专利名称：一种生产高密度硅酸盐细菌菌剂的工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物生物技术领域，具体地讲，涉及一种微生物肥料(生物钾肥)菌剂及其生产方法，该种微生物为胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)。通过本发明所采用的固体发酵方法生产出高密度的胶质芽孢杆菌菌剂。(生物钾肥)做为生物肥料用于促进各种农作物及树木，草坪的生长。
背景技术：
胶质芽孢杆菌菌剂(生物钾肥)在我国是生产时间最长，生产企业最多，应用面积最大的微生物肥料产品。目前国内约有300家以上的企业生产硅酸盐细菌菌剂，有的专业生产厂家已达到年产10000吨以上的规模。但由于一直采用传统工艺，产品质量存在严重问题，成为限制企业发展的极大障碍。产品质量的核心问题是二个，一是有效菌数太少，农业部行业标准NY227-94规定固体胶质芽孢杆菌菌剂含2亿活菌/克。但目前大多数企业生产的胶质芽孢杆菌细菌菌剂达不到这一标准；二是杂菌严重超标。其主要原因是生产过程还没有解决有效控制杂菌污染的办法。由于产品质量低劣，严重影响田间的使用效果和产品的信誉，制约了产品的推广应用。
技术内容本发明目的在于提供一种提高有效活菌数、控制杂菌污染生产高密度微生物菌剂的方法。该方法适用于一般的好氧微生物菌剂的制备。尤其适用于胶质芽孢杆菌作为菌种的生物钾肥的生产。该工艺的具体措施包括采用胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus K401)作为菌剂的生产菌种(或购自中国科学院微生物研究所的胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CGMCC，1.153 1.231 1.232和1.910等菌株)；将传统的大罐液体发酵生产工艺改为草炭分袋灭菌(采用60Co辐射灭菌，辐射剂量40-60KGY或121℃高压蒸汽灭菌60-120分钟的分袋灭菌方法)、分袋固体发酵的工艺；提高发酵培养基中碳源、氮源的浓度以满足菌体快速生长的需要，添加(NH4)2SO4大大地降低了发酵液的黏度利于菌体的生长。以上具体措施，有效地避免了传统工艺中发酵液吸附、混合及称重、分装等过程造成的二次污染。极大地降低了产品的杂菌率，而且避免了混合过程中草炭粉对环境的污染，改善了工人的工作环境。本发明中提供的生产工艺有效地解决了目前生产中存在的关键问题，使产品中活菌数比传统工艺生产的产品提高了1000倍以上(2000-3500亿活菌/克)。因此，可以通过对2000-3500亿活菌/克进行稀释，大规模地生产直接提供可以使用的产品。本发明提供的生产工艺至今未见有报道，适于在生物菌剂的工业生产中应用。
具体实施例方式
通过以下实施对本发明予以进一步地说明，但并非对本发明技术的限定。
1.菌种胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)K401 CGMCC 1.1531.231 1.232 1.910购自中国科学院微生物研究所2.草炭载体的准备和灭菌将草炭粉与3-10％CaCO3混合后，分装于塑料袋中，每袋100-1000克左右。可根据条件选以下一种灭菌工艺进行灭菌。
1)60Co辐射灭菌，辐射剂量40-60KGY。
2)121℃高压蒸汽灭菌60-120分钟。
如采用蒸汽灭菌工艺应先将固体发酵液预先与草炭粉拌匀。
3.液体发酵1)摇瓶和钭面培养摇瓶培养基 (g/L)蔗糖或葡萄糖10-20K2HPO40.2-0.5MgSO40.2
NaCl 0.2CaCO35.0酵母粉 0.2-2.0H2O 1L琼脂粉 15(斜面培养基)将平皿划线分离纯化的菌种，接种于三角瓶培养基中，在摇床上以150-200转/分，28-37℃培养20-24小时，即得到摇瓶种子。
2)种子罐培养种子罐培养基(g/L)蔗糖或葡萄糖 10-20K2HPO40.2-0.5MgSO40.2NaCl 0.2(NH4)2SO41.0-3.0CaCO35.0酵母粉 0.5-2.0H2O 1LPH 7.0-8.0将摇瓶种子以5-10％比例接入种子罐(无菌操作)转速200 300转/分，温度28-37℃，通气量1∶0.3-0.5，培养20-24小时。
3)固体发酵固体发酵培养基(g/L)蔗糖或葡萄糖 1.0-5.0淀粉或玉米粉 10-25(NH4)2SO42.0-5.0K2HPO42.0-5.0FeCl310mg-20mg酵母粉 1.0-3.0
MgSO40.5-1.0H2O 1LPH 7.0-8.0固体基质草炭粉，碳酸钙固体发酵工艺将培养20-24小时的种子以5-10％的接种量接入固体发酵培养基中，混合均匀后再以30-40％比例与塑料袋内的草炭混合均匀。
