专利名称：细菌铜抗性基因,含其的重组载体和其制备和表达的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体地，涉及沙雷氏菌编码铜抗性的基因，DNA序 列和推导的氨基酸序列，以及抗性蛋白的异源表达，涉及含有该基因的重组质粒和 表达该抗性基因的重组菌株，以及它们的制备和表达方法。
背景技术：
虽然重金属自然地出现在某些生态系统中，但其工业应用弓l起许多严重的环境 问题，因此重金属对环境的污染和治理日益受到重视，而金属抗性细菌的有效利用 则可以从污染的环境中去除金属。因it树于重金属抗性调控的理解，将有助于处理 生物废弃物和评估工业活动对自然生态系统的影响。
铜是一种重要的微量金属，在细胞的生理中扮演重要的角色，它也是呼吸作用 中一系列酶的重要辅基。但是，超过一定浓度时则对细胞具有毒性，高浓度的铜离 子主要通过产生高活性的自由基损伤DNA、破坏膜结构及使酶失活。因此，为了保 护细胞免受高浓度重金属毒害，细菌利用一系列抗性机制如渗透屏障、胞内及胞 外多价螯合、外流泵、酶脱毒和还原系统保护自身免受铜的毒害，并确保满足其营 养要求。
克隆抗性基因，重金属抗性机理研究的前提，同时，对克隆到的抗性基因进 行改造，不仅可以为探讨细菌重金属抗性机理提供一定的理论依据，还可以为重金 属污染地域的生物修复技术的开发和应用提供理论研究和应用基础。
发明内容
本发明旨在提供一种铜抗性基因和该基因的DNA序列和推导的氨基酸(图1)，
以及铜抗性蛋白的异源表达(图2 )。
本发明的另一目的在于提供一种铜抗性基因的重组表达质粒和重组菌株。 含有上述DNA序列的重组质粒pUC118-Cul和pET28a-Cul，以及利用载体
pET28a-Cul转化的重组大肠杆菌BL21 (DE3) -pET28a~Cul 。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案铜抗性基因，它的DNA序列如附图1所示。 铜抗性基因，它的氨基酸序列如附图1所示。
所述的铜抗性基因，其由雷氏菌属(5^ra^a sp. ) KMR-3菌株产生，基因序 列全长l，117bp，推导的抗铜蛋白由194个氨基酸编码，为CutF蛋白，分子量为约 22KDa，理论pl值为5.30;与莫氏耶尔森氏菌(re/^z'/7j'a肥7/are"力ATCC 43969 铜抗性脂蛋白NlpE同源性最高，达70 % 。
包括权利要求1的DNA序列的重组载体pUC118-Cul。
包括权利要求1的DNA序列的重组载体pET28a-Cul 。
利用重组载体pET28a-Cul转化的重组大肠杆菌BL21 (DE3) -pET28a-Cul。
上述的铜抗性基因、重组载体、重组菌株的制备方法，提取粘质沙雷氏 菌KMR-3菌株的染色体DNA，用限制性内切酶fe〃3A I进行部分酶切，胶回收酶切 产物，并与pUC118勘/zHI/BAP载体连接，连接产物经乙醇沉淀，电转化￡ DH5 ，涂布含氨节青霉素的LB平板，成功构建基因组DNA文库；在含有氨苄青雾 素和铜离子的选择性平板上筛选重组子，从重组质粒pUC118-Cul中分离出含铜抗 性基因的DNA片段，经限制性内切酶酶切，获得如图1所示的DNA;设计引物扩增 铜抗性基因，与pET28a载体连接并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得重组质粒 pET28a-Cul和含重组表达质粒的重组菌株大肠杆菌BL21 (DE3) -pET28a-Cul 0
本发明禾佣从昆明冶炼厂周围废水中分离到的一株对铜离子具有高抗性的沙 雷氏菌属(&rra"a sp. ) KMR-3菌株，其保藏号为CQMCC No. 2636。通过在 大肠杆菌DH5中构建该菌的基因组DNA文库，克隆到了与铜抗性相关的基因。克 隆到的铜抗性基因所编码的蛋白属于CutF蛋白，由194个氨基酸编码，与莫氏耶 尔森氏菌(7eT^'7W'a 7z^7are"力ATCC 43969铜抗性脂蛋白NlpE同源性最高，达到 70%。通过常规方法获得含有铜抗性基因的重组质粒，转化大肠杆菌菌株成功表达 了编码铜抗性基因的蛋白。
