专利名称：能催化吲哚生成靛蓝的P450BM－3Asp168His变体基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化工中的基因工程技术领域，尤其是涉及一种能催化吲哚生成靛蓝的P450BM-3Asp168His变体基因及其用途。
背景技术：
作为一种最早发现的天然染料之一，靛蓝染料的使用具有相当悠久的历史。从古埃及木乃伊穿着的一些服装到我国马王堆出土的蓝色麻织物等都是由靛蓝染成的。200多年前法国大革命和美国独立战争时的旗帜上也染有靛蓝的颜色。这种染料之所以能够长期、广泛地为人们所喜爱，是由于它在染着坚牢度和耐光坚牢度上都是其它染料无法比拟的，故常被称为“染料之王”。远古时代主要是从靛蓝植物如菘蓝、蓼蓝、木蓝等中获得。19世纪中叶，以纺织工业革命为先导的产业革命也促进染料的需求大幅度增加，当时虽然在东印度尤其是孟加拉一带开辟了数十万英亩良田用于种植靛蓝植物，然而仍无法满足印染业的需要，以致用化学方法合成染料的课题，已经摆在化学家面前。1897年西德BASF生产的合成靛蓝问世，它以生产简便、原料充足、纯度高、易贮运、使用方便等优点后来居上，迅速普及从而使得具有几千年历史的植物靛蓝黯然失色。本世纪60年代之后，天然靛蓝终于销声匿迹，退出了历史舞台。进入80年代之后，随着社会现代化程度的日益提高，环境保护和劳动保护意识逐渐普及，人们开始认识到了合成化学工业的一系列有损健康、污染环境的弊病。如合成靛蓝中使用的苯胺和邻苯二甲酸酐能导致人体急性和慢性中毒，对呼吸道和中枢神经及肝脏均有一定损害。到了20世纪，生物转化合成天然靛蓝开始引起了科学工作者的注意。生物转化生产靛蓝产生的有害废物比化学方法少，既节能又廉价，对保护自然环境，维持生态平衡等方面无疑都是具有重要意义的。因此很多研究者认为发展生物法生产靛蓝极具有前途的。
在P450酶系中，P450 BM-3是从巨大芽孢杆菌(B.megaterium)中发现的具有脂肪酸羟基化活性的P450酶，在NADPH和O2存在下，它具有快速催化链长大约为C12-C18的饱和脂肪酸的加单氧酶活性。在国外，德国斯图加特大学技术生化研究所R.D.Schmid领导的科研小组于2000年利用定向进化技术获得具有三个突变位点的P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)，他们发现这一突变酶能催化吲哚生成靛蓝。详见“Directed evolution ofthe fatty-acid hydroxylase P450 BM-3 into an indole-hydroxylatingcatalyst”《Chemistry-A European Journal》Li QS，Schwaneberg U，Fischer P，Schmid R D.2000，61531-1536。本专利发明人在先的专利申请CN200410089167.6和CN200410089174.6中也曾公开了在P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)的基础上利用易错PCR定向进化技术获得催化吲哚活性更高的变体酶，但提高程度有限，生物转化合成靛蓝的大规模产业化还有一定困难。
发明内容
本发明在具有三个突变位点的P450 BM-3(F87V/A74G/L188Q)变体基因的基础上，通过在168氨基酸位点进行饱和突变定向进化进一步提高了其催化活性。
一种能催化吲哚生成靛蓝的P450 BM-3Asp168His变体基因，利用饱和突变定向进化技术介导的随机突变，通过筛选获得，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，原P450 BM-3(F87V/A74G/L188Q)基因中的第168氨基酸位点的天冬氨酸的密码子突变为组氨酸的密码子。
本发明还提供了所述变体基因表达的变体酶在催化吲哚生成靛蓝中的应用。
本发明采用饱和突变定向进化技术进化P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)，在168氨基酸位点设计一对包含不确定突变位点的引物(正、反向)，对模板质粒pET28α(+)P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)退火后用Pfu聚合酶循环延伸使碱基在一定程度上随机错误引入获得突变基因文库，并通过一定的筛选方法获得一种变体基因，按此设计思想，通过在168氨基酸位点设计一对引物，这对引物在设计过程中在168氨基酸位点能够引入随机的突变，通过高保真度的Pfu聚合酶进行PCR扩增，然后转化到E.coliBL21中，涂布到到含有30μg/ml卡那霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养得到相应的突变体库。
