专利名称：α－半乳糖苷酶固体发酵生产方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种固态发酵生产饲用α-半乳糖苷酶的方法。
背景技术：
α-半乳糖苷酶是一种以特异性水解半乳糖类寡糖和多聚半乳-(葡)甘露聚糖的非还原性末端α-1，6-半乳糖苷键为特征的寡糖水解酶，具有极大的经济价值和应用价值。由于α-半乳糖苷酶能水解豆类中蜜二糖、棉籽糖、水苏糖和毛蕊花糖等低聚糖和半乳甘露聚糖的多糖，能起到改善糖代谢等作用，因此主要用于饲料和食品等工业之中。
目前，饲料工业随着畜牧业生产区域化、规模化、饲料比重的提高而大发展，我国饲料资源紧缺的矛盾日益突出；据专家预测，2010年-2020年，我国蛋白质饲料的差额为2400万吨-4800万吨。豆粕因含有43％～48％的粗蛋白、并有较平衡的氨基酸组成，而成为畜禽最重要的植物性蛋白源；然而美中不足的是豆类所含的低聚糖如蜜二糖、棉籽糖、水苏糖和少量的毛蕊花糖不能被单胃动物消化吸收，却被肠道微生物发酵，产生二氧化碳、甲烷和氢气等气体，引起胀气，导致能量损失，增加食糜的通行速度，降低养分吸收，极大地影响了豆粕的饲用价值，并导致养殖成本的增加和环境污染。
资料表明大豆粕中棉籽糖和水苏糖含量约为1.4％和5.2％，为了消除这些不溶性低聚糖的抗营养作用，长期以来一直采用高温、高压、高湿和延长时间等方法压榨大豆，或者采用有机溶剂萃取法消除这些抗营养因子，即使采取最适宜的加工工艺处理大豆，豆粕中仍然存在一定量的α-半乳糖苷，而且也增加了豆粕的生产成本。
经研究与实践证明，采用现代生物工程技术的成果-酶制剂来提高杂粕在饲料中的使用量及利用率是目前降低饲料成本和减轻环境污染的有效方法之一，也顺应生态农业的要求。我国α-半乳糖苷酶在动物饲料中的应用还处于初步研究阶段，尤其与其他酶制剂的配伍研究未见报道，由此可见，利用微生物发酵法工业化、规模化地生产α-半乳糖苷酶有着广阔的应用发展前景。
目前也利用微生物生产α-半乳糖苷酶的报道，但是现有的α-半乳糖苷酶产生菌产酶水平偏低，对产酶菌的发酵特性、营养特性和发酵技术并未进行系统的研究；因此探索酶活高，既可用液体种子也可用固体种子接种的α-半乳糖苷酶生产方法显得很有必要。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种产酶活力高、工艺简单、易于生产应用的α-半乳糖苷酶固体发酵生产方法。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的提供一种α-半乳糖苷酶固体发酵生产方法，包括以下步骤1)、孢子悬液的制备将保藏号为CGMCC No.1628的臭曲霉接种到斜面培养基上，于28℃恒温培养7天；再用无菌水制成浓度为106～107个/ml的孢子悬液，待用；所述斜面培养基为PDA斜面培养基；2)、一级种子制备首先将液体种子培养基经121℃、20min灭菌，再冷却；然后按照体积比为5％的接种量将孢子悬液接入上述冷却后的液体种子培养基中，于28℃、转速为200rpm的摇床上培养18h，得液体种子；所述液体种子培养基为PDA液体培养基；3)、α-半乳糖苷酶的发酵首先将发酵培养基经121℃、20min灭菌，再冷却；然后按照1毫升/10克的接种量将上述液体种子接入冷却后的发酵培养基中，充分搅拌混匀后，于28℃培养4～7天，在培养过程中，于20h时进行混匀振荡发酵培养基的步骤；所述发酵培养基由重量比为2∶3的干基和蒸馏水混和后、调pH至5.5～6.0制成，所述每100g干基由82.137g麸皮、17.843g豆粕、0.01g硫酸锰和0.01g五水硫酸铜组成。
作为上述α-半乳糖苷酶固体发酵生产方法的改进，在所述发酵步骤后进行后处理步骤将发酵步骤所得的产物于40℃～45℃的低温气流下干燥至水分重量含量为10％，粉碎后即得α-半乳糖苷酶制剂。
