M培养基中DBP的含量提 高100mg/L)。然后将转接10次的培养液稀释IO 3~10 5涂布于LB固体平板上，30°C倒置 培养1~3天。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落多次划线纯化，分离获得一株细菌，编 号为2D。然后将菌株接种于LB固体平板上30°C倒置培养7天，观察其菌落形态。LB平板 培养7天的菌落呈橘黄色，质地膏状，丰厚湿润，易被挑起，边缘较薄(见图1 )。
[0027] 扫描电镜样品制备与观察：将菌种2D的单菌落接入含有10 mL的LB液体培养基 过夜活化。吸取800 μ L菌液经8000 rpm离心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS 洗菌3次。在收获的菌体沉淀中加入I mL 2.5% (v/v)戊二醛充分混匀，4°C静置过夜。然 后再次经8000 rpm离心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS洗菌3次。随后将菌体 分别在30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脱水2次，每个梯度约浸泡15 min，然 后8000 rpm离心去上清液，最后用乙酸异戊酯置换乙醇2次，每次20 min，方法同乙醇脱 水。菌体经过〇)2干燥后制片观察。扫描电镜下可以观察到该菌呈长杆状，长约1.5~3.0 μπι，宽约 0.5 ~0.8 μπι (见图 2)。
[0028] 菌株的生理生化鉴定指标包括12项：甲基红试验、V-P试验、吲哚反应、柠檬酸盐 利用、肌醇产酸试验、葡萄糖产酸试验、淀粉水解试验、尿酶试验、明胶液化试验、硝酸盐还 原、氧化酶试验和葡萄糖产气试验。具体实验结果见表1。
[0029] 菌株的16S rDNA鉴定：提取细菌总DNA，用细菌16S rDNA通用引物对该菌基因组 进行PCR扩增。PCR产物经测序（由上海生工完成）后，将测序结果与GenBank中已报道的 16S rDNA序列进行同源性比对，并选取若干菌种做进化树分析。如图3所示，本发明分离纯 化得到的菌株2D的16S rDNA序列与普罗威登斯菌，菌种保藏号为 NBRC 12930)同源率达99%，进化距离最近。与该菌属其他菌种也有较高同源性。因此，本 发明筛选获得的菌株鉴定为普罗威登斯菌属，命名为2D。
[0030] 实施例2D对DBP及其中间产物邻苯二甲酸的降解实验 1、菌悬液制备 将纯化后的菌种2D接入含有10 mL的LB液体培养基过夜活化培养 至对数期，经5000 rpm离心10 min收集菌体，用PBS洗菌3次后重悬，调节OD6tltl M = 0.8 作为菌种悬液。
[0031] 2、降解能力测定 分别向含有不同浓度DBP (50、100、200、500、1000 mg/L)和邻苯二甲酸（25、50、100、 200、500 mg/L)的 MSM 培养液(无机盐培养液 g/L !typers· 8 ;ΚΗ2Ρ04:4· 5 ; (NH4)2S04:2. 0 ; MgCl2:0. 16 ;CaCl 2:0· 02 ;Na2Mo04 ·2Η20 :0· 0024 ;FeCl3:0. 0018 ;MnCl 2 ·2Η20 :0· 0015)中接 菌I mL，以不接菌作为对照，并调节pH为8.0,每组三个重复。在30°C，140 rpm恒温摇床 培养6天，定期取样，经GC/MS测定DBP及邻苯二甲酸的降解情况。
[0032] 色谱条件：采用岛津公司QP2010 Plus型GC/MS串联质谱仪。色谱柱为安捷伦HP-5 柱子（0.25 μπι X 0. 25 mm X 30 m)，进样温度为250°C，离子源（EI)温度为220°C，采用 不分流进样I UL，载气为高纯氦气。升温程序为：初始温度为100°C，保持2 min，15°C/ min梯度上升至129°C，然后以40°C /min升温至280°C，保持5min。
[0033] 质量控制：采用外标法和六点校正标准物质制作标准曲线。6种PAEs混标的基质 加标平均回收率为92. 5~110. 2%，相对偏差低于10. 5%，仪器检测限为0. 12~0. 45 ug/g。 该方法满足痕量有机物定量分析要求。
[0034] 结果如图4所示：2D菌在72 h对高浓度的DBP( 1000 mg/L)降 解效率超过80%，在DBP浓度低于200 mg/L时，72 h内DBP几乎完全降解，表明该菌对DBP 具有高效的降解能力。对DBP中间产物的降解能力分析，可以看出该菌的对高浓度邻苯二 甲酸的降解能力显著低于DBP，但对低浓度邻苯二甲酸(< 100 mg/L)降解能力较强(在144 h几乎完全降解）；邻苯二甲酸浓度为200 mg/L时，在144 h的降解率超过90%。说明该菌 对DBP的主要代谢产物邻苯二甲酸也有较强的降解能力，最终将DBP完全矿化。