从突变体库中挑选蓝色的活性克隆接种到200μL含有30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基的96微孔板中，37℃过夜培养，取40μL该过夜培养液加入到一个新的600μL含有30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基的1.2mL容积的96微孔板中，在37℃培养至OD600为0.5～0.7时，加入IPTG(终浓度0.5mmol/L)诱导并在30℃继续培养24h，4000r/min离心半个小时收获细胞，用300μL的pH7.5磷酸盐裂解缓冲液(0.1mg/mL溶解酶，1μg/mLDNAseI)重悬细胞，在37℃培育1h后，立即置于-80℃冷冻1h，室温解冻，4000r/min离心30min，吸取200μL的含有P450BM-3的上清液到一个新的96微孔分析板中，加入2μL100mmol/L吲哚底物(吲哚溶解在DMSO中)，在室温下培育10min，然后加20μL2mg/mL的NADPH启动反应，在670nm处在线监控吸收值的变化30min，筛选出活力高于原酶的菌株挑选出来并提取质粒进行全自动DNA测序，发现突变位点为Asp168→His。
本发明获得的变体酶对吲哚具有更高催化活力，通过酶动力学曲线的测定，与具有三个突变位点的P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)变体酶以及本专利发明人在先的专利申请CN200410089167.6和CN200410089174.6公开了的P450BM-3变体酶相比较，催化效率显著提高，具体上升了4倍之多。该变体基因的获得为为生物合成染料靛蓝提供了更加具有应用价值的新酶，同时为染料靛蓝的生物生产提供了更加广阔的应用前景。
具体实施例方式
饱和突变引物的设计和PCR扩增产物的获得上游引物5’-CAGCTTTTACCGANNNCAGCCTCATCC-3’下游引物5’-GGATGAGGCTGNNNTCGGTAAAAGCTG-3’向500μL的eppendorf管中加入100pmol的dNTPs，各15pmol的上游引物和下游引物，大约2ng pET28α(+)P450BM-3作为模板DNA，2.5U PfuDNA聚合酶，5μL的含有25mmol/L的MgCl2的Pfu PCR缓冲液，然后用无菌蒸馏水加至总体积50μL。反应参数是通过95℃变性1min后，在95℃ 30s，引物3948℃-56℃，2min；引物16850℃-56℃，2min，72℃ 16min，经过18个循环，然后72℃延伸2min，得到PCR扩增产物。
突变文库的构建将上述PCR扩增后的PCR产物用DpnI消化2小时后转化到E.coliBL21中，涂布到到含有30μg/ml卡那霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养得到相应的突变体库。
对吲哚具有高催化活性的变体基因的的筛选从突变体库中挑选蓝色的活性克隆接种到200μL含有30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基的96微孔板中，37℃过夜培养，取40μL该过夜培养液加入到一个新的600μL含有30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基的1.2mL容积的96微孔板中，在37℃培养至OD600为0.5～0.7时，加入IPTG(终浓度0.5mmol/L)诱导并在30℃继续培养24h，4000r/min离心半个小时收获细胞，用300μL的pH7.5磷酸盐裂解缓冲液(0.1mg/mL溶解酶，1μg/mL DNAseI)重悬细胞，在37℃培育1h后，立即置于-80℃冷冻1h，室温解冻，4000r/min离心30min，吸取200μL的含有P450BM-3的上清液到一个新的96微孔分析板中，加入2μL100mmol/L吲哚底物(吲哚溶解在DMSO中)，在室温下培育10min，然后加20μL2mg/mL的NADPH启动反应，在670nm处在线监控吸收值的变化30min，将吸收值高于亲本酶的突变体挑选出来再进行至少3次类似的筛选实验，筛选出活力高于原酶的菌株挑选出来并提取质粒进行全自动DNA测序，发现突变位点为Asp168→His。