本发明还提供了属于同一发明构思的另一种α-半乳糖苷酶固体发酵生产方法，包括以下步骤1)、孢子悬液的制备将保藏号为CGMCC No.1628的臭曲霉接种到斜面培养基上，于28℃恒温培养7天；再用无菌水制成浓度为106～107个/ml的孢子悬液，待用；所述斜面培养基为PDA斜面培养基；2)、一级种子制备首先将液体种子培养基经121℃、20min灭菌，再冷却；然后按照体积比为5％的接种量将孢子悬液接入上述冷却后的液体种子培养基中，于28℃、转速为200rpm的摇床上培养18h，得液体种子；所述液体种子培养基为PDA液体培养基；3)二级种子制备将固体种子培养基经121℃、20min灭菌，再冷却；然后按照1毫升/10克的接种量将液体种子接入上述冷却后的固体种子培养基中，于28℃培养箱中培养4～6天，得固体种子；所述固体种子培养基由重量比为2∶3的干基和蒸馏水混和后、调pH至5.5～6.0制成，所述每100g干基由82.137g麸皮、17.843g豆粕、0.01g硫酸锰和0.01g五水硫酸铜组成；4)、α-半乳糖苷酶的发酵首先将发酵培养基经121℃、20min灭菌，再冷却；然后按照重量比为1％的接种量将上述固体种子接入冷却后的发酵培养基中，充分搅拌混匀后，于28℃培养4～7天；在培养过程中，于20h时进行混匀振荡；所述发酵培养基同固体种子培养基。
作为上述α-半乳糖苷酶固体发酵生产方法的改进，在所述发酵步骤后进行后处理步骤将发酵步骤所得的产物于40℃～45℃的低温气流下干燥至水分重量含量为10％，粉碎后即得α-半乳糖苷酶制剂。
本发明所选用的保藏号为CGMCC No.1628的臭曲霉，本申请人已于2006-3-31申请了发明专利《臭曲霉菌株及其用途》，申请号200610050135.4；此次的发明内容是采用统计优化方法对上述臭曲霉的固体发酵产酶培养条件进行了系统优化，从而获得适合工业化生产的最佳培养条件和技术参数。
采用本发明的生产方法，菌株产α-半乳糖苷酶的水平是现有固体发酵条件下报道的8～15倍。该酶的最适作用温度为60℃，较国内报道的同类酶耐热；最适pH为5.0，在酸性环境下稳定性很高，易于应用。本发明采用粗料培养基作为发酵原料，具有工艺简单、酶活性高、单位酶活生产成本低廉等优点，为α-半乳糖苷酶的低成本化大规模生产提供依据。
具体实施例方式
实施例1、一种α-半乳糖苷酶生产方法，依次进行以下步骤1)、孢子悬液的制备
将保藏号为CGMCC No.1628的臭曲霉按照划线法接种到斜面培养基上，于28℃恒温培养7天，此时菌株已成熟；用无菌水洗下孢子振荡打散孢子，制成浓度为106～107个/ml的孢子悬液，待用；所述斜面培养基为PDA斜面培养基，即新鲜马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，蒸馏水1000毫升，pH自然。
2)、一级种子制备首先将液体种子培养基经121℃、20min灭菌，再冷却；然后按照体积比(V/V)为5％的接种量将孢子悬液接入上述冷却后的液体种子培养基中，于28℃、转速为200rpm的摇床上培养18h，得液体种子；所述液体种子培养基为PDA液体培养基，即新鲜马铃薯200克，葡萄糖20克，蒸馏水1000毫升，pH自然。
3)、α-半乳糖苷酶的发酵在250ml的三角瓶中装入为10g的干基，此10g干基由8.2137g麸皮、1.7843g豆粕、0.001g硫酸锰和0.001g五水硫酸铜组成。然后向瓶内加15g水，再用0.5M的磷酸氢二钠调pH至5.5～6.0，制成发酵培养基。
三角瓶的瓶口以6层纱布覆盖，将发酵培养基经121℃灭菌20min后，再冷却；然后按照1毫升/10克的接种量将上述液体种子接入冷却后的发酵培养基中，充分搅拌混匀后，于28℃培养4天。在培养过程中，当培养至20h时，振荡三角瓶，使得发酵培养基与液体种子均匀混和，然后静置直至发酵结束。
