普罗威登斯菌(Providencia sp.)2D在邻苯二甲酸二丁酯污染土壤修复中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及环境污染物生物处理技术领域，更具体地，涉及普罗威登斯菌 sp. )2D在邻苯二甲酸二丁醋污染土壤修复中的应用。
【背景技术】
[0002] 邻苯二甲酸二丁醋（di-/?-butylphthalate，DBP)属于邻苯二甲酸醋类化合物 (Phthalic acidester，PAEs)，是塑料工业最主要的增塑剂之一，也是农药、染料去污剂的 载体以及诸多化妆品、纺织品的生产原料，广泛用于食品包装材料、容器、医疗器械以及儿 童玩具等领域。由于上述制品的大量应用，DBP已经成为全球性的有机污染物，广泛存在于 大气、水体、土壤以及生物体中。特别是在农业生产中，由于塑料薄膜和塑料大棚的广泛应 用，残留在农业土壤中DBP极易通过食物链在人体中富集。DBP及其代谢物能够对机体造 成生殖毒性、发育毒性、神经毒性、多器官癌变等多种损伤，因此美国环保署（EPA)和中国国 家环境监测中心（CNEMC)都已将它列为优先控制污染物。
[0003] 研宄表明，DBP的水解和光解速率都非常缓慢，生物降解是其在环境中分解的主要 途径。因此，获得DBP高效降解菌是提高其生物降解效率的重要环节。利用微生物降解作 用，将DBP转化为无害物质或完全矿化，是公认的去除环境中DBP污染的最佳手段。由于环 境中DBP的普遍存在，DBP降解菌的出现频率也很高，目前对DBP有降解作用的微生物大多 数为戈登氏菌属、农杆菌属、不动杆菌属和赤红球菌属等，但已报道的这些细菌对于DBP的 生物降解不完全，会产生毒性更高的中间代谢产物，或者其降解速率还不能满足实际污染 控制的要求，因此仍需筛选更加高效的专性或兼性降解菌。
[0004] 在农业生产中，土壤的DBP污染已经得到人们广泛关注。DBP污染土壤的微 生物修复技术中需要解决的首要问题是高效降解菌株的筛选与构建。普罗威登斯菌属 是堆肥中广泛存在的一类细菌，目前尚无关于其降解PAEs的报道。另外，堆 肥在改善土壤结构和保护农业生态环境方面具有高效、环保和低成本等优势，结合筛选获 得的高效降解菌，对降低农业土壤环境中DBP污染具有十分广泛的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明为了克服现有技术的上述不足，提供普罗威登斯菌sp. 2D在 邻苯二甲酸二丁酯污染土壤修复中的应用。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的： 普罗威登斯菌（/7TOhofez7Cia sp. ) 2D在DBP污染土壤修复中的应用，所述普罗威登斯 菌sp. 2D于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保 藏编号为CCTCC M 2015057,保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学。
[0007] DBP污染土壤的微生物修复技术中需要解决的首要问题是高效降解菌株的筛选与 构建。普罗威登斯菌属是堆肥中广泛存在的一类细菌，目前尚无关于其降 解PAEs的报道。本发明从动物粪堆肥中分离筛选获得一株对DBP具有高效、完全降解性能 的普罗威登斯菌，命名为sp. 2D，并发现该菌可有效降低土壤中的DBP污染， 是理想的土壤环境污染修复微生物。
[0008] 所述菌株/7Toriofeflcia sp. 2D通过富集培养法从农场动物奠堆肥样品中富集获 得，该菌的最适生长条件为：温度30~40°C，pH为7. 0~8. 5。
[0009] 所述菌株sp. 2D在牛肉膏蛋白胨培养基（LB)上(酵母粉5. 0 g， 蛋白胨10.0 g，氯化钠10.0 g，pH= 7.0)划线培养7天，菌落呈橘黄色，质地膏状，丰厚湿 润，易被挑起，边缘较薄；扫描电子显微镜下呈长杆状，长约1. 5~3. 0 μm，宽约0. 5~ 〇. 8 μπι ;经革兰氏染色鉴定该菌为革兰氏阴性菌。
[0010] 所述菌株/7Toriofeflcia sp. 2D的生理生化鉴定实验结果如下：甲基红试验（阳 性)、V-P试验（阴性)、吲哚反应（阳性)、柠檬酸盐利用（阳性)、肌醇产酸试验（阳性)、葡萄糖 产酸试验（阳性)、淀粉水解试验（阴性)、尿酶试验（阳性)、明胶液化试验（阴性)、硝酸盐还原 (阳性)、氧化酶试验（阴性）和葡萄糖产气试验（阴性)。
