专利名称：一种花生离体诱变定向筛选抗性体的方法
技术领域：
本发明属于花生育种领域，尤其涉及一种花生离体诱变定向筛选抗性体的方法。
背景技术：
随着环境的不断恶化，干旱、盐碱等逆境胁迫已成为世界性的问题，培育多种抗逆性的作物新品种已成为广大育种家的主要育种目标之一。花生是我国重要的油料作物和经济作物之一，然而花生栽培种中缺乏高抗性品种资源，抗逆品种的选育一直是一个难以解决的问题。诱变技术的利用能够产生自然界不存在的新性状、新类型，利用诱变与组织培养相结合进行定向筛选突变体，能节省人力、物力、财力，缩短育种年限。因此，离体诱变与组织培养结合是获得新种质的有效手段。利用诱变与植物组织培养相结合创造新的种质资源研究已在多种植物上进行，在抗病性、抗逆性、熟性、产量、品质等方面获得了各种各样的优良突变体，有的突变体直接应用或作为亲本材料育成了新品种。近年来，极少数报道有关花生离体诱变研究，但离体诱变 定向筛选抗逆突变体目前未见报道。
发明内容
本发明提供了一种花生离体诱变定向筛选抗逆突变体的方法，本发明通过离体诱变进行定向筛选抗性体，可以创造花生抗逆新种质，克服花生遗传基础狭窄、缺乏高抗性品种资源，致使花生抗逆育种难以获得突破性进展的困难，并可节省大量人力、物力、财力，缩短育种年限。为达到解决上述问题的目的，本发明采用以下技术方案予以实现
一种花生离体诱变定向筛选抗性体的方法，它包括如下步骤
(1)将成熟花生种子去子叶后的种胚进行表面消毒；
(2)在无菌条件下分离所述种胚的胚小叶为外植体，将胚小叶接种到体胚诱导培养基中，进行诱变培养25 30d，少部分外植体形成体胚；所述体胚诱导培养基以MSB5为基本培养基，并添加3 4mg/L平阳霉素和5 10mg/L 2, 4-D ；
(3)将形成体胚的外植体转移至体胚萌发培养基上进行培养得到抗性再生苗，所述体胚萌发培养基以MSB5为基本培养基，并添加4 8mg/L羟脯氨酸和4mg/L BAP ；
(4)当抗性再生苗生长至2 3cm时，从基部切下，嫁接于无菌萌发的花生实生苗的胚轴上，无菌培养Hd后,移栽于育苗基质中驯化培养,后移栽到田间培养。对上述技术方案的进一步改进所述步骤(3)中采用加筛选压和不加筛选压各培养4w进行交替培养。对上述技术方案的进一步改进所述步骤(3)中体胚萌发阶段的羟脯氨酸抗逆筛选浓度为4mg/L，继代培养时羟脯氨酸抗逆筛选浓度为8mg/L。对上述技术方案的进一步改进所述步骤(I)中花生种胚的表面消毒采用75%的酒精浸泡15 25s，再用0. 1%的升汞浸泡,然后用无菌水漂洗后,置于无菌水中浸泡12 16h0对上述技术方案的进一步改进所述步骤(2)和(3)中培养条件为温度为24 26°C、光照强度为2000 3000Lx、光照时间为10_15h/d，培养基的调至pH 5. 8。对上述技术方案的进一步改进所述体胚诱导培养基为MSB5+5 mg/L 2，4_D+3mg/L PYM +30g/L蔗糖+8g/L琼脂；所述体胚萌发培养基为MSB5+4 mg/L BAP+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+4mg/L羟脯氨酸。对上述技术方案的进一步改进所述步骤(4)中以苗龄9-12d的花生无菌苗为砧木，抗性再生苗为接穗进行无菌嫁接。对上述技术方案的进一步改进所述驯化培养的条件为22 26°C，驯化室培养18 25d。 本发明的优点和积极效果是
