肠杆菌ly6在发酵生产吲哚乙酸上的应用及发酵液在农作物生根促长上的应用
【专利摘要】本发明为肠杆菌LY6在发酵生产吲哚乙酸上的应用及发酵液在农作物生根促长上的应用，给工业上提供一种新方法。所述的肠杆菌LY6其拉丁文名Enterobacter sp.，2014年8月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO 9539。培养基及培养条件简单，操作简便，生产成本低，吲哚乙酸产率高。含吲哚乙酸的发酵液在农作物生根促长上的应用，所述农作物为水稻、小麦、玉米、油菜、蔬菜、水果，在农作物催芽、生根及种植过程中施用含吲哚乙酸的发酵液，可有效促进作物发芽、生根及生长，减少化肥使用量，增加作物产量。CGMCC No.953920140825
【专利说明】肠杆菌LY6在发酵生产吲哚乙酸上的应用及发酵液在农作物 生根促长上的应用
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技术领域： 本发明涉及植物生理活性物质的微生物发酵制备领域，具体涉及微生物新菌株发酵生 产吲哚乙酸的方法以及吲哚乙酸发酵液的应用方法。
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【背景技术】： 吲哚乙酸(indole-3-acetic acid)是天然植物生长素的主要活性成分，参与植物发育 的诸多过程。微生物可通过分泌吲哚乙酸促进植物生长。IAA可增加植物根的大小及分布， 有利于根从土壤中吸收更多的营养物质。产生植物激素是微生物与宿主植物相互作用的主 要机制之一。在外添加 L-色氨酸的条件下，Klebsiella planticola能产生85.5 yg/mL的 IAA，能显著增加菜豆根长和根量，并能在低温条件下刺激黄瓜种子萌发和根的发育。 Arthrobacter pascens ZZ21耐盐碱，解磷，并能降解焚蒽，既能分泌IAA促进作物生长，又 能修复土壤污染。对具有分泌IAA能力的微生物进行研究，提高IAA产率，放大生产，有利于 将植物促生细菌应用于农业生产。
[0003] 在微生物中，色氨酸是其IAA生物合成途径的前体物质。IAA的生物合成途径，以 IAA合成的中间体命名，可分为吲哚丙酮酸途径、吲哚乙酰胺途径、色氨酸侧链途径、色胺途 径和吲哚乙睛途径等5种IAA的生物合成途径，而且在一种细菌中可能存在者不止一条的 IAA合成途径。
[0004] 许多因素，如温度、pH值及营养成分都会影响细菌IAA的合成。实验证明，一种特定 的微生物会根据其所处的环境条件，从其能够合成IAA的几种途径中选择一种来合成IAA， 如Rhizobium在与宿主植物作用时通过吲噪乙酰胺途径合成IAA，而自生状态的Rhizobium 通过Π 引噪丙酮酸途径合成IAAl.fluorescens CHAO在pH值偏酸性时优先利用色氨酸侧链 途径合成IAA。酸性环境对Pseudomona的一些种不仅会通过抑制细菌生长而导制生长素合 成总量的降低，还会降低单个细胞的IAA产量。另外葡萄糖的浓度也会影响IAA合成，高于或 低于最适量时都会使IAA产量降低。Escherichia sp. wz-1977以葡萄糖为底物时以合成菌 体蛋白为主，以果糖为底物时以生成吲哚为主。尽管色氨酸可以提高IAA的产量，而色氨酸 的合成前体，邻氨基苯甲酸对IAA的合成有抑制作用。因此IAA的合成是由色氨酸和邻氨基 苯甲酸这两个化合物参与的精细的调控机制，即邻氨基苯甲酸抑制IAA合成，色氨酸反馈抑 制邻氨基苯甲酸合成酶(催化分支酸转化为邻氨基苯甲酸）。通过抑制邻氨基苯甲酸的合 成，色氨酸间接的诱导了 IAA合成。
[0005] 目前，国内外对于产吲哚乙酸的微生物菌株种类较多，且合成吲哚乙酸的代谢途 径亦基本探明，但未进行微生物发酵合成吲哚乙酸的生产放大，未进行发酵过程工艺参数 及培养基成分的探索设计。