4)后处理将发酵结束后所得的产物于40℃～45℃的低温气流下干燥至水分重量含量为10％，粉碎后，包装成α-半乳糖苷酶制剂。
经测定，α-半乳糖苷酶为酶活为2207.19U/g干曲。
实施例2一种α-半乳糖苷酶生产方法，依次进行以下步骤1)、孢子悬液的制备将保藏号为CGMCC No.1628的臭曲霉按照划线法接种到斜面培养基上，于28℃恒温培养7天，此时菌株已成熟；用无菌水洗下孢子振荡打散孢子，制成浓度为106～107个/ml的孢子悬液，待用。所述斜面培养基为新鲜马铃薯-葡萄糖-琼脂制成的PDA斜面培养基，同实施例1。
2)、一级种子制备首先将液体种子培养基经121℃、20min灭菌，再冷却；然后按照体积比为5％的接种量将孢子悬液接入上述冷却后的液体种子培养基中，于28℃、转速为200rpm的摇床上培养18h，得液体种子。所述液体种子培养基为新鲜马铃薯-葡萄糖制成的PDA液体培养基；同实施例1。
3)二级种子制备在250ml的三角瓶中装入10g干基，此干基由8.2137g麸皮、1.7843g豆粕、0.001g硫酸锰和0.001g硫酸铜组成。向瓶内加15g水，再用0.5M的磷酸氢二钠调pH至5.5～6.0，得固体种子培养基。
三角瓶的瓶口以6层纱布覆盖，将上述固体种子培养基于121℃灭菌20min，再冷却；然后按照1毫升/10克的接种量将液体种子接入上述冷却后的固体种子培养基中，振荡、混匀后于28℃培养箱中培养4天，得固体种子。在培养过程中，当培养至20h时，振荡三角瓶，使得液体种子与固体种子培养基均匀混和，然后静置直至培养结束。
4)、α-半乳糖苷酶的发酵在500ml的三角瓶中装入为40g的干基，此干基由32.8548g麸皮、7.1372g豆粕、0.004g硫酸锰和0.004g五水硫酸铜组成。再向瓶内加60g水，再用0.5M的磷酸氢二钠调pH至5.5～6.0，制成发酵培养基。
瓶口以6层纱布覆盖，将发酵培养基于121℃灭菌20min，再冷却；然后按照重量比为1％的接种量将上述固体种子接入冷却后的发酵培养基中，充分搅拌混匀后，于28℃培养7天，在培养过程中，于20h时将培养基混匀振荡，然后静置发酵至结束。
5)、后处理将发酵步骤所得的产物于40℃～45℃的低温气流下干燥至水分重量含量为10％，粉碎后即得α-半乳糖苷酶制剂。
经测定，α-半乳糖苷酶为酶活为2352.74U/g干曲。
实施例3一种α-半乳糖苷酶生产方法，依次进行以下步骤1)、孢子悬液的制备同实施例2。
2)、一级种子制备同实施例2。
3)二级种子制备在500ml的三角瓶中装入40g干基，此干基由32.855g麸皮、7.137g豆粕、0.004g硫酸锰和0.004g硫酸铜组成。向瓶内加60g水，再用0.5M的磷酸氢二钠调pH至5.5～6.0，得固体种子培养基。
将培养天数改成6天，其余同实施例2。
4)、α-半乳糖苷酶的发酵
同实施例2。
5)、后处理同实施例2。
经测定，α-半乳糖苷酶为酶活为1928.24U/g干曲。
上述实施例中，酶的提取及活性测定方法如下将发酵步骤后所得的固体物用搅拌机搅拌均匀，称取1g左右，加入0.2M，pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在45℃的水浴摇床上振荡30min，滤纸过滤得粗酶液。用缓冲液稀释一定倍数以测定酶活。
α-半乳糖苷酶的测定如下将适当稀释的酶液0.1ml，加入pH 5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液0.05ml，10mmol/L对硝基苯α-D-半乳吡喃糖苷0.05ml，于50℃水浴条件下，反应10min，然后加入3.0ml的0.25mol/L的Na2CO3溶液终止反应，在400nm下OD值。