[0035] 实施例3 2D对污染土壤中DBP的降解研宄 1、供试土壤制备 土壤为华南农业大学农场水稻土，pH为6. 7, C/N为5. 98,风干后过60目筛。动物奠 堆肥采自该农场，pH为8. 8，C/N为17. 49。按照农场常用添加比例(堆肥：土壤=l:15，w/ w)在水稻土中添加堆肥，混匀获得pH = 7.54, C/N为10.8的改良土。将上述未添加堆肥 土 (常规土）和改良土分别添加 DBP，使其浓度均达到100 mg/kg。
[0036] 1、土壤中DBP降解效果分析 实验设置以下处理：接菌的常规土和改良土作为实验组；不接菌的常规土和改良土作 为对照组一；灭过菌的改良土和先灭菌再接2D菌的改良土作为对照组二，每组三个重复。 分别称取上述含100 mg/kg DBP的土壤200 g于三角瓶中，向土壤中添加菌悬液（OD6tltl M = 0. 8 ) 50 mL，充分混匀。将土壤调至田间持水量(约30%的含水量)，在30 °C恒温箱中避光培 养，定期取样并经GC/MS测定土壤中DBP残留量。
[0037] 经过10天的ofeflciasp. 2D的生物强化修复处理，各处理中污染土壤DBP残 留量动态变化见图5。接2D菌的常规土中DBP降解效果显著增强，在第0、2、4、6、8、10天， 土壤中 DBP 残留量分别为 98.41 mg/kg、88.13 mg/kg、75.40 mg/kg、61.25 mg/kg、44.85 mg/kg和34. 46 mg/kg，在第10天的降解率达到了 65%，而未接菌的对照土壤DBP降解率仅 为19%，说明ofeflciasp. 2D菌能够显著增强土壤中DBP的降解。另外，在添加了堆肥 并接菌的改良土中，相对于未添加堆肥的接菌土，DBP的降解效果进一步增强，其第十天的 DBP降解率达到了 88%，表明堆肥可增强土壤中DBP的降解，将2D菌与堆 肥结合使用，可高效修复DBP污染的土壤。
[0038] 另外，未灭菌且接种2D菌的改良土中DBP的降解效率显著高于灭过菌且接种2D 菌的改良土，说明2D菌与改良土中的土著微生物形成协同作用，促进了土壤中的DBP的降 解。
【主权项】
1. 普罗威登斯菌（sp. )2D在DBP污染土壤修复中的应用，其特征在于， 该菌于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏编号为CCTCCM 2015057。2. 普罗威登斯菌sp. 2D在制备DBP污染土壤修复改良剂中的应用，其 特征在于，该菌于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏编号为 CCTCCM2015057。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为将普罗威登斯菌 sp. 2D活化后制得的菌悬液接入DBP污染土壤中。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在DBP污染的土壤中添加动物粪堆肥并 混勾后再接入普罗威登斯菌sp. 2D菌悬液。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述动物粪堆肥与DBP污染土壤的质量 比为1 :15。
【专利摘要】本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体公开了普罗威登斯菌（Providencia sp.）2D在邻苯二甲酸二丁酯污染土壤修复中的应用，该菌于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC M 2015057；在DBP污染的土壤中接种普罗威登斯菌Providencia sp.2D；在第10天DBP降解率达65%，相比对照提高了46%；另外添加了堆肥并接菌的土壤中，其第十天的DBP降解率达88%，表明堆肥可增强土壤中DBP的降解，将Providenciasp.2D菌与堆肥结合使用，可高效修复DBP污染的土壤，对降低农业土壤环境中DBP污染具有广泛的应用前景。CCTCC M 201505720150122
【IPC分类】B09C1/10, C12R1/01, C12N1/20
【公开号】CN104894000
【申请号】CN201510066107
【发明人】莫测辉, 赵海明, 李彦文, 蔡全英, 李慧, 杜欢, 黄献培, 鲁磊安
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年2月9日