催化吲哚生成靛蓝挑取含有P450BM-3Asp168His变体基因的阳性克隆接种到LB液体培养基中种子液为LB液体培养液，接种量1％-2％，培养基的体积为100毫升，PH7.0-7.5，摇床转速为150-200转\分钟，在37℃培养至OD0.5-0.7时加入IPTG(0.5-1.0um)诱导，然后将温度转为30℃继续培养24-48小时。在大肠杆菌中由于在色氨酸代谢途径中，色氨酸能够被大肠杆菌中的色氨酸酶催化成吲哚，而P450BM-3Asp168His能将吲哚催化成靛蓝，这样在发酵过程中就能产生大量的靛蓝，但生成靛蓝的量和P450 BM-3变体酶的活性有关，P450 BM-3变体酶的催化效率越高在同等培养条件下生物合成的靛蓝的量就越多。
将培养液以4000-80000转\分钟离心10-20分钟，放弃上清液，收获离心后的细胞。离心后的细胞用水冲洗2-3次，加入适量的四氢呋喃(THF)提取蓝色物质，1000-2000转\分钟离心保留上清液，用旋转蒸发仪干燥，再加入适量的乙醇提取蓝色物质中的靛玉红，剩下的即为靛蓝。
催化效率的测定将含有P450BM-3Asp168His变体基因的克隆接种到LB液体培养基中种子液为试管培养液，接种量1％-2％，培养基的体积为100毫升，PH7.0-7.5，摇床转速为150-200转\分钟，在37℃培养至OD0.5-0.7时加入IPTG(0.5-1.0μm)诱导，然后将温度转为30℃继续培养12小时。
再将培养液离心后，放弃上清液，收获离心后的细胞，在冰浴条件下超声破菌，再离心得到含有P450BM-3Asp168His变体基因的上清液，上清液采用金属鳌合亲和层析(IMAC)纯化，其中金属鳌合介质为Ni-NTA介质，并测定其催化吲哚的催化效率，其结果为500min-1·mM-1，是R.D.Schmid领导的科研小组获得的具有三个突变位点的P450BM-3(F87V/A74GL188Q)变体酶以及本专利发明人在先的专利申请CN200410089167.6和CN200410089174.6公开了的P450BM-3变体酶的4倍之多。
SEQUENCE LISTING<110>浙江大学<120>能催化吲哚生成靛蓝的P450BM-3Asp168His变体基因及其用途<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>3150<212>DNA<213>P450BM-3Asp168His<220>
<223>第168位的原天冬氨酸的密码子突变为组氨酸的密码子<400>1atgacaatta aagaaatgcc tcagccaaaa acgtttggag agcttaaaaa tttaccgtta60ttaaacacag ataaaccggt tcaagctttg atgaaaattg cggatgaatt aggagaaatc120tttaaattcg aggcgcctgg tcgtgtaacg cgctacttat caagtcagcg tctaattaaa180gaagcatgcg atgaatcacg ctttgataaa aacttaagtc aaggacttaa atttgtacgt240gattttgcag gagacgggtt agttacaagc tggacgcatg aaaaaaattg gaaaaaagcg300cataatatct tacttccaag cttcagtcag caggcaatga aaggctatca tgcgatgatg360gtcgatatcg ccgtgcagct tgttcaaaag tgggagcgtc taaatgcaga tgagcatatt420
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权利要求
1.一种能催化吲哚生成靛蓝的P450BM-3Asp168His变体基因，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的变体基因所表达的变体酶在催化吲哚生成靛蓝中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种能催化吲哚生成靛蓝的P450BM－3Asp168His变体基因，利用饱和突变定向进化技术介导的随机突变，筛选获得，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，原P450BM－3(F87V/A74G/L188Q)基因中的第168位的天冬氨酸的密码子突变为组氨酸的密码子。所得到的变体基因表达的变体酶通过酶动力学曲线的测定，与现有技术相比较，催化效率显著提高，为生物合成染料靛蓝提供了更加具有应用价值的新酶，同时为染料靛蓝的生物生产提供了更加广阔的应用前景。
文档编号C12N9/02GK1900285SQ20061005258
公开日2007年1月24日 申请日期2006年7月21日 优先权日2006年7月21日
发明者梅乐和, 李红梅 申请人:浙江大学