此外，通过分子生物学手段，可将本发明涉及的铜抗性基因克隆到其他应用于 污水处理的菌株中去，从而提高其对铜的耐受性进而达到富集、转化等去除重金属 离子的自的。本发明涉及的沙雷氏菌属(5fe7Ta"a sp. ) KMR-3菌株己经于2008年8月26 日在"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心"(中国北京)保藏， 保藏号为CGMCC No. 2636。
本发明的具体技术步骤如下提取沙雷氏菌属KMR-3菌株染色体DNA，用限制 性内切酶5k/3AI进行部分酶切。胶回收酶切产物，并与pUC118 Aa/zHI/BAP载体 连接。连接产物经乙醇沉淀，电转化S co力'DH5 ，涂布含氨苄青霉素的LB平板， 成功构建基因组DNA文库。在含有氨苄青霉素和铜离子的选择性平板上筛选重组子。 从重组质粒pUC118"Cul中分离出含铜抗性基因的DNA片段，经限制性内切酶酶切， 获得如图1所示的DNA。筛选到与铜抗性相关的基因，提取质粒转化￡ coh'后， 其对铜的耐受性由160mg/L提高到了 300mg/L，因此克隆到的铜抗性基因具有应用 于污水处理的潜力。测序表明克隆到的铜抗性基因由194个氨基酸编码，分子量 约为22KDa。设计弓卿扩增铜抗性基因，与pET28a载体连接并转化大肠杆菌 BL21(DE3)菌株，获得重组质粒pET28a^Cul和含重组表达质粒的重组菌株大肠杆 菌BL21(DE3)-pET28a-Cul。在IPTG诱导下，在大肠杆菌中进行了高效表达(图2)。
本发明克隆到的铜抗性基因，与莫氏耶尔森氏菌(^7^'m'a //^^re"力ATCC 43969铜抗性脂蛋白NlpE同源性最高，达到70%。利用软件进行了该蛋白的细胞 内定位分析。通过分析发现，该抗铜蛋白平均分布于胞质、质膜、周质、外膜和胞 外。而已知的文献报道表明，A "h'的CutF蛋白为外膜脂蛋白，参与铜离子的外 流及运输铜离子至铜依赖性的酶。研究表明NlpE(CutF)是一种新的外膜脂蛋白E， 而且NlpE是有关外膜脂蛋白参与信号转导及激活lysopho印holipids的第一个例 子。
'目前，很多研究表明NlpE参与感应细胞与非生物表面的结合，并通过激活 Cpx双层组分系统来传递信号；NlpE可能参与感应细胞与疏7j^面接触时发生的外 膜损失，并传递信号给Cpx途径；NlpE还监控包膜的完整性；消除周质中异常蛋白， 修复N饥饿中的氨基酸；感应外膜的压力，介导信号至细胞质膜上的传，激酶
CpxA。本发明所克隆到的CutF蛋白虽然与NlpE有很高的同源性，但在很多性质上 与NlpE仍有所不同，尤其从分布来看，NlpE分布于外胞膜，主要担当信号传导的作用，而CiitF却无明显的跨膜区，它更象一个胞质蛋白，但它如何参与了细菌的 铜抗性仍需作进一步的研究。
如上所述，本发明涉及的铜抗性基因及其编码的蛋白主要特征如下
(1) 沙雷氏菌属(5brra"a sp. ) KMR-3菌株产生。
(2) 由194个氨基酸编码，分子量约为22KDa。与莫氏耶尔森氏菌(^^im's 啦Ware"i) ATCC 43969铜抗性脂蛋白NlpE同源性最高，达到70%。
(3) IPTG诱导下，在大肠杆菌中进行了高效表达。
图1克隆的铜抗性基因序列及推导的氨基酸序列； 图2抗性蛋白在大肠杆菌中表达图。
其中M—-蛋白Marker; 1-—BL21(DE3)-pET28a对照菌株IPTG诱导前；2-一 BL21 (DE3) -pET28a对照菌株IPTG诱导后；3-— BL21 (DE3) -pET28a~Cul重组菌株 IPTG诱导前；4--- BL21 (DE3) -pET28a~Cul重组菌株IPTG诱导后。
