一种利用海带高效降解菌株生产海带酒精饮料的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于海洋生物工程技术领域，具体涉及利用一株来自海洋的海带高效降解 菌株发酵生产海带酒精饮料的方法。
【背景技术】
[0002] 海带养殖是西北太平洋海域的特色海水养殖产业,其中，我国的海带养殖在总产 量及养殖规模方面均居世界首位。国家农业部渔业局发布的海洋渔业统计资料显示，目前 的养殖面积已达到4. 1万公顷以上，至2008年已达到近540万吨。而根据世界粮农组织的 统计数据，2002年，我国的海带养殖产量就已占全球海带总产量的89%。
[0003] 海带作为常见经济作物，在我国拥有悠久的食用历史，但是长久以来的低廉身价 及其特殊的物化性质埋没了其珍贵的食用及药用价值。一方面，由于海带属于大型藻类，藻 体结构坚固，而且富含的碳水化合物多为海洋多糖，人体消化系统以及肠道微生物均不具 备相应的降解酶类，简单食用海带无法有效的消化吸收。另一方面，海带的藻腥味也是其被 许多人拒绝的重要因素。
[0004] 同时，海带在我国也拥有悠久的药用历史，在《本草纲目》、《本草经疏》中均有记 载，是一种传统的海洋中药。而在现代医药学的研究方面，自1881年由Stanford首次从海 带中发现褐藻胶以来，其生物活性研究一直持续至今，目前比较确定的褐藻胶（alginate) 生物功能包括抗肿瘤、增强免疫、促进细胞生长、抗凝血、调节血脂、抗病毒等。同时，褐藻胶 寡糖由于分子量低，具有更强的水溶性和稳定性，其生物活性在制药、食品、农业领域的应 用潜力也逐渐受到关注，包括抗氧化活性、抗肿瘤、抗凝血、免疫调节、神经保护、调节肠道 微生态、重金属吸附、抗菌活性、植物生长促进及生理调节等。
[0005] 本发明所述的该株来自海洋的海带高效降解菌株，经长时间改良及优化后，该 菌株现可以有效实现单菌完全降解海带，对于降解产物进行分析，发现降解液中褐藻胶 (alginate)寡糖成分（多为二糖，三糖，四糖）明显升高，同时对于海带特有的腥味也有明 显的去除效果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种利用海带高效降解菌株生产海带酒精饮料的新方法。
[0007] 本发明提供的菌株，分类学命名为Microbulbifer elongates,保藏于中国普通 微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No. 6242,保藏日期2012年06月19日。
[0008] 本发明所述的菌株CGMCC No. 6242特性如下：
[0009] (1)细胞形态：革兰氏阴性菌，细胞形态生长前期为杆状，生长后期为球状，在显 微镜下呈现运动性；
[0010] (2)生理生化特征：好氧生长；在25-50°C、pH6. 0-9. 5、盐度0-6. 0% (w / V)范围 内均能生长，最佳生长条件在37°C、pH7. 5、盐度1.0%左右；可以在4天时间内完全降解海 带块；
[0011] (3)酶学特征：氧化酶阳性；触媒阳性；高效表达包括海藻酸钠裂解酶、海带淀粉 酶及纤维素酶在内的海带降解所需酶；
[0012] ⑷API试剂条检测结果：碱性磷酸盐酶、酯酶（C4)、类脂酯酶（C8)、白氨酸芳胺 酶、缬氨酸芳胺酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α -葡萄糖苷酶、N-乙酰-葡 萄糖胺酶以及硝酸还原酶、葡萄糖苷酶、明胶水解酶、半乳糖苷酶为阳性；类脂酶（C14)、胱 氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-糖醛酸苷酶、 β -葡萄糖苷酶、α -甘露糖苷酶、β -岩藻糖苷酶以及精氨酸水解酶、脲酶、吲哚反应、葡萄 糖酸化反应为阴性。
[0013] 利用通用引物对菌株CGMCC No. 6242的16S rRNA基因进行扩增和序列测定，得到 长度为1409bp的基因片段（Seq ID No. 1)，其序列具体见序列表。将其与细菌16S rRNA基 因序列数据库进行比对，得到其与已知的标准菌株M. elongates的相似性为99. 43%，并且 菌株CGMCC No. 6242的生长限制因子、细胞形态和酶谱都与其对应特征保持一致，因此，这 两株菌为同种不同菌株。
[0014] 本发明利用菌株Microbulbifer elongates CGMCC No. 6242生产含大量海带寡糖 的酒精饮料的方法，该海带寡糖具有较好生物活性，含有该海带寡糖的酒精饮料在行业内 属于空白领域。本方法经种子液发酵、酶发酵、酶处理以及酒精发酵得到海带酒精饮料，包 括以下具体步骤：
[0015] (1)将菌株CGMCC No. 6242接种至种子液培养基，培养之后的菌液作为种子液；
[0016] (2)将种子液转接至酶发酵培养基中进行发酵培养，得到具有海带降解酶活性的 酶发酵液；
[0017] (3)将酶发酵液完全除菌处理后转接至含海带粉的酶解培养基中进行酶解处理， 得到具有大量海带寡糖的发酵液；