I、本发明以花生成熟种子胚的胚小叶为外植体，在基本培养基中添加3 4mg/L平阳霉素和5 10mg/L 2,4-D (氯化苯氧乙酸类除草剂)进行诱变处理。形成体胚的外植体，再转移到添加4 8mg/L羟脯氨酸和4mg BAP (6-苄氨基嘌呤)的培养基上促使体胚萌发成苗，同时进行定向筛选抗性体。本发明以羟脯氨酸(HYP)作为抗逆筛选压力添加于培养基中，对各培养阶段适宜的筛选浓度进行了研究，并获得了抗性体。获得的羟脯氨酸抗性苗经嫁接驯化后移栽田间，获得的成熟种子次年播种田间，与诱变亲本相比，大部分抗性苗后代植株发生明显变异和分离，并与诱变亲本相比表现出明显的差异；干旱处理条件下与诱变亲本相比，抗性体表现出明显的抗旱性，且SOD (超氧化物歧化酶)活性和POD (过氧化物酶)活性明显升高。2、本发明以花生成熟种子作为诱变材料可不受季节限制，常年可以进行诱变处理和定向筛选。3、利用离体诱变结合组织培养定向筛选抗逆突变体，筛选过程于培养基中进行，大量不具有抗逆性的培养材料被淘汰，可节省大量的人力、物力、财力；突变体的再生通过胚胎发生途径，体细胞胚起源于一个细胞，可避免突变体的嵌合性。本发明为开拓花生新的育种途径奠定了基础，获得的抗旱抗性体可直接或间接用于花生育种。结合附图阅读本发明的具体实施方式
后，本发明的其他特点和优点将变得更加清
/E. o
图I表明在未添加HYP的诱导培养基上花生胚小叶形成正常体胚。图2表明不同浓度HYP对花生胚小叶生长的影响，A:添加2 mg/L HYP的体胚诱导培养基添加4 mg/L HYP的体胚诱导培养基；C:添加6mg/L HYP的体胚诱导培养基；D:添加8 mg/L HYP的体胚诱导培养基。图3表明本发明中HYP对体胚萌发的影响，A :未添加HYP的体胚萌发培养基；B 添加4 mg/L HYP的体胚萌发培养基；C:添加8 mg/L HYP的体胚萌发培养基。图4表明本发明中继代培养时HYP对体胚萌发成苗的影响，A :未添加HYP的体胚萌发培养基:添加8 mg/L HYP的体胚萌发培养基。
图5是本发明中花育20号胚小叶离体诱变、定向筛选及抗性苗结实；A :在添加3mg/L PYM的诱导培养基上形成的体胚；B :先后在添加4mg/L HYP和8mg/L HYP的体胚萌发培养基上筛选获得的抗性小苗；C :表现变异的抗性苗；D :抗性苗结实。图6是本发明中诱变亲本和突变体M2代表型及其分离情况;A :诱变亲本花育20号；B :43号株系株高 变矮；C :42号株系茎枝颜色、株型、开花习性发生变异；D :33号株系株高明显分离。图7是本发明中干旱处理后，诱变亲本及突变体M2代的生长状况;A :诱变亲本花育20号；B Al号株系；C :42号株系。图8是本发明中耐HYP抗性体M2代的SOD活性。图9是本发明中耐HYP抗性体M2代的POD活性。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明的技术方案作进一步详细的说明。实施例I
本发明所述花生离体诱变定向筛选抗性体的方法，包括如下步骤
I.培养基的制备
(I)制备诱变及体胚诱导培养基选取MSB5 (MS无机盐+ B5有机成分)为基本培养基，在此MSB5培养基中添加平阳霉素和2，4-D形成诱变及体胚诱导培养基。平阳霉素的添加量为3 4mg/L，2，4-D的添加量为5 10mg/L。本实施例中体胚诱导培养基为MSB5+5 mg/L2，4-D+3 mg/L平阳霉素+30g/L蔗糖+8g/L琼脂；将所述体胚诱导培养基的pH调至5. 8，在培养室温度为24 26°C、光照强度为2500 3000Lx、每日光照为10 15h的条件下进行培养。诱变和体胚诱导同时进行。平阳霉素(PYM)是一种抗生素，属于博莱霉素的一类，是博莱霉素的A5组分，它作为诱变剂具有安全、高效、诱变频率高、范围大等特点。2，4-D是一种氯化苯氧乙酸类除草齐U，也可用作植物生长调节，是用于诱导愈伤组织形成的常用生长素，在本发明中用来诱导体胚形成。