具体实施例方式
下面结合附图，用实施例^it一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限 定本发明。
实施例l:
沙雷氏菌属(6"erraz^s sp. ) KMR-3菌株铜抗性基因克隆和鉴定 从昆明冶炼厂周围废水中分离到的一株对铜离子具有高抗性的沙雷氏菌属 (6"erra"a sp. ) KMR-3菌株。该沙雷氏菌属(6"erra"a sp. ) KMR-3菌株己经于 2008年8月26日在"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心"(中国北 京)保藏，保藏号为CGMCC No. 2636。
基因组DNA文库的构建沙雷氏菌属(&r—ra"asp. ) KMR-3菌株基因组总DNA 的提取(F.奥斯伯等，精编分子生物学实验指南，北京科学出版社，1999)。用 限制性内切酶6k/3Al部分酶切基因组总DNA，胶回收酶切产物，与pUC118^/tH I /BAP载体连接，连接产物转化￡ "〃 DH5 。涂布含氨节青霉素的LB平板， 该基因组DNA文库的覆盖率达到99. 9%，为有效文库，成功构建了该菌的基因组DNA文库。在含有氨苄青霉素和铜离子的选择性平板上筛选重组子。
铜抗性基因的鉴定利用PCR扩增和双酶切方法鉴定重组子。对CaCl2法转化 ￡ WDH5后在选择性平板上生长的菌落在LB液体培养基中进行培养，用博大 泰克试剂盒抽提质粒。以Mu (RV/M4)为引物，通过PCR扩增检测转化产物，弓胸 序列如下M13 (MO: 5' "GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAA-3' ， M13 (RV): 5' -ATTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3'。进一步通过双酶切检测插入片断的大小。PCR 扩增结果与双酶切结果一致，插入片断的大小约为1. 2 kb。
筛选到与铜抗性相关的基因，提取质粒转化A coW后，其对铜的耐受性由 160mg/L提高到了 300mg/L，因此克隆到的铜抗性基因具有应用于污水处理的潜能； 还可将本发明涉及的铜抗性基因克隆到其他应用于污水处理的菌株中去，从而提高 其对铜的耐受性进而达到富集、转化等去除重金属离子的目的。
实施例2:
铜抗性蛋白的异源表达
铜抗性基因分析测序表明铜抗性基因序列全长l,117bp，推导的抗铜蛋白由
194个氨基酸编码，为CutF蛋白。该蛋白的推算分子量为约22KDa，理论pl值为 5.30。通过分析发现，该抗铜蛋白平均分布于胞质、质膜、周质、外膜和胞外。而 已知的文献报道表明，A coh'的CutF蛋白为外膜脂蛋白，参与铜的外流及运输铜 离子至铜依赖性的酶。利用Blast (Ve:r2. 2. 14)序列同源性比对表明其与莫氏耶尔 森氏菌()fe2^'/2j'a/z7a^are"力ATCC 43969铜抗性脂蛋白NlpE同源性最高，为70%。 铜抗性基因的亚克隆根据测序结果，设计引物(分别含有謝el和J力oI的 酶切位点)，通过PCR扩增铜抗性基因。目的片段大小约为600bp，通过1%琼脂糖 凝胶电泳检测片段的大小，胶回收目的片段。pET28a质粒和胶回收的铜抗性基因的 目的片段同时用两种限制性内切酶(蕭el和J力o1)进行酶切。胶回收酶切产物， 并用T4 DNA连接酶进纟，接。连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，相应 地获得一系列重组大肠杆菌菌株。通过PCR扩增和双酶切鉴定重组子。结果一致表 明铜抗性基因已成功亚克隆到pET28a质粒上。含有重组质粒pET28a-Cul的重组 大肠杆菌称为大肠杆菌BL21 (DE3) -Cul菌株。铜抗性蛋白的异源表达将通过PCR扩增和酶切鉴定的重组大肠杆菌
