PGNAATVARFLMGVAALTSGT(SEQ ID NO 14)G1174--M:PGNAAMVARLLMGVAALTSGT(SEQ[D NO 15)G1174--N:PGNAGAVARLLLGVAALTSGT(SEQIDNO16)G1174--0:PGNAGTVARFLLAVAALTSGT(SEQIDNO17)G1174--P:PGNAGAVARLLLAVAALTSGT(SEQIDNO18)G1174--R:PGNAGTVARFLTGVAALTSGT(SEQIDNO19)G1174--S:PGNAGTVARLLSGVAALTSGT(SEQIDNO20)G1174--T:PGNAGTVARLLLGVAALTSGT(SEQIDNO21)G1174--U:PGNAAMVARSLLAVAALTSGT(SEQIDNO22)G1174--V PGNAAAVARLLMGVAALTSGT(SEQIDNO23)G1174--W:PGNAAFVARSLMAVAALTSGT(SEQIDNO24)
这些高抗草甘膦的突变体的特变主要包括1)第99号氨基酸从甘氨酸特变成为丙氨 酸；2)第100号氨基酸从丙氨酸特变成为苯丙氨酸或者苏氨酸或者甲硫氨酸或者丝氨酸； 3) 104号氨基酸从苯丙氨酸特变成为亮氨酸或者丝氨酸；4) 106号氨基酸从甲硫氨酸特变 成为亮氨酸或者丝氨酸；5) 107号氨基酸从甘氨酸特变成为丙氨酸。特别是这些突变体普 遍具有2个或者以上的氨基酸特变。以前的研究已经发现在大肠杆菌EPSPS的第96号氨基酸(相应于本发明中G1174 的第99号氨基酸)从甘氨酸特变成为丙氨酸能够提高抗草甘膦能力，但是这个突变体酶的 ySftPilST (GenBank accession no. X00557; Kishore et al. 1986; Padgette et al. 1991)。为了研究能否仅仅将基因G1174的第99号氨基酸从甘氨酸特变成为丙氨酸而获 得高的抗草甘膦能力，本发明通过点特变的方法获得了 99号氨基酸从甘氨酸特变成为丙 氨酸的Gl 174特变基因G1174-G99A。为了比较G1174-G99A和本发明的G1174-A、G1174-F和G1174-V等突变体的抗 草甘膦能力，能够表达以上这些突变体的PMD19载体导入了大肠杆菌TG-1，在LB培养基上 37° C培养16小时，获得单个克隆。然后将每个突变体的5个克隆转接到含IOOmM草甘膦 的M63培养基上，37° C培养48小时，观察生长情况。结果发现，表达G1174-G99A的克 隆生长明显比表达G1174-A、G1174-F和G1174-V的克隆慢。同时这些表达克隆转接到含 IOOmM草甘膦的M63培养液(不包含琼脂糖，其他成分和M63培养基相同)，37° C振荡培养48 小时。测定 0D600，结果发现，G1174-G99A 是 0. 24，G1174-A 是 0. 73，G1174-F 是 0. 65， G1174-V是0. 53。因此本发明提供的抗草甘膦突变体比仅仅第99号的甘氨酸到丙氨酸特 变体表现更高的抗性。实施例5、G1174-A 基因，G1174-C 基因，G1174-L 基因，Gl 174-0 基因和 G1174-V 基因在植物中表达的表达框的构建
通过人工合成获得了适于在单子叶植物中表达的密码子优化的G1174的人工基因 (SEQ ID NO 25,其包括了 5，端编码叶绿体信号肽的核苷酸序列)。这个人工基因的DNA 片段的5’端带有一个BamHI位点，3’端带有一个BioI位点。利用现有的特变方法分别引 进了相应的特变，获得了具有G1174-A，G1174-C，G1174-L，Gl 174-0和G1174-V的突变位 点的Gl 174特变基因(核苷酸序列分别SEQ ID NO: 26，SEQ ID NO: 27，SEQ ID NO: 28， SEQ ID NO: 29，和 SEQ ID NO: 30)。启动G1174特变基因的启动子是玉米的ubiquitin-1启动子。这个启动子是 通过PCR从玉米基因组中获得。PCR引物分别是ZmUbiF (GCGAAGCTTGCATGCCTACAGTGC AGCGTGACCCGGTCGTGC, 力Π 了 HindIII 位点，下戈Ij 线表示)，禾Π ZmUbiR (GTGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCA GAAGTAACACCAAACAACAG,力卩了 BamHI 位点，下划线表示)。G1174特变基因经过XhoI和BamHI酶切，PCR获得的玉米ubiquitin-Ι启动子经过 HindIII和BamHI酶切，同时连接到经过了 HindIII和XhoI酶切的pCambial300载体，分 别获得 T-DNA 载体 pCAM1300-1174A，pCAM1300_1174C，pCAM1300-1174L，pCAM1300_11740 和pCAM1300-1174V。这个载体中Gl 174特变基因的终止子是来自载体本身的CaMV的35S 基因的终止子。实施例6、水稻的转化
转基因植物的获得方法是采用现有技术(卢雄斌龚祖埙1998生命科学10: 125-131 ；刘凡等，2003分子植物育种1:108-115)。选取成熟饱满的“秀水110”种子去 壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。分别取含载体pCAM1300-1174A，pCAM1300_1174C， PCAM1300-1174L, pCAM1300-11740和pCAM1300_1174V的农杆菌划板，挑单菌落接种准备 转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入适当浓度的农杆菌液中(含乙酰丁香酮)，让农杆 菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中，共培养2 3天。用无菌水冲 洗转化后的愈伤，转移到含适当抗生素的筛选培养基上，筛选培养(2 mM草甘膦)两个月(中 间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基上培养20天左右，然后 将预分化好的愈伤组织移到分化培养基，14小时光照分化发芽。2 - 3周后，把抗性再生植 株转移到生根培养基上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，作为鉴定材料。实施例7、玉米的转化
