专利名称：一种耐低温硝化细菌的筛选方法
技术领域：
本发明涉及环境微生物技术领域，具体的说是一种耐低温硝化细菌的筛选方法。
背景技术：
硝化细菌是一类具有硝化作用的化能自养细菌，包括亚硝酸菌和硝酸菌两个生理菌群。其主要特性是亚硝酸细菌和硝酸细菌都是绝对好气的自养菌，由于其好氧性，依附性和产酸性，喜欢生长在碱性的土壤中，它们不能在一般含有机质的培养基中生长，生长速率低。由于硝化细菌的上述特点，在一般的污水处理系统中硝化细菌的含量较低。而硝化细菌是生物硝化中起主要作用的微生物，污水中硝化细菌的含量与硝化速度成正比关系。俄国微生物学家维诺格拉德斯基首先利用以硅胶作为凝固剂的无机固体培养基， 分离出这两种菌，并对硝化作用进行了较详细的研究。这两类细菌在人工培养基上的生长量都很少，在硅胶培养基上所形成菌落的直径只不过200 μ m，须用显微镜来观察。此外，这两种菌也难以纯化，常和其他细菌伴生在一起。对于硝化细菌培养方面的研究，国外已有此类技术专利，其中一些已经形成工业化生产，但产品价格较昂贵，并且必须经常性向反应器中投加，以补充流失的硝化细菌量， 并抑制其它菌种的生长。法国的Tappe W.和Tomaschewiski C.采用留有微生物的简易发酵罐来培养硝化细菌，认为在合适的条件下硝化细菌经过5个星期的连续纯培养，其含量可达2. 7 X IO9Amr115 Hung Yuanfang等人提出的通过投加葡萄糖和酵母膏等营养物，促进硝化菌和亚硝化菌的生长，可使焦化废水中90%的氨氮在7 14d内转化为亚硝态或硝态氮，当硝化细菌增加到一定数量后，不需再投加营养物即可维持一定的硝化速率。硝化细菌绝大多数都是专性化能无机营养菌，一般的种类不能在有机培养基上生存，也不需要外源生长因素，对营养的要求，专一性很强。在实验室对硝化细菌的分离通常较为困难，以致有关它们的细菌学和生物化学的研究工作进展很慢。主要原因是，硝化细菌的代时长，平均在IOh以上，伴生的异养细菌生长迅速，超过硝化细菌。而一般细菌代时约几十分钟，繁殖速度快。另外，硝化细菌具有生长在固体表面的习性，即使在液体培养基上， 他们也往往附着在不溶性固体颗粒或器壁表面上，粘连在一起，给分离工作带来不便。据文献报道的硝化细菌的最适宜生长温度多为30 35°C，这样高的温度在污水处理的实际运行过程中无法达到，对北方寒冷地区来说，偏低的水温明显不利于普通的硝化细菌发挥其对氨氮的去除作用。因此，探求一种新型的筛选低温硝化细菌的方法是十分必要的。研究和利用低温硝化细菌的硝化作用，开发经济的硝化细菌富集技术，提高硝化细菌的产率，加速生活污染物的处理，减轻环境污染负荷，对于在特殊环境下工作的人群， 提供良好的生存环境，对我国的污水处理和环境保护事业具有着重要的意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种筛选低温硝化细菌的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种耐低温硝化细菌的筛选方法 1)富集培养取样品接种于硝化细菌培养基中在，接种量为0. 5-lml，在15_20°C、 150-160r/min下恒温振荡培养10-20天，待用；2)稀释培养取上述培养的样品在好氧条件下倍比稀释；3)稀释分离取上述稀释的各梯度的菌悬液分别培养于硝化细菌培养基中于好氧培养箱中10-15°C恒温培养直至长出菌落；4)纯化分离挑取上述稀释分离后的各梯度单菌落于硝化细菌培养基中进行平板划线分离，于10-15°C培养箱中培养7-14d，得到单菌落；所得菌落进行多次平板划线分离，直至获得纯菌落；5)检测将上述获得的纯菌落进行性能检测，选取好氧硝化性能优异的菌株，即筛选出好氧硝化细菌菌株；所述硝化细菌培养基为亚硝酸细菌培养基和硝酸细菌培养基；亚硝酸细菌培养基成分为每升培养基是由2.0g(NH4)2S04、0. 25gNaHP04、0.01g MnSO4. 4Η20、0· 75g Κ2ΗΡ04、0· 03g MgSO4. 7Η20、1· Og CaCO3 和蒸馏水组成，ρΗ7· 2 ；硝酸细菌培养基成分为每升培养基是由 l.Og NaNO2U. 0gNa2C03>0. 25g NaH2PO4U. Og CaC03、0. 75g Κ2ΗΡ04、0· Olg MnS04、0. 03gMgS04 · 4H20 和蒸馏水组成，pH7. 2。所述硝化细菌的检测将筛选出的好氧硝化细菌菌株接种于氨氧化能力鉴定培养液中，于10-15°C条件下培养7-14天，培养期间每隔3天取2ml培养液，再取出的培养液中将格里斯试剂1-2滴直接点滴入，培养液变红即具有硝化活性。所述格里斯试剂为A液和B液，A液为对氨基苯磺酸0. 5g、稀醋酸150mL ；B液为α -萘胺0. lg、蒸馏水20mL、稀醋酸150mL。所述氨氧化能力鉴定培养液为亚硝酸细菌培养基，其成分为每升培养基是由 2. Og(NH4)2SO4^O. 25g NaHP04、0. Olg MnSO4. 4Η20、0· 75g Κ2ΗΡ04、0· 03gMgS04. 7H20、1. Og CaCO3和蒸馏水组成，pH7. 2本发明所具有的优点1、采用本发明可从混合微生物系统中分离筛选好氧且耐低温(10_15°C )的硝化细菌，与现在所使用的方法相比，具有简便、快速、重复性好、分离菌株效果好、准确可靠等特点。2、采用本发明方法筛选出来的耐低温硝化细菌可用于北方地区污水处理冬季低温运行，同时可以提高低温条件下污水处理系统出水NH3-N和COD的处理效果。
