取代的咔唑-吲哚磺酸盐衍生物及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于有机化学领域，具体设及取代的巧挫-吗I噪横酸盐衍生物及其制备方 法和用途。
【背景技术】
[0002] s〇2长期W来被广泛的认作是重要的大气污染物。长时间暴露在s〇2环境中不仅会 遭受呼吸系统疾病，而且会导致肺癌、屯、血管疾病、脑神经失调等。在自然界中，S〇2通常W 亚硫酸根（S〇32 )和亚硫酸氨根化S〇3)形式存在。亚硫酸钢和亚硫酸氨钢在工业上经常被 用作食品、饮料和药物的添加剂，用W防止在储存过程中氧化变质和变色等。然而一定量的 亚硫酸盐和亚硫酸氨盐会导致哮喘和过敏进而导致呼吸困难、等麻疹、胃肠道疾病等。线粒 体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，也是细胞生成ATP的主要场所，在细胞内起着能量供 应站的作用。除了为细胞供能外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞调亡等 过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。研究表明，线粒体内S化能明显减弱屯、肌氧 耗的损伤，但细胞内非正常浓度的S化可能诱导癌症，屯、血管疾病W及神经性障碍等疾病。
[0003] 作为一种优秀的检测器，巧光检测法W其高选择性、高灵敏度W及能在活细 胞和组织内实时和高时空分辨率成像，广泛应用于生命科学和材料科学领域。由于 线粒体具有双层膜结构，质子在线粒体内膜的迁移导致线粒体膜内外电势差可W达 到-180mV。因而，一些带正电荷的化合物能进入线粒体内，相继有线粒体祀向的巧光探 针的报道问世[参见：（a)S.C.Dodani,S.C.Leary,P.A.Cobine,D.R.Winge,C.J.Chang,J AmChemSoc. , 2011, 133, 8606 ； (b)Z. -P.Liu,C. -L.Zhang,Y. -C.Chen,W. -J.He,Z. -J. 加o,QiemCommun. , 2012, 48, 8365-8367 ; (c)B.A.DNeto,J.R.Correa,R.G.Silva,RSC Adv. , 2013, 3, 5291-5301 ； (d)N.Jiang,J. -L.Fan,T.Liu,J. -F.Cao,B.Qiao,J. -Y. Wang,化emCommun.，2013, 49, 10620-10622 ; (e)J. -T.Hou,M. -Y.Wu,K.Li,J.化ng,K. -K. 化，Y. -M.Xie,ChemCommun.，2014, 50, 8640-8643 ; (f)M. -Y.Wu,K.Li,Y. -H.Liu,K. -K. 化，Y. -M.Xie,X. -D.Zhou,X. -Q.化，Biomaterials.，2015, 53, 669-678.]。然而检测线粒体 内S〇2巧光染料鲜有报道[参见：（a)W.Xu,C.L.Teoh，J. -J.Peng,D. -D.Su，L.化an,Υ.Τ.C hang,Biomaterials.，2015, 56, 1-9 ; (b)Y.Liu,K.Li,M. -Y.Wu,Y. -H.Liu,Y. -M.Xie,X.-化 化，化em.Commun.，2015, 51，10236-10239.]。且运些探针都存在明显的缺点即水溶性差， 灵敏度有待进一步提高，不利于在细胞环境中检测，限制了其进一步的生物学用途和工业 用途。因此，设计合成水溶性巧光染料，用来检测线粒体内S〇2具有极其重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的第一个问题是提供一种取代的巧挫-吗I噪横酸盐衍生物，其结构 式如式I所示： 阳0化]
[0006] 其中，Ri与R2环合形成6~18元芳基。
[0007]作为本发明优选的方案，Ri与R2环合形成6~12元芳基。
[0008]优选的，Ri与R2环合形成6或10元芳基。
[0009] 进一步优选的，所述的取代的巧挫-吗I噪横酸盐衍生物为
或
[0010] 最优的，所述的取代的巧挫-吗I噪横酸盐衍生物为
[0011] 本发明还提供了上述取代的巧挫-吗I噪横酸盐衍生物的制备方法，其反应式如 下：
[0012]
阳01引其中，Ri与R2环合形成6~18元芳基。
[0014] 上述取代的巧挫-吗I噪横酸盐衍生物的制备方法包括W下步骤： 阳01引曰、将N-甲基巧挫溶于DMF(N，N-二甲基甲酯胺），然后加入P0Cl3(Ξ氯氧憐），升 溫至125°C，在氮气保护，反应比，制备得到中间体1 ;
[0016] b、原料1与环丙横酸内醋在甲苯中回流制备得到中间体2 ;
[0017] C、将中间体1与中间体2在乙醇中回流反应，加入乙酸锭催化，制备得到取代巧 挫-吗I噪横酸盐衍生物。
[0018] 其中，上述取代的巧挫-吗I噪横酸盐衍生物的制备方法中步骤a所述的DMF是无 水DMF。