将菌剂置于28-37℃培养。一般3-7天即可完成固体发酵得到高密度胶质芽孢杆菌菌剂。
实例1步骤一载体的制备及灭菌。将草炭粉晒干，加3-10％CaCO3混匀后分装于塑料袋中，然后用40-60KGY60Co辐射灭菌。
步骤二接种。将培养20-24小时的种子以5-10％比例加入无固体基质的发酵培养基于发酵罐中，充分混匀后，以30％-40％比例与塑料袋内已灭菌的草炭粉混匀。
步骤三培养。将接种后的草炭粉放置于28-37℃培养室培养，5-7天即可得到每克含2000-3500亿活菌的高密度胶质芽孢杆菌菌剂。
实例2步骤一载体灭菌。按实例1将3-10％CaCO3与草炭粉混匀后分装于塑料袋中，将固体发酵培养基(液体)与草炭粉以3∶7的比例混合，121℃灭菌60-120分钟。
步骤二接种。以5-10％的比例将培养了20-24小时的种子与塑料袋内已灭菌的草炭粉混匀。
步骤三培养。将接种后的草炭放置于28-37℃培养，5-7天即得到每克含2000-3500亿/克的高密度胶质芽孢杆菌细菌菌剂成品。
实例3通过稀释的方法大规模制备固体菌剂步骤一种子的稀释。用每克含2000亿-3500亿活菌数的固体发酵草炭菌剂作为种子，以1∶100-300的比例用0.02-0.1molL-1磷酸缓冲液洗脱，然后再与等体积的固体发酵培养液混合。
步骤二吸附及混合。将步骤一制备的稀释液以30-40％比例吸附到60Co灭菌的草炭中。混匀后即可得到活菌数10亿/克左右的固体菌剂。可直接供给客户使用。
实例4按本发明制备的胶质芽孢杆菌菌剂进行田间接种试验。结果表明，在山东沂水县对萝卜增产幅度为19.7％-24.6％，在安丘县的花生增产幅度为8.5％-24.6％。
权利要求
1.一种利用胶质芽孢杆菌生产微生物菌剂的方法，该方法涉及胶质芽孢杆菌是在含有草炭、CaCO3的高浓度碳源、氮源的固体培养基上进行分袋固体发酵培养；种子罐培养中添加(NH4)2SO4；固体发酵培养基分袋后采用60Co辐射或高压蒸汽灭菌、以及分袋接种的固体发酵的工艺。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的种子罐培养中添加(NH4)2SO4的量为1.0-3.0g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的含有草炭、CaCO3的高浓度碳源、氮源固体发酵培养基，该培养基的组成如下(g/L)蔗糖或葡萄糖1.0-5.0、淀粉或玉米粉10-25、(NH4)2SO42.0-5.0、K2HPO42.0-5.0、FeCl310mg-20mg、酵母粉1.0-3.0、MgSO40.5-1.0、H2O1L、PH7.0-8.0，固体基质为草炭粉，3-10％碳酸钙。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的固体发酵培养基分袋后通过60Co辐射或高压蒸汽灭菌。当采用60Co辐射灭菌时，辐射剂量40-60KGY，或采用121℃高压蒸汽灭菌时间为60-120分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，分袋固体发酵的工艺是将草炭粉与3-10％CaCO3混合后，分装于塑料袋，每袋固体基质为100-1000克左右灭菌；培养20-24小时的种子以5-10％的接种量接入固体发酵培养基中，混合均匀后再以30-40％比例与塑料袋内的固体基质混合均匀。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，分袋固体发酵的工艺是接种后放置在28-37℃培养室培养，5-7天即可得到每克含2000-3500亿/克的高密度胶质芽孢杆菌菌剂。
7.根据权利要求6所述的方法，得到每克含2000-3500亿/克的高密度胶质芽孢杆菌菌剂，通过稀释的方法大规模生产直接提供使用的产品。
8.根据权利要求1或/和2或/和3或/和4或/和5所述的方法，在生物菌剂的工业生产中的应用。
9.根据权利要求7所述的方法，利用胶质芽孢杆菌在生产生物钾肥中的应用。
全文摘要
本发明属于微生物生物技术领域，涉及一种高密度硅酸盐细菌菌剂及其生产方法，该种微生物为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)。通过固体发酵方法生产出高密度的胶质芽孢杆菌菌剂。使产品中活菌数比传统工艺生产的产品提高了1000倍以上(2000－3500亿活菌/克)。生物钾肥做为生物肥料用于促进各种农作物及树木，草坪的生长。
文档编号C12M1/12GK1504563SQ0215296
公开日2004年6月16日 申请日期2002年11月29日 优先权日2002年11月29日
发明者李永兴, 李久蒂 申请人:中国科学院植物研究所