图1为本发明实施例筛选出的硝酸细菌和亚硝酸细菌图片。图2为本发明实施例检测筛选出的硝酸细菌和亚硝酸细菌的检测效果图。图3为本发明实施例检测筛选出的硝酸细菌和亚硝酸细菌的检测效果图。
具体实施例方式样品采集在北部污水处理厂曝气池中。使用的主要仪器和设备有
立式高压蒸汽灭菌器Hirayama\日本，型号HVE-50 ；生化培养箱广东省医疗器械厂，型号LRH-250A ；垂直流双人洁净工作台吴江市伟峰净化设备有限公司，型号SW-CJ-2F ；恒温水浴摇床Grant\英国，型号0LS200 ；正置生物显微镜01ympus\日本，型号CX41 ；筛选方法1)富集培养在无菌操作台上，采集两份样品，分别接入事先已灭菌，内装有玻璃珠的90mL硝酸细菌或亚硝酸细菌培养基的三角瓶中，每瓶培养集中样品为IOmL或固体样品10g，置于0LS200恒温水浴摇床内以？ °C、150-160r/min培养10天待用；目的是打散菌胶团，使细菌成单细胞状态分散于水中，同时使泥样中的硝化细菌数量增大。所述亚硝酸细菌培养基和硝酸细菌培养基分别为亚硝酸细菌培养基成分为 每升培养基是由 2. Og(NH4)2SO4^O. 25g NaHP04、0. Olg MnSO4. 4Η20、0· 75g Κ2ΗΡ04、0· 03g MgSO4. 7H20、l.Og CaCO3和蒸馏水组成，pH7. 2 ；硝酸细菌培养基成分为每升培养基是由 l.Og NaNO2U. Og Na2C03、0. 25gNaH2P04、1. Og CaC03、0. 75g Κ2ΗΡ04、0· Olg MnS04、0. 03g MgSO4 · 4H20和蒸馏水组成，pH7. 2。2)稀释培养从富集培养的亚硝酸细菌菌悬液和硝酸细菌菌悬液中分别取出ImL 菌悬液，分别接入装有9mL无菌水的试管内，分别得到KT1梯度的菌悬液，按上述方法可以得到10-2、10_3、10-4......10_8梯度的菌悬液。3)稀释分离分别选取梯度10_4 10_8的亚硝酸细菌菌悬液和硝酸细菌菌悬液 (培养后可以清晰观察菌落形态，得到更多的单一菌落)，分别取ImL菌悬液放入平皿，然后在各自的平板上加入各自适当的培养基混勻，待培养基凝固后倒置平皿，放入培养箱中培养7 14d，温度控制在10-15°C。待细菌单个细胞或同一类细胞在培养基上形成菌落之后， 挑取单个菌落于斜面培养基上培养，做好标记，以备后续使用。培养温度控制在10-15°C。细菌广泛存在于大自然生态系统中，根据其温度生长特性，可将其分为高温菌、中温菌和低温菌(最低生长温度为-5-0°C，最适生长温度为 15-20°C，最高生长温度为25-30°C )。其中低温菌又可分为嗜冷菌(最高生长温度不超过 20°C、最适生长温度在15°C以下、在0°C可生长繁殖)、耐冷菌(最高生长温度高于20°C、最适生长温度在15°C以上、在0-5°C可生长繁殖)。4)纯化分离分别从上述稀释分离后的亚硝酸细菌和硝酸细菌菌种的斜面培养基的菌苔挑出少许分别进行平板划线分离，以便进一步纯化。整个过程均需要无菌操作。 首先从斜面培养基上挑取少量生长的菌，然后在事先制好的平板上划线(注意不要划破琼脂表面)。划线时要在所划的范围内尽量划满，然后将接种环灼烧，再转动一定的角度连接已划线的区域再划另一区，最后划满整个平皿，于10-15°C培养箱中培养7 14d，得到单菌落。将不同的单菌落转接到斜面上，反复几次后便可分别获得亚硝酸细菌和硝酸细菌纯的单株菌株。将所得菌株分别接种到各自适宜的固体培养基上富集培养。经过7-14天， 10-15°C生化培养箱的培养，发现硝酸细菌比亚硝酸细菌生长旺盛，菌落明显，基本上呈现出规则的圆形或椭圆形和不规则形状。规则形状的菌落表面光滑呈现乳白色。另外，硝化细菌的培养基由原来的棕色变成无色(参见图1)。
5)检测将上述获得的纯菌落进行性能检测，选取好氧硝化性能优异的菌株，即筛选出好氧硝化细菌菌株；(1)硝化活性的测定将经分离纯化后获得的硝化菌株用接种环挑取一菌环菌苔分别接种于氨氧化能力鉴定培养液，即上述亚硝酸细菌培养基，于10-15°C条件下培养7-14天，培养期间每隔3 天取2ml培养液至洁净试管，将格里斯试剂1-2滴直接点滴入试管中进行硝化活性确认，并以不接纯化菌株的氨氧化能力鉴定培养基作空白对照，若培养液变红即可确定具有硝化活性。所述格里斯试剂为A液和B液，A液为对氨基苯磺酸0. 5g、稀醋酸150mL ；B液为α -萘胺0. lg、蒸馏水20mL、