(2)制备抗逆筛选及体胚萌发培养基选取MSB5 (MS无机盐+ B5有机成分)为基本培养基，在此MSB5培养基中添加羟脯氨酸(HYP)和6-苄氨基嘌呤(BAP)形成抗逆定向筛选及体胚萌发培养基，羟脯氨酸的添加量为4 8mg/L，BAP的添加量为4mg/L。本实施例中体胚萌发培养基为MSB5+4 8mg/L HYP +4 mg/L BAP+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，将所述体胚萌发培养基的PH调至5. 8，在培养室温度为24 26°C、光照强度为2500 3000Lx、每日光照为10 15h的条件下进行培养。定向筛选和体胚萌发同时进行。2. HYP筛选浓度的确定
以HYP作为抗逆筛选压力添加于培养基中进行定向筛选抗性体。首先确立适宜的HYP临界浓度，试验分别在培养的3个不同时期进行处理I，诱导培养基中添加0，2，4，6，8 mg/L HYP ;处理II，在未添加HYP的诱导培养基上形成的体胚丛转移到体胚萌发培养基上培养，体胚萌发培养基中添加0，4，6，8，10 mg/L HYP ;处理III，前2个培养均未添加HYP的培养基上获得的萌发体胚丛，转移到新鲜的体胚萌发培养基上进行继代培养，培养基中添加8，10，12 mg/L HYP。每个阶段分别培养4w后观察试验结果。
花生各个生长发育时期对逆境的耐受性不同。同理，组织培养条件下各阶段对逆境胁迫的耐受程度亦不同。以HYP模拟逆境条件，添加于培养基中进行定向筛选抗性体，研究了花生胚小叶 组织培养通过体细胞胚胎发生途径再生植株的三个不同阶段中HYP的最佳筛选浓度。处理I，将胚小叶接种在添加不同浓度HYP (0,2,4,6,8 mg/L)的诱导培养基上，培养4w后的结果如图I和2所示，从图中可以看出，HYP严重抑制体胚的形成，除对照(图I所示)外，在上述添加不同浓度HYP的诱导培养基上，无论HYP浓度高低(图2A、B、C和D所示)，胚小叶外植体均形成疏松的愈伤组织或褐化，所有培养基上均未观察到体胚的形成。因此判断，体胚诱导阶段不适于定向筛选。处理II，在未添加HYP的诱导培养基上培养4w后形成体胚的外植体，转移到添加HYP(0，4，6，8，10 mg/L)的体胚萌发培养基上进行培养。培养4w后实验结果如图3所示，从图3中可以看出，在未添加HYP的体胚萌发培养基上(图3A)，体胚萌发正常；在添加4 mg/L HYP的体胚萌发培养基上(图3B)，体胚虽没有完全致死，但是已严重抑制其生长；在添加8 mg/L HYP的体胚萌发培养基上(图3C)体胚完全褐化死亡。因此，以4 mg/L HYP作为此培养阶段的抗逆筛选浓度。处理III，在前2个处理阶段均不进行抗逆筛选，而进行正常的培养。胚小叶外植体在诱导培养基上培养4w后形成体胚丛，将体胚丛转移到体胚萌发培养基上再培养4w，大部分体胚萌发。然后将萌发的体胚丛转移到新鲜的培养基上进行继代培养，培养基中添加0，8，10，12 mg/L HYP。4w后实验结果如图4所示，从图4中可以看出，在未添加HYP的培养基上(图4A所示)，体胚萌发长成的小苗生长正常；在添加8 mg/L HYP的培养基上(图4B所示)，由体胚萌发长成的小苗生长受到抑制。因此，此阶段HYP抗旱筛选浓度确定为8 mg/L。3.平阳霉素诱变处理
以花育20号种子胚小叶为诱变培养材料，以平阳霉素(PYM)作为诱变剂，添加于培养基中进行诱变处理。选取饱满的花育20号种子去子叶，将种胚置于75%的酒精浸泡20s，再用
0.1%的升汞浸泡lOmin，进行表面消毒，用无菌水漂洗5次后，置于装有无菌水的广口瓶中浸泡12 16h。取出浸泡的种胚,置于无菌培养皿中分离胚小叶,然后接种到添加3mg/LPYM的诱导培养基上培养4w，进行诱变处理及诱导体胚的形成。4. HYP抗性苗的定向筛选