酶活力单位定义在pH5.0，温度为50℃的条件下，每分钟生成1μmol对-硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.α-半乳糖苷酶固体发酵生产方法，其特征包括以下步骤1)、孢子悬液的制备将保藏号为CGMCC No.1628的臭曲霉接种到斜面培养基上，于28℃恒温培养7天；再用无菌水制成浓度为106～107个/ml的孢子悬液，待用；所述斜面培养基为PDA斜面培养基；2)、一级种子制备首先将液体种子培养基经121℃、20min灭菌，再冷却；然后按照体积比为5％的接种量将孢子悬液接入上述冷却后的液体种子培养基中，于28℃、转速为200rpm的摇床上培养18h，得液体种子；所述液体种子培养基为PDA液体培养基；3)、α-半乳糖苷酶的发酵首先将发酵培养基经121℃、20min灭菌，再冷却；然后按照1毫升/10克的接种量将上述液体种子接入冷却后的发酵培养基中，充分搅拌混匀后，于28℃培养4～7天，在培养过程中，于20h时进行混匀振荡发酵培养基的步骤；所述发酵培养基由重量比为2∶3的干基和蒸馏水混和后、调pH至5.5～6.0制成，所述每100g干基由82.137g麸皮、17.843g豆粕、0.01g硫酸锰和0.01g五水硫酸铜组成。
2.根据权利要求1所述的α-半乳糖苷酶固体发酵生产方法，其特征是在所述发酵步骤后进行后处理步骤将发酵步骤所得的产物于40℃～45℃的低温气流下干燥至水分重量含量为10％，粉碎后即得α-半乳糖苷酶制剂。
3.α-半乳糖苷酶固体发酵生产方法，其特征包括以下步骤1)、孢子悬液的制备将保藏号为CGMCC No.1628的臭曲霉接种到斜面培养基上，于28℃恒温培养7天；再用无菌水制成浓度为106～107个/ml的孢子悬液，待用；所述斜面培养基为PDA斜面培养基；2)、一级种子制备首先将液体种子培养基经121℃、20min灭菌，再冷却；然后按照体积比为5％的接种量将孢子悬液接入上述冷却后的液体种子培养基中，于28℃、转速为200rpm的摇床上培养18h，得液体种子；所述液体种子培养基为PDA液体培养基；3)二级种子制备将固体种子培养基经121℃、20min灭菌，再冷却；然后按照1毫升/10克的接种量将液体种子接入上述冷却后的固体种子培养基中，于28℃培养箱中培养4～6天，得固体种子；所述固体种子培养基由重量比为2∶3的干基和蒸馏水混和后、调pH至5.5～6.0制成，所述每100g干基由82.137g麸皮、17.843g豆粕、0.01g硫酸锰和0.01g五水硫酸铜组成；4)、α-半乳糖苷酶的发酵首先将发酵培养基经121℃、20min灭菌，再冷却；然后按照重量比为1％的接种量将上述固体种子接入冷却后的发酵培养基中，充分搅拌混匀后，于28℃培养4～7天；在培养过程中，于20h时进行混匀振荡；所述发酵培养基同固体种子培养基。
4.根据权利要求3所述的α-半乳糖苷酶固体发酵生产方法，其特征是在所述发酵步骤后进行后处理步骤将发酵步骤所得的产物于40℃～45℃的低温气流下干燥至水分重量含量为10％，粉碎后即得α-半乳糖苷酶制剂。
全文摘要
本发明公开了一种α－半乳糖苷酶固体发酵生产方法，包括以下步骤1)孢子悬液的制备，2)一级种子制备，3)α－半乳糖苷酶的发酵。本发明还公开了同一发明构思下的另一种α－半乳糖苷酶固体发酵生产方法，包括以下步骤1)孢子悬液的制备，2)一级种子制备，3)二级种子制备，4)α－半乳糖苷酶的发酵。采用本发明的方法生产α－半乳糖苷酶，产酶活力高、工艺简单、易于生产应用。
文档编号C12R1/66GK1900277SQ20061005257
公开日2007年1月24日 申请日期2006年7月21日 优先权日2006年7月21日
发明者刘彩琴, 何国庆, 陈启和, 阮晖 申请人:浙江大学