[0018] (4)将酿酒酵母接种至种子培养基，培养之后的菌液作为种子液；
[0019] (5)将酿酒酵母种子液转接至补加葡萄糖后的具有大量海带寡糖的发酵液进行发 酵培养，依次经过好氧发酵、厌氧发酵、离心除去海带藻体及酵母菌体后取上清，得到具有 大量海带寡糖的酒精饮料。
[0020] 上述方法步骤（1)中的种子液培养基以及所述方法步骤（2)中的酶发酵培养基的 配方为1 / 3浓度的天然海水中加入0-0. 5%的酵母提取物以及1%的海带。
[0021] 上述方法步骤（3)中的酶解培养基的配方为1 / 3浓度的天然海水中加入6-8% 的海带。
[0022] 上述方法步骤（4)中的种子培养基的配方为酵母抽提物1%、蛋白胨1%以及葡萄 糖2%。
[0023] 上述方法步骤（5)中的补加葡萄糖后的具有大量海带寡糖的发酵液中的葡萄糖 含量为5%。
[0024] 上述方法步骤（1)中菌株CGMCC No. 6242的接种量为10%，培养条件为振荡140 转/分、28°C，培养时间为24小时。
[0025] 上述方法步骤（2)中种子液的接种量为1%，培养条件为搅拌300转/分、28°C、通 气3. 0升/分，培养时间为104小时。
[0026] 上述方法步骤（3)中的处理条件为搅拌50转/分、28°C、不通气，处理时间为24 小时。
[0027] 上述方法步骤（4)中酿酒酵母的接种量为10%，振荡140转/分、35°C，培养时间 为48小时。
[0028] 上述方法步骤（5)中酿酒酵母种子液的接种量为10%，好氧培养条件为搅拌300 转/分、30°C、通气3. 0升/分，培养时间为48小时，厌氧培养条件为28°C、不搅拌、不通气， 培养时间为48小时。
[0029] 上述方法步骤（3)中的酶发酵液的除菌处理过程包括如下步骤：
[0030] (1)酶发酵液经12000转/分，20分钟离心后取上清液；
[0031] (2)上清液通过滤纸过滤后取滤出液；
[0032] (3)上一步得到的滤出液通过0. 45微米孔径的醋酸纤维素滤膜过滤后取滤出液；
[0033] (4)上一步得到的滤出液通过0. 22微米孔径的醋酸纤维素滤膜过滤后得到完全 除菌处理的酶发酵液。
[0034] 上述方法步骤（5)中离心除去海带藻体及酵母菌体的方法：12000转/分，20分钟 离心后取上清。
[0035] 根据上述方法步骤，可以得到的酶发酵液、具有大量海带寡糖的发酵液以及具有 大量海带寡糖的酒精饮料如下：
[0036] (1)所述方法步骤（2)获得酶发酵液中的海藻酸钠裂解酶酶活、海带淀粉酶酶活 以及纤维素酶活分别为 300-1200U / ml、30-300U / ml 及 30-300U / ml ;
[0037] (2)所述方法步骤（3)获得具有大量海带寡糖的发酵液中总糖含量以及还原糖含 量分别为 10_30g / Ul-IOg / 1 ;
[0038] (3)所述方法步骤（5)获得具有大量海带寡糖的酒精饮料中酒精含量为 0· 1-10%。
[0039] 根据需要，可任意选取方法对具有海带降解酶活力的酶发酵液以及具有大量海带 寡糖的发酵液进行后续处理，从中分离纯化得到酶制品以及海带寡糖制品。
【附图说明】
[0040] 图1为DNS-分光光度法中的标准曲线。
[0041] 图2为实施例3中的各种酶活数据。
[0042] 图3为实施例3中的还原糖、总糖以及酒精度数据。
[0043] 图4为实施例3中的海藻酸钠寡糖组成。
【具体实施方式】
[0044] 实施例 IMicrobulbifer elongates CGMCC No. 6242 的酶活力测定。
[0045] 海藻酸钠裂解酶酶活、海带淀粉酶酶活以及纤维素酶活采用DNS-分光光度法测 量，利用了底物在经酶处理后会释放还原糖的原理，通过测定处理前后反应体系内还原 糖含量的变化来衡量酶活性高低，而反应体系中还原糖含量的测定是利用二硝基水杨酸 (DNS)与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕 红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原 糖含量的。
[0046] 具体操作步骤如下：
[0047] (1)试剂准备：
[0048] (a)DNS配制：将6. 3克DNS和262ml2mol / L氢氧化钠，加到500ml含有182克 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加上5克重苯酚和5克亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容 到1000ml，即制成3, 5-二硝基水杨酸试剂，贮于棕色瓶中备用。
[0049] (b)0. 8%底物溶液配制：分别称取0. 8g各种酶相对应的底物（海藻酸钠裂解 酶--海藻酸钠；海带淀粉酶--海带淀粉；纤维素酶一一羧甲基纤维素钠）溶于一定量 的热水中，加入IOmllO倍浓度的I / 15mol / lNa2HP04 / KH2P04缓冲液（pH=7. 38)，冷却 后用100mL容量瓶定容即可。
[0050] ⑵标准曲线测定：
[0051] (a)葡萄