花育20号种子胚小叶培养在添加3mg/L PYM的诱导培养基上进行诱变处理。培养IOd后，外植体开始形成乳白色愈伤组织，培养4w，部分愈伤组织逐渐褐化或者形成玻璃化愈伤组织，另有部分能够形成体胚，如图5 A所示。诱变培养4w后，将形成体胚的外植体转移到体胚萌发培养基上促使体胚萌发，并进行定向筛选抗性体。利用上述确定的HYP筛选浓度,进行胚小叶外植体诱变处理和定向筛选抗性体。首先在体胚萌发培养基中添加4 mg/L HYP，继代培养时增加到8 mg/L。为避免筛选的培养材料生长过慢或褐变，在体胚萌发培养基上筛选时，采用加筛选压和不加筛选压各培养4w进行交替培养。在含有HYP的培养基上培养4w后，大部分外植体及体胚死亡，仅有少数存活；幸存的形成体胚的外植体转到不含筛选压的体胚萌发培养基上，慢慢恢复生长，接触培养基的部分形成大量绿色致密的愈伤组织，4w后再转至筛选培养基上，如此循环反复，直至出苗(图5 B)。最终获得了少量花育20号抗性苗。5.抗HYP再生苗的嫁接与移栽
以上述筛选获得的花育20号再生苗为接穗、花育23号的无菌苗为砧木，在超净台内参照郝世俊等[郝世俊等，花生组培苗嫁接技术的研究[J].青岛农业大学学报，27(2) :110-113]的方法进行无菌嫁接、驯化移栽及管理。2011年进行抗性苗的嫁接，经驯化后移栽于青岛农业大学试验田，生长发育阶段进行观察和记载，成熟后分单株收获荚果。2012年将单株收获的种子，部分按株系(M2代)种于塑料大棚进行干旱处理；其余部分按株系(M2代)播种于青岛农业大学试验田，苗期及生长发育阶段观察记载性状变异及分离情况。当HYP抗性再生苗生长至2cm时，便可以进行无菌嫁接。以苗龄约IOd的花育23号无菌苗为砧木，抗性再生苗为接穗进行无菌嫁接。嫁接苗经驯化后移栽于试验田，观察发现，42号再生苗当代即表现出变异，茎枝颜色变为紫色(图5 C)，而诱变亲本为绿色。嫁接苗按常规进行田间管理，成熟后按单株收获荚果，共有13株抗性苗得到了仏代种子(图5 D)。6.抗性苗M2代分离和变异情况
将收获的M2代种子，次年部分种子按株系播种于大田，以诱变亲本花育20号作对照。生长发育阶段观察结果显示，13个株系(3广43号)中，除32号无明显变异外，其他12个株系在株高、茎枝颜色、株型、开花习性等方面与诱变亲本不同，表现出明显变异，并且观察到大部分株系发生明显分离。31号、39号、40号、41号、43号株系整体明显变矮(图6 B) ；38号株系其中I株变矮，分枝数增多；42号株系大部分植株茎枝变成紫色、半匍匐型、分枝数明显增多成为密枝型、交替开花(图6 C)，同株系的其他少部分植株矮小，而诱变亲本花育22号茎枝绿色，株型直立，疏枝，连续开花(图6 A);其他株系也均发生了变异和分离(图6D)。 7.抗性体的抗旱性鉴定
将7个单株(33号、34号、35号、37号、41号、42号、43号)收获的M2代的部分种子按株系播种于塑料大棚，以诱变亲本花育20号作对照。苗期进行干旱处理后，大部分抗性植株后代生长正常；而花育20号生长明显受抑制，棵较小，部分叶片枯黄(图7)。所述干旱处理的方法为将种子播种于塑料大棚，播种时浇足水，之后I个半月未浇水，进行干旱处理(SOD、POD测定取材是此时取的叶片材料)。8.抗性体的生理生化指标的测定 8. I粗酶提取
取塑料大棚进行干旱处理后的植株(M2代)叶片，称取鲜叶样品0. 5g于预冷的研钵中，加入少量的PVP和二氧化硅，加Iml 0. 05mol/L的磷酸缓冲液(pH7. 8)在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使最终体积为5ml。将提取液于10000转/分冷冻离心20min，上清液4°C保