[0019] 其中，上述的取代的巧挫-吗I噪横酸盐衍生物的制备方法中步骤a所述Ξ氯氧憐 与N-甲基巧挫的摩尔比为1:1. 4~1.8 ;所述DMF与N-甲基巧挫的摩尔比为2~4:1。
[0020] 其中，上述的取代的巧挫-吗I噪横酸盐衍生物的制备方法中步骤b所述原料1与 环丙横酸内醋的摩尔比为1:1. 3~1. 6。
[0021] 其中，上述的取代的巧挫-吗I噪横酸盐衍生物的制备方法中步骤C所述乙酸锭的 用量为中间体1的2倍当量。
[0022] 其中，上述的取代的巧挫-吗I噪横酸盐衍生物的制备方法中步骤C所述中间体1 与中间体2的摩尔比为1:1. 1~1. 2。
[0023] 本发明还提供了上述取代的巧挫-吗I噪横酸盐衍生物在定量检测线粒体内S〇2浓 度中的用途。
[0024] 本发明利用N-甲基巧挫-3-甲醒和取代的吗I噪横酸盐共辆，设计合成了一种水溶 性的检测线粒体内s〇2浓度的巧光染料。本发明通过在含有线粒体祀向基团的取代吗I噪中 引入横酸盐，使得整个化合物的水溶性更好，完全满足生物实验的需求。此外，本发明提供 的取代的巧挫-吗I噪横酸盐衍生物具有毒副性小、灵敏度高、原料简单易得、整条合成路线 可操作性强、反应条件溫和、总体成本较低等优势，和现有的定量检测线粒体内s〇2的巧光 染料相比，无疑更有市场竞争力。
【附图说明】
[0025]图1化合物3在水中的紫外吸收和巧光发射图。其中，a、b图分别为化合物 3 (10μM)加入服〇3(100μM)反应前后的紫外和巧光变化图。a图中表明，化合物3本身最 大吸收在506nm，加入服化后，化合物3的最大吸收峰明显减弱，在266nm和320nm出现两 个新峰；b图中表明，化合物3最大发射波长为625nm，加入HS化后，最大发射波长处的巧光 强度明显减弱，而463nm处的巧光明显增强。
[00%] 图2化合物3在水中的选择、干扰图。其中，黑色条框代表化合物3在水中加入各 种阴离子反应前后图；白色条框代表化合物3在水中加入各种阴离子和HS03反应前后图。 黑色条框表明，化合物3仅仅在加入S〇32 /服〇3后，巧光才发生明显的变化；白色条框表明， 化合物3在加入阴离子和服〇3时，巧光强度也发生明显的变化，且与仅仅加入服〇3时的巧 光强度基本相同。
[0027] 图3化合物3和市售线粒体巧光探针Mito-Tracker DeepRed在化La细胞中共同 解化后的共聚焦巧光成像图。其中，a图为化合物3的巧光成像图（488nm激发，540~680nm 收集）；b图为Mito-Tracker DeepRed的巧光成像图化38nm激发，700~780nm收集）；c 图为a图和b图的叠加图；d图为a的明场图；e图为共定位相关性图。
[0028] 图4化合物3对化La细胞中内源性S〇2的成像图。其中，a和e:细胞在加 入S〇2donor(2, 4-二硝基苯横酷节胺）刺激前后的蓝色巧光通道图；b和f:细胞在加入 SOzdonor刺激前后的绿色巧光通道图；i和j:细胞在先加入ImMNEM(N-乙基顺下締二酷亚 胺）后，再加入SOzdonor刺激的蓝、绿色巧光通道图；C，g和k:蓝绿巧光通道图的叠加图； d，h和1 :曰，e和i的明场图；m:体外校正曲线；η 组细胞中的学生t-检验统计分析。
[0029] 图5化合物3的MTT细胞毒性实验图。
【具体实施方式】
[0030] 取代的巧挫-吗I噪横酸盐衍生物的制备方法包括W下步骤：
[0031] a、将N-甲基巧挫溶于无水DMF，然后加入Ξ氯氧憐，升溫至125°C，在氮气保护，反 应比，制备得到中间体1 ;所述Ξ氯氧憐与N-甲基巧挫的摩尔比为1:1. 4~1. 8,N，N-二甲 基甲酯胺与N-甲基巧挫的摩尔比为2~4:1。 阳03引 b、原料1与环丙横酸内醋在甲苯中回流制备得到中间体2 ;所述1，1，2-Ξ甲基苯 并[e]吗I噪与环丙横酸内醋的摩尔比为1:1.3~1.6。 阳03引 C、将中间体1与2在乙醇中回流反应，加入乙酸锭催化，制备得到取代巧挫-吗I噪 横酸盐衍生物；所述乙酸锭的用量为中间体1的2倍当量；所述中间体1与2的摩尔比为 1:1. 1 ~1. 2。
[0034] 在合成中间体1的过程中，通过实验发现，反应时间过长，会有很多杂点产生，控 制反应时间为比左右，反应产率较高。未反应的N-甲基巧挫原料可W通过柱层析色谱回 收，回收产率较高。
[0035] 在合成取代的巧挫-吗I噪横酸盐衍生物的过程中，由于产物在甲醇中的溶解性较 差，可W利用重结晶的方法得到产物，产率较高。
[0036] 本发明实施例中，化La细胞株购于ATCC(美国标准培养物收藏所），10 %胎牛血 清购于Hyclone公司，DMEM(H)培养基购于美国Gibco公司，线粒体染料Mito-Tracker DeepRed购自于LifeTechnologies公司。
[0037] 实施例IN-甲基巧挫-3-甲醒（中间体1)的合成：
[0038]
[0039] 将3.OOgN-甲基巧挫（16. 55mmol)溶于12血DMF，然后加入3血Ξ氯氧憐。反应 升溫至125°C，在氮气保护下，反应比，趁热倒入