BL21 (DE3) -pET28a-Cul菌株和对照菌株即含有pET28a质粒的大肠杆菌 BL21(DE3)-pET28a，接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37°C, 150rpm培养 12h。以1%的接种量转接摇瓶，培养至菌体0D咖达到0.6-0.8，取出lml的菌体， 5000rpm离心5min，弃上清。在剩余的液体培养基中加入终浓度为lmM的IPTG， 37°C 诱导4h。同样对诱导的菌体进行离心。用无菌水悬浮诱导前及诱导后的菌体，并同 时加入等体积的2X上样缓冲液，混匀，95。C热裂解15min，于12000rpm离心5min， 吸取IO 1上清作为SDS-PAGE的上样样品。SDS-PAGE的分离胶浓度为12. 5%，浓 縮胶浓度为5%。 SDS-PAGE结果表明亚克隆的铜抗性基因编码的蛋白在大肠杆菌 BL21 (DE3)中大量表达(图2)。
权利要求
1、铜抗性基因，它的DNA序列如附图1所示。
2、 铜抗性基因，它编码的蛋白质具有附图1所述的的氨基酸序列。
3、 如权利要求1所述的铜抗性基因，由雷沙氏菌属(6brraz^3印.)KMR-3菌 株产生，基因序列全长l，117bp，推导的抗铜蛋白由194个氨基酸编码，为CiitF蛋 白，分子量为约22KDa，理论pl值为5.30;与莫氏耶尔森氏菌(re2^'m'a 側Ware"力ATCC 43969铜抗性脂蛋白NlpE同源性最高，达70%。
4、 包括权利要求1的DNA序列的重组载体pUC118^Cul。
5、 包括权利要求l的DNA序列的重组载体pET28a""Cul。
6、 利用重组载体pET28a-Cul转化的重组大肠杆菌BL21 (DE3)-pET28a-Cul。
7、 权利要求1至6所述的物质的制备方法，提取粘质沙雷氏菌KMR-3菌 株的染色体DNA，用限制性内切酶&"3AI进行部分酶切，胶回收酶切产物，并与 pUC118 "a/zHI/BAP载体连接，连接产物经乙醇沉淀，电转化￡ coh'DH5 ，涂 布含氨苄青霉素的LB平板，构建基因组DNA文库；在含有氨苄青霉素和铜离子的 选择性平板上筛选重组子，从重组质粒pUC118-Cul中分离出含铜抗性基因的DNA 片段，经限制性内切酶酶切，获得如图1所示的DNA;设计引物扩增铜抗性基因， 与pET28a载体连接并转化大肠杆菌BL21 (DE3)菌株，获得重组质粒pET28a-Cul和 含重组表达质粒的重组菌株大肠杆菌BL21 (DE3) -pET28a-Cul 。
全文摘要
本发明公开一种粘质沙雷氏菌编码铜抗性的基因，其由沙雷氏菌属(Serratia sp.)KMR-3菌株产生，基因序列全长1,117bp，推导的抗铜蛋白由194个氨基酸编码，为CutF蛋白，分子量为约22KDa，理论pI值为5.30；与莫氏耶尔森氏菌(Yersinia mollaretii)ATCC 43969铜抗性脂蛋白NlpE同源性最高，达70％。提供含有该基因的重组质粒和表达该抗性基因的重组菌株。该基因的抗性蛋白异源表达的方法，包括通过构建基因组DNA文库，克隆到铜抗性相关基因，根据氨基酸序列比对，发现所克隆的蛋白属于CutF蛋白，并进一步将该蛋白在大肠杆菌中成功表达。铜抗性基因的克隆技术，为细菌铜抗性机理和铜离子污染地域的生物修复技术奠定了基础。
文档编号C07K14/195GK101509000SQ20081023362
公开日2009年8月19日 申请日期2008年11月24日 优先权日2008年11月24日
发明者井申荣, 季秀玲, 林连兵, 魏云林 申请人:昆明理工大学