存备用。8. 2超氧化物歧化酶(SOD )活性的测定
参照植物生理实验技术测定超氧化物歧化酶(SOD)活性，以抑制NBT光化还原的50%为I个酶单位。SOD 总活性(U/g) =[(Ack — AE) XV]/(0. 5AckXWXVt)
Ack为照光对照管的吸光度值；AE为样品管的吸光度值；V为样品液总体积(ml) ；ff为样品鲜重；vt为测定时样品用量。结果如图8所不，从图8可以看出，测试的7个株系中33号、34号、35号、41号、42号5个株系的SOD活性高于诱变亲本花育20号，特别33、34、35号SOD活性明显升高，是亲本的2-3倍。37号株系与亲本基本相同，43号株系明显低于亲本。8. 3过氧化物酶(POD )活性的测定
参照张志良法测定过氧化物酶(POD)活性，记录5min内愈木酚被氧化的速率，以每分钟吸光度A470变化0. 01为I个过氧化物酶活性单位(U)，按下式计算POD活性卩00活性(。/&.111111))=(八六470\￥0 / (WXVsX0. OlXt)
AA470为反应时间内吸光度的变化；Vt为提取液总体积(ml);W为样品鲜重(g);Vs为测定时取用酶液体积(ml) ；t为反应时间(min)。
结果如图9所示，由图9看出，测试的7个株系中，33号、34号、35号、41号4个株系的POD活性较诱变亲本花育20号POD活性高。由图4和图5还可以说明，SOD活性和POD 活性测定结果比较一致，SOD活性高于亲本的33号、34号、35号、41号、42号中，仅有42号POD活性低于对照，其他4个株系POD活性均高于亲本。而43号株系SOD活性和POD活性在测试的材料中均最低，均明显低于亲本。PYM是一种抗生素，作为一种新的诱变剂，被证明具有安全、高效、诱变频率高、范围大等特点，具有广阔的开发和应用前景。本发明利用PYM作为诱变剂，获得的HYP抗性苗经嫁接移栽田间，13株获得种子。次年按株系播种于大田，12个株系发生变异和分离。结果进一步证实了 PYM的诱变效果。POD可以清除生物体内氧自由基，避免组织细胞受到伤害，在生物抗逆境胁迫、抗衰老中起很重要的作用。POD在细胞内含量的升高证明细胞在逆境中的活力越强。SOD的主要功能也是清除生物体内超氧离子基团，防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜的伤害。姜慧芳等在花生干旱胁迫下测定SOD活性，结果表明，抗旱品种的SOD活性升高较多；而敏感品种的SOD活性升高较少。本研究中离体诱变获得的HYP抗性植株经嫁接移栽田间后，7个单株收获的M2代的部分种子，次年按株系播种于塑料大棚，苗期进行干旱处理后，大部分抗性植株后代生长正常；而诱变亲本花育20号生长明显受抑制。SOD活性和POD活性测定结果表明，大部分株系SOD活性和POD活性明显高于诱变亲本，说明获得的这些抗性苗为抗逆突变体。脯氨酸作为渗透调节物质在耐盐、抗旱生理中具有重要作用。以脯氨酸类似物-羟脯氨酸(HYP)作为选择压力，通过组织培养手段，已先后在许多作物上获得耐HYP的变异细胞系，并表现出较强的抗逆性。本研究将HYP添加于花生体胚萌发培养基中进行定向筛选，最终获得了抗旱突变体，进一步说明HYP作为筛选压力添加于培养基中定向筛选抗逆突变体是有效的。定向筛选可节省人力、物力、财力。本发明利用安全、高效的PYM作为诱变剂进行花生离体诱变，以HYP作为筛选压力，获得的抗性再生苗经嫁接移栽田间，13个植株获得了成熟种子。次年按株系播种，其中12个株系发生变异和分离，说明基因发生了突变；7个株系进行干旱处理后，大部分植株表现生长正常，而诱变亲本生长明显受抑制，7个株系中5个株系SOD活性高于诱变亲本，其中4个株系POD活性也高于诱变亲本，证实这些突变体具有较强的抗旱能力。这些突变体的耐盐性、耐冷性有待于进一步研究。
