一种从锰结核中筛选硅酸盐细菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物菌种的筛选方法，具体涉及大洋锰结核样品中的硅酸盐微生物 菌种的筛选分离培养方法。
【背景技术】
[0002] 微生物，特别是大洋这种极端环境中的微生物，在自然生物、地球化学循环等方面 有着极为重要的作用。研宄大洋中的微生物，有助于我们了解和认识生命的起源和生命进 化，以及在大洋环境中，微生物的耐受机制及其与环境的相互作用。微生物菌种资源，特别 是具有特殊价值的菌种资源的争夺已成为当今国际生物资源争夺的一个重要组成部分。
[0003] 硅酸盐细菌是指能够分解硅酸盐类矿物的细菌，主要包括环状芽孢杆菌 (bacillus circulans)和胶质芽抱杆菌（bacillus mucilaginosus)。前苏联亚历山大罗 夫从土壤中分离得到一株能够分解正长石和磷灰石的细菌并将其命名为硅酸盐细菌。
[0004] 硅酸盐细菌分解矿石释放出可溶性钾和磷，故被作为细菌肥料使用，相关研宄也 较多。硅酸盐细菌在矿石脱硅提高品位方面有较多的研宄报道，主要用于铝土矿、锰矿和镍 矿脱硅，其在浮选中的应用前景广阔。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是解决筛选硅酸盐细菌的问题。
[0006] 本发明提供的从锰结核中筛选硅酸盐细菌的方法，包括如下的步骤：
[0007] (1)称取锰结核样，将其加入至灭菌蒸馏水中，并分散均匀，得到浓度为 0· 05-0. 2g/mL 的悬浊液；
[0008] (2)将步骤⑴得到的悬浊液逐级稀释并涂板，并于恒温培养箱中倒置培养； [0009] (3)在步骤（2)得到的菌落中选取典型菌落于培养基上划线继续培养，所述典型 菌落为透明或半透明、菌落半玻璃珠状凸起、不易挑起及挑起拉丝的菌落；所述培养基为无 氮固体选择培养基；
[0010] (4)步骤（3)得到的细菌按步骤（3)的步骤重复处理至菌落得到纯化。
[0011] 在菌种得到纯化后，可将步骤（4)中所得菌株接种至固体平板培养基，培养2d后 观察菌落形态，并进行革兰氏染色、荚膜染色，于光学显微镜下观察；或将步骤（4)中所得 菌株接种至液体培养基，培养至对数期，取样在光学显微镜下观察其运动状态。
[0012] 优选的，步骤（1)分散时的温度为25-40摄氏度。更优选的，所述步骤（1)的分散 过程为锰结核样的悬浊液于温度30°C，150rpm震荡lh，静置30min，得KT 1gAiL浓度试样菌 悬液
[0013] 优选的，步骤（2)中培养基组成包括：蔗糖5. Og/L、Na2HP042. Og/L、MgSO4 · 7H20 0· 5g/L、FeCl30.00 5g/L、CaCO3O. lg/L、高岭土 0· 5g/L 和琼脂 10-15g/L，并于 121 °C 灭菌 30min〇
[0014] 优选的，步骤（2)和步骤（3)培养温度为25-35摄氏度。
[0015] 优选的，步骤（2)和步骤（3)培养时间为0. 5-10d。
[0016] 更优选的，步骤（2)培养时间为l-3d。
[0017] 更优选的，步骤（3)培养时间为2-5d，步骤（3)培养过程重复3-4次。
[0018] 优选的，步骤（3)划线操作中采用平板划线试验进行操作。
[0019] 优选的，所述方法为：
[0020] 采用10倍稀释法将细菌分离母液稀释成KT2~l(T5g/mL四种不同浓度，取各浓度 细菌悬浮液均匀涂布于固体培养基平板上，将平板放置于恒温生化培养箱中倒置培养，培 养2-5d后观察菌落生长情况，挑选典型菌落在平板上划线培养2~5d，再挑选单个菌落重 复划线培养3~4次，直至获得纯菌种。
[0021] 在本发明的一实施例中，采用10倍稀释法将细菌分离母液稀释成KT2~KT 5四种 不同浓度，取各浓度细菌悬浮液0. 2mL用无菌涂布棒均匀涂布于无氮固体选择培养基平板 上，将平板放置于30°C恒温生化培养箱中倒置培养。每个浓度设三组重复实验。培养72h 后观察菌落生长情况，挑选条件的硅酸盐细菌菌落特征的菌落在平板上划线培养2~5d， 再挑选单个菌落重复划线培养3~4次，同时检验其纯度，直至获得纯菌种。
[0022] 经划线培养得到一株典型的具有硅酸盐细菌特征的细菌，在无氮选择培养基上培 养24h~36h就有菌落生长，菌落为光滑的圆形，边缘整齐、透明、隆起、粘稠，菌落不易挑 起，易拉丝，富有弹性，培养1~2d菌落直径1~3mm，3~7d菌落直径5~10mm。显微镜 观察菌体不运动。
[0023] 本发明具有效率高、操作简单、所需时间较短和结果可靠等优点，可以促进从矿物 中筛选微生物的工作效率。
【附图说明】
[0024] 图1、本方法的操作流程图。
【具体实施方式】
[0025] 如下为本申请的具体实施例，其仅用于对本申请的解释而并非限制。
[0026] 如下实施例中大洋锰结核样为大洋一号27航次2013年7月在太平洋国际海底区 域采用拖网方式采集得到的样品。本发明实施例中的典型菌落为透明或半透明、菌落半玻 璃珠状凸起、不易挑起及挑起拉丝的菌落。