玉米的转化方法已经比较成熟，例如Frame等描述了利用农杆菌转化玉米的方法 (Plant Physiol, 2002，129 :13-22 )。分别取含载体pCAM1300_1174A，pCAM1300_1174C， PCAM1300-1174L, pCAM1300-11740和pCAM1300_l 174V的农杆菌划板，挑单菌落接种准备 转化用农杆菌。取授粉后8 — 10天的Hi-II玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小为1.0 — 1.5mm)。将含有T-DNA载体的农杆菌与未成熟胚共培育共培养2 — 3天(22°C)。转移未成 熟胚到愈伤诱导培养基上(200mg/L的Timentin杀农杆菌暗培养10 — 14天。将所 有的愈伤转到带有2 mM草甘膦的筛选培养基上，28°C暗培养2 — 3周。
转移所有的组织到新鲜草甘膦的筛选培养基上，28°C暗培养2 — 3周。然后，转移 所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基上，28°C暗培养10 - 14天，每皿一个株系。转移 胚性组织到新鲜的再生培养基上，^rc光照培养10 - 14天。转移所有发育完全的植株到 生根培养基上，26°C光照培养直到根发育完全，然后移植到温室中单株培养，检测转基因 玉米的抗除草剂能力。实施例8、转基因水稻的抗草甘膦能力测定
从PCAM1300-1174A， pCAM1300_1174C， pCAM1300_1174L， pCAM1300_11740 和 PCAM1300-1174V以及pCAM1300_G1174 (对应原始的基因G1174)获得的转基因水稻中分别 选择12个不同的转基因水稻株和同品种“秀水110”的非转基因株种植在温室中培育(温度 15-25°C)。在苗高大约10 cm时，喷浓度为0.4% (W/V)的草甘膦，40 mL/平方米。8天后检 查，结果如表1。结果表明这些本发明特变基因的抗草甘膦能力良好，优于原始基因G1174。表1 转基因水稻喷施草甘膦以后的成活率。
权利要求
1.一种通过人工特变获得高抗草甘膦G1174基因特变体的方法，其特征是在基因 Gl 174编码的蛋白质的第95到114位的氨基酸序列中引入2个或者2个以上的氨基酸特 变，然后选择高抗草甘膦的突变体。
2.根据权利要求1所述的通过人工特变获得高抗草甘膦Gl174基因特变体的方法，其 特征是1)、这种抗草甘膦基因编码的蛋白质的氨基酸序列与G1174具有至少75%的相同 性；2)、在对应于基因G1174编码的蛋白质的95到114位的氨基酸序列中引入2个或者2 个以上的氨基酸特变，然后选择高抗草甘膦的突变体。
3.根据权利要求2所述的通过人工特变获得高抗草甘膦Gl174基因特变体的方法，其 特征是在以下任意2个或2个以上的位点同时特变1)、第91号甘氨酸；2)、第92号丙氨 酸；3)、第96号苯丙氨酸；4)、第98号甲硫氨酸；5)、第99号甘氨酸。
4.根据权利要求3所述的通过人工特变获得高抗草甘膦Gl174基因特变体的方法，其 特征是同时发生以下任意2个或2个以上的位点的特变1)、第91号氨基酸从甘氨酸特变成为丙氨酸；2)、第92号氨基酸从丙氨酸特变成为苯丙氨酸或者苏氨酸或者甲硫氨酸或者丝氨酸；3)、第96号氨基酸从苯丙氨酸特变成为亮氨酸或者丝氨酸；4)、第98号氨基酸从甲硫氨酸特变成为亮氨酸或者丝氨酸；5)、第99号氨基酸从甘氨酸特变成为丙氨酸。
5.利用权利要求1、所述方法获得的高抗草甘膦特变基因编码的蛋白质，其特征是 所述蛋白质的第95到114位的氨基酸序列为SEQ ID NO :4 SEQ ID NO 24中的任意一种。
6.一种高抗草甘膦特变基因，其特征是所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO 26~ SEQ ID NO 30中的任意一种。
7.一种载体，其特征是包含权利要求6所述的高抗草甘膦特变基因。
8.如权利要求6所述高抗草甘膦特变基因的用途，其特征是通过转基因在植物中表 达，从而使植物获得抗草甘膦能力。
9.根据权利要求8所述的高抗草甘膦特变基因的用途，其特征是所述植物为水稻、 玉米、棉花、小麦、大麦、高粱、油菜、大豆、草坪草或牧草。
全文摘要
本发明公开了一种通过人工特变获得高抗草甘膦G1174基因特变体的方法和应用在基因G1174编码的蛋白质的第95到114位的氨基酸序列中引入2个或者2个以上的氨基酸特变，然后选择高抗草甘膦的突变体。本发明还公开了一种高抗草甘膦特变基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO26~SEQ ID NO30中的任意一种。上述高抗草甘膦特变基因的用途是通过转基因在植物中表达，从而使植物获得抗草甘膦能力。
文档编号A01H5/00GK102146371SQ201110009329
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月17日 优先权日2011年1月17日
发明者徐晓丽, 李新兰, 林朝阳, 沈志成 申请人:杭州瑞丰生物科技有限公司