权利要求
1.一种花生离体诱变定向筛选抗性体的方法，其特征在于它包括如下步骤 (1)将成熟花生种子去子叶后的种胚进行表面消毒； (2)在无菌条件下分离所述种胚的胚小叶为外植体，将胚小叶接种到体胚诱导培养基中，进行诱变培养25 30d，少部分外植体形成体胚；所述体胚诱导培养基以MSB5为基本培养基，并添加3 4mg/L平阳霉素和5 10mg/L 2, 4-D ； (3)将形成体胚的外植体转移至体胚萌发培养基上培养，进行定向抗逆筛选得到抗性再生苗，所述体胚萌发培养基以MSB5为基本培养基，并添加4 8mg/L羟脯氨酸和4mg/LBAP ； (4)当抗性再生苗生长至2 3cm时，从基部切下，嫁接于无菌萌发的花生实生苗的胚轴上，无菌培养l-2d后，移栽于育苗基质中驯化培养，后移栽到田间。
2.根据权利要求I所述的花生离体诱变定向筛选抗逆突变体的方法，其特征在于所 述步骤(3)中采用加筛选压和不加筛选压各培养4w进行交替培养。
3.根据权利要求2所述的花生离体诱变定向筛选抗逆突变体的方法，其特征在于所述步骤(3)中体胚萌发阶段的羟脯氨酸抗逆筛选浓度为4mg/L，继代培养时羟脯氨酸抗逆筛选浓度为8mg/L。
4.根据权利要求I所述的花生离体诱变定向筛选抗逆突变体的方法，其特征在于所述步骤(I)中花生种胚的表面消毒采用75%的酒精浸泡15 25s，再用O. 1%的升汞浸泡，然后用无菌水漂洗后，置于无菌水中浸泡12 16h。
5.根据权利要求I所述的花生离体诱变定向筛选抗逆突变体的方法，其特征在于所述步骤(2)和(3)中培养条件为温度为24 26°C、光照强度为2000 3000Lx、光照时间为10-15h/d，培养基的调至pH 5.8。
6.根据权利要求I所述的花生离体诱变定向筛选抗逆突变体的方法，其特征在于所述体胚诱导培养基为MSB5+5 mg/L 2，4-D+3mg/L PYM +30g/L蔗糖+8g/L琼脂；所述体胚萌发培养基为MSB5+4 mg/L BAP+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+4mg/L羟脯氨酸。
7.根据权利要求I所述的花生离体诱变定向筛选抗逆突变体的方法，其特征在于所述步骤(4)中以苗龄9-12d的花生无菌苗为砧木，抗性再生苗为接穗进行无菌嫁接。
8.根据权利要求I所述的花生离体诱变定向筛选抗逆突变体的方法，其特征在于所述驯化培养的条件为22 26°C，驯化室培养18 25d。
全文摘要
本发明提供了一种花生离体诱变定向筛选抗性体的方法，主要步骤是将花生种胚表面消毒并用无菌水漂洗后浸泡；分离胚小叶，接种到体胚诱导培养基中诱变培养；将形成体胚的外植体转移到体胚萌发培养基上，以羟脯氨酸作为筛选压力添加于培养基中，进行定向筛选抗性体，获得的抗性苗经嫁接移栽田间，常规田间管理。本发明获得的抗性体大部分后代植株发生明显变异和分离；抗旱性明显，且SOD酶活性和POD酶活性明显升高；本发明的诱变材料可不受季节限制；利用离体诱变结合组织培养定向筛选抗逆突变体，可节省大量的人力、物力、财力；突变体的再生通过胚胎发生途径，体细胞胚起源于一个细胞，可避免突变体的嵌合性。
文档编号A01H4/00GK102792892SQ201210297938
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月21日 优先权日2012年8月21日
发明者王晶珊, 赵明霞, 隋炯明, 乔利仙, 孙世孟, 郭宝太 申请人:青岛农业大学