[0027] 如下实施例中，培养基具有如下的组成：蔗糖5. 0g/L、Na2HP042. 0g/L、MgS04 · 7H20 0· 5g/L、FeCl30.00 5g/L、CaCO3O. lg/L、高岭土 0· 5g/L 和琼脂 10-15g/L，并于 121 °C 灭菌 30min〇
[0028] 实施例1、
[0029] 参见图1，称取大洋锰结核样10g，置于锥形瓶中，加入90mL灭菌蒸馏水中，并 加玻璃珠，置于摇床中震荡得试样菌悬液。将所得试样菌悬液逐级稀释并涂平板，后于 恒温培养箱倒置培养。24h后观察菌落生长状态。挑取典型的硅酸盐单菌落，在培养基 上划线后继续培养。将所得细菌重复此操作4次，在显微镜下看到细菌形态大小基本一 致。再次挑选细菌进行平板培养，送于检测单位测试基因序列，得结果。得到的细菌的参 考物种为 Azotobacter chroococcum(园褐固氮菌），类属 Bacteria ;Proteobacteria ; Gammaproteobacteria ；Pseudomonadales ；Pseudomonadaceae ；Azotobacter.同源度 99%， 其序列见序列表第一部分。
[0030] 实施例2、
[0031 ] 参见图1，称取大洋锰结核样10g，置于锥形瓶中，加入90mL灭菌蒸馏水中，并加玻 璃珠，置于摇床中震荡得试样菌悬液。将所得试样菌悬液逐级稀释并涂平板，后于恒温培养 箱倒置培养。24h后观察菌落生长状态。挑取典型的硅酸盐单菌落，在培养基上划线后继续 培养。将所得细菌重复此操作4次，在显微镜下看到细菌形态大小基本一致。再次挑选细 菌进行平板培养，送与检测单位测试基因序列，得结果。该细菌的参考物种为Azotobacter chroococcum (圆褐固氣菌），类属 Bacteria ;Proteobacteria ;Gammaproteobacteria ; Pseudomonadales ;Pseudomonadaceae ;Azotobacter.同源度 99%，其序列见序列表第二部 分。
【主权项】
1. 一种从锰结核中筛选硅酸盐细菌的方法，包括如下步骤： (1) 称取锰结核样，将其加入至灭菌蒸馏水中，并分散均匀，得到浓度为0. 05-0. 2g/mL 的悬浊液； (2) 将步骤（1)得到的悬浊液逐级稀释并涂板，并于恒温培养箱中倒置培养； (3) 在步骤（2)得到的菌落中选取典型菌落于培养基上划线继续培养，所述典型菌落 为透明或半透明、菌落半玻璃珠状凸起、不易挑起及挑起拉丝的菌落；所述培养基为无氮固 体选择培养基； (4) 步骤（3)得到的细菌按步骤（3)的步骤重复处理至菌落得到纯化。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)中培养基组成包括：蔗糖5.Og/ L、Na2HP042.Og/L、MgSO4 .7H20 0? 5g/L、FeCl3O. 005g/L、Ca⑶30.lg/L、高岭土 0? 5g/L和琼脂 10_15g/L，并于 121°C灭菌 30min。3. 根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于，步骤（I)分散时的温度为25-40摄氏 度。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（2)和步骤（3)中培养温度为 25-35摄氏度。5. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（2)和步骤（3)中培养时间为 0.5-10d〇6. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（3)划线操作中采用平板划线试 验进行操作。7. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法为： 采用10倍稀释法将细菌分离母液稀释成1〇_2~10 _5四种不同浓度，取各浓度细菌悬浮 液均匀涂布于固体培养基平板上，将平板放置于恒温生化培养箱中倒置培养，培养2-5d后 观察菌落生长情况，挑选典型菌落在平板上划线培养2~5d，再挑选单个菌落重复划线培 养3~4次，直至获得纯菌种。
【专利摘要】本发明提供了一种从锰结核中快速筛选硅酸盐细菌的方法，包括如下步骤：称取锰结核样，将其加入至灭菌蒸馏水中，并分散均匀，得到浓度为0.05-0.2g/mL的悬浊液；将得到的悬浊液逐级稀释并涂板，并于恒温培养箱中倒置培养；在得到的菌落中选取典型菌落于培养基上划线继续培养，所述典型菌落为透明或半透明、菌落半玻璃珠状凸起、不易挑起及挑起拉丝的菌落；所述培养基为无氮固体选择培养基；重复前述步骤的处理过程至菌落得到纯化。本发明具有效率高、操作简单和结果可靠等优点，可促进从矿物中筛选微生物的工作效率。
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/065
【公开号】CN104894003
【申请号】CN201510178376
【发明人】李浩然, 滕青
【申请人】中国科学院过程工程研究所, 中国大洋矿产资源研究开发协会
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月15日