[0006] 微生物合成吲哚乙酸，一方面，可减少调节剂化学合成过程的环境污染；另一方 面，发酵液中含有丰富的营养物质，易被植物吸收，在吲哚乙酸促进细胞分裂的同时保证养 分吸收，实现"调节剂-养分"的协同作用，对作物抗逆增产起积极作用。
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【发明内容】
： 本发明的目的在于提供一种微生物新菌株在在发酵生产吲哚乙酸上的应用及发酵液 在农作物生根促长上的应用。
[0008] 本发明是这样实现的： 肠杆菌LY6在发酵生产π引噪乙酸上的应用。所述的肠杆菌LY6其拉丁文名Enterobacter sp.，2014年8月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市 朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC N0 9539。
[0009] 所述的肠杆菌LY6在发酵生产吲哚乙酸上的应用，选用最适培养基及培养条件，培 养基成分由以下重量百分比计:胰蛋白胨〇.5-1%、酵母膏0.3-0.5%、NaCl 0.5-1%、葡萄糖 0.25-5%、水lL、pH 7.2;121°C灭菌20min以后冷却至37°C，接种肠杆菌菌株LY6,通气发酵 12h以后补加下列物质：果糖0.5-l%、L-色氨酸0.08-0.2%、丙酮酸钠 0.01-0.03%、硫酸铜 0 ·01%;维持温度35-37°C、pH7 · 0-7 · 5、搅拌速度 140-180r/min、发酵罐压力0 · 05-0· 08Mpa、 溶氧30-80mg/kg，发酵36-48h。发酵结束后加入稳定剂，即成为含吲哚乙酸450.8-812.6mg/ kg的发酵液。
[0010]所述的含吲哚乙酸的发酵液在农作物生根促长上的应用。
[0011] 所述的含吲哚乙酸的发酵液在农作物生根促长上的应用，所述农作物为水稻、小 麦、玉米、油菜、蔬菜、水果，在农作物催芽、生根及种植过程中施用含吲哚乙酸的发酵液，可 有效促进作物发芽、生根及生长，减少化肥使用量，增加作物产量。
[0012] 本发明提供的肠杆菌LY6发酵生产吲哚乙酸的方法，培养基及培养条件简单，操作 简便，生产成本低，吲哚乙酸产率高，易于大规模生产，节能环保，经济和社会效益巨大。
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【具体实施方式】： 实施例1: 肠杆菌LY6在发酵生产吲哚乙酸上的应用，具体操作如下： 1、材料及设备 菌株:肠杆菌LY6其拉丁文名Enterobacter sp.，2014年8月25日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0 9539。该肠杆菌的发明专利申请已 经于2015年6月10日被中国专利局公布。
[0014] 发酵设备:发酵罐及发酵控制系统。
[0015] 2、操作方法及步骤 (1)种子液制备:将肠杆菌(Enterobacter sp. )LY6斜面菌株接种到LB液体培养基中， 35 °C、150r/min振荡培养，待菌液在600nm波长下吸光度达0.7时，按3%接种量(V/V)接种到 装有LB液体培养基的种子发酵罐中，35°C，搅拌速度180r/min，通无菌空气进行发酵，发酵 7h，菌液为二级种子液。LB培养基成分为：胰蛋白胨10 g·!/1，酵母膏5 g.I/SNaCl 10 g · L-SpH 7.2〇
[0016] (2)接种及发酵:将发酵所用培养基121°C灭菌20min以后冷却至37°C，将二级种子 液接种到已经灭菌冷却的发酵所用培养基中（发酵所用培养基成分如下，按重量百分比计： 胰蛋白胨0.8%、酵母膏0.4%、NaCl 0.7%、葡萄糖2%、水lL、pH 7.2)，通气发酵1211以后补 加下列物质：果糖〇 . 7%、L-色氨酸0.12%、丙酮酸钠0.02%、硫酸铜0.01%;维持温度36°C、 pH7 · 2、搅拌速度160r/min、发酵罐压力0 · 07Mpa、溶氧50mg/kg，发酵40h。发酵结束后加入稳 定剂，即成为含吲哚乙酸575. 2mg/kg的发酵液。