[0011] 所述菌株sp. 2D的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO :1所示，通过 NCBI官方网站（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)的BLAST程序与其他已登录细菌菌株16S rDNA序列进行比对，结果表明该菌株与sp.相似性最高，同源率达99%。
[0012] 优选地，上述应用为：在DBP污染的土壤中接种普罗威登斯菌Providencia sp. 2D，所述普罗威登斯菌Providencia sp. 2D的用量为：每200g含100mg/kg DBP的污染 土壤中添加普罗威登斯菌Providencia sp. 2D菌悬液（OD6tltlmi= 0. 8) 50mL。
[0013] 上述普罗威登斯菌sp. 2D降解邻苯二甲酸二丁醋的应用具体为： 将普罗威登斯菌sp. 2D活化后制得的菌悬液接入受邻苯二甲酸二丁酯污染 的土壤中。
[0014] 作为一种更优选的技术方案，上述应用是将普罗威登斯菌sp. 2D经 过过夜活化、震荡培养至对数期，收集菌体，根据实际需要调节菌体含量并制成菌悬液，将 制得的菌悬液接入受邻苯二甲酸二丁酯污染的土壤中。
[0015] 另外，发明人研宄还发现在DBP污染土壤中同时添加动物粪堆肥可进一步增强土 壤中DBP的降解，因此，本发明所述具体应用的过程中，还可以在DBP污染的土壤中添加动 物奠堆肥混勾后再接入普罗威登斯菌sp. 2D ;所述动物奠堆肥与DBP污染土 壤的质量比为1 :15。
[0016] 本发明还提供普罗威登斯菌sp. 2D在制备DBP污染土壤修复改良 剂中的应用。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 本发明提供了普罗威登斯菌/7Toriofeflcia sp. 2D在DBP污染土壤修复中的应用，具体 是在DBP污染的土壤中接种普罗威登斯菌sp. 2D ;接2D菌的土壤在第10天 DBP残留量为34. 46 mg/kg，降解率达到了 65%，而未接菌的对照土壤DBP降解率仅为19%， 相比对照提高了 46% ;另外，在添加了堆肥并接菌的土壤中，其第十天的DBP降解率达到了 88%，表明堆肥可增强土壤中DBP的降解，将ofeflciasp. 2D菌与堆肥结合使用，可高效 修复DBP污染的土壤，对降低农业土壤环境中DBP污染具有十分广泛的应用前景。
【附图说明】
[0018] 图1为Providencia sp. 2D在LB培养基上培养7天的生长形态。
[0019] 图2为sp. 2D的扫描电镜图。
[0020] 图 3 为 sp. 2D 的 16SrDNA 的系统发育树。
[0021] 图4为sp. 2D对DBP和邻苯二甲酸的降解动力学曲线。
[0022] 图5为/7TOFiofeflcia sp. 2D对不同土壤处理中DBP的降解效果。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本 发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单 修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术 人员所熟知的常规手段。
[0024] 实施例1邻苯二甲酸二丁酯降解菌的分离与鉴定 1、培养基配方 无机盐培养液（MSM，g/L):K2HP04:5· 8 ;ΚΗ2Ρ04:4· 5 ; (NH4)2SO4:2. 0 ;MgCl 2:0· I6 ;CaCl 2: 0· 02 ;Na2Mo04 · 2H20 :0· 0024 ;FeCl3:0. 0018 ;MnCl 2 · 2H20 :0· 0015 ;调节无机盐培养液的最 终pH为7. 5。添加 DBP，使其在无机盐培养液中的浓度为50 mg/L，DBP作为唯一碳源。
[0025] 牛肉膏蛋白胨培养基（LB):酵母粉5. 0 g，蛋白胨10. 0 g，氯化钠10. 0 g，加超纯 水至1L，调节pH= 7. 0。121°C灭菌20分钟。固体平板则添加 I. 5% (W/V)琼脂粉。
[0026] 2、分离与鉴定 分离方法采用样品悬液摇瓶法：称取5 g堆肥样品（取自农场动物堆肥）于含有50 mL 无菌水的150 mL三角瓶中，在30°C，140 rpm条件下培养3天后取5 mL堆肥悬液加入100 mL含DBP (50 mg/L)的上述MSM培养基中。经30°C，140 rpm下培养7天后，每次按取1 mL的接种量连续富集、转接10次，并相应提高MSM培养基中DBP含量至1000 mg/L (第二 次转接，MSM培养基中DBP的含量为100mg/L，之后每转接一次，MS