[0017] 实施例2: 含吲哚乙酸的发酵液在促进作物生长上的应用，具体操作如下： 1、 材料 菌株:肠杆菌(Enterobacter sp.)LY6 生根材料:葡萄扦插条 种植介质:珍珠岩:砂为重量比4:1的混合物 种植容器:容积为2升的栽培盆 2、 操作方法及步骤 (1)含吲哚乙酸的发酵液菌液制备：同实施例1。
[0018] (2)葡萄扦插条的装备：用枝剪将葡萄枝条芽点剪为锲形，向上第二个芽点以上 2cm出剪断，为一个扦插条。
[0019] (3)处理：用高效液相色谱测定含吲哚乙酸的微生物菌液中吲哚乙酸含量，将菌液 依次稀释成吲哚乙酸浓度为1、5、10、15、20mg/kg的使用液剂(简称FIAA)，并配制相同浓度 的化学合成的吲哚乙酸(简称CIAA)，同时设置不做清水为阴性对照，灭菌的发酵所用培养 基为阳性对照。每个浓度及处理设置三根扦插条。将扦插条放入上述所设置的液体中，浸泡 基部5h后插入介质中，保持介质湿润。30d后取出插条观察插条基部愈伤组织诱导及生根情 况，并测定每组处理三根扦插条根鲜总重。
[0020] 结果如下表：
根据上述试验效果表明，本发明提供的肠杆菌(Enterobacter sp. )LY6具有很强的产 生吲哚乙酸的能力，发酵后含吲哚乙酸的发酵液能促进作物生长，特别诱导根的生长，与化 学合成的吲哚乙酸效果相当，甚至优于化学合成的吲哚乙酸效果。因此，在促进作物生长方 面具有良好的应用前景。
[0021] 上述实施例是对本发明的上述内容作进一步的说明，但不应将此理解为本发明上 述主题的范围仅限于上述实施例。凡基于上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【主权项】
1. 肠杆菌LY6在发酵生产吲哚乙酸上的应用，所述的肠杆菌LY6其拉丁文名 Enterobacter sp.，2014年8月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏号为CGMCC NO 9539。2. 根据权利要求1所述的肠杆菌LY6在发酵生产吲哚乙酸上的应用，其特征在于选用最 适培养基及培养条件，培养基成分由以下重量百分比计:胰蛋白胨〇.5-1%、酵母膏0.3_ 0.5%、NaCl 0.5-1%、葡萄糖 0.25-5%、水lL、pH 7.2;121°C灭菌20min以后冷却至37°C，接种 肠杆菌菌株LY6,通气发酵12h以后补加重量百分比计下列物质：果糖0.5-l%、L-色氨酸 0.08-0.2%、丙酮酸钠0.01-0.03%、硫酸铜0.01%;维持温度35-37°(：4!17.0-7.5、搅拌速度 140-180r/min、发酵罐压力0 · 05-0 · 08Mpa、溶氧30-80mg/kg，发酵36-48h，发酵结束后加入 稳定剂，即成为含吲噪乙酸450.8-812.6mg/kg的发酵液。3. 含吲哚乙酸的发酵液在农作物生根促长上的应用。4. 根据权利要求3所述的含吲哚乙酸的发酵液在农作物生根促长上的应用，其特征在 于所述农作物为水稻、小麦、玉米、油菜、蔬菜、水果，在农作物催芽、生根及种植过程中施用 含吲哚乙酸的发酵液，可有效促进作物发芽、生根及生长，减少化肥使用量，增加作物产量。
【文档编号】C12R1/01GK105838750SQ201610184685
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月29日
【发明人】王强锋, 侯勇, 朱彭玲, 夏中梅, 曾芸, 王赟, 黄秀辉, 曾显斌
【申请人】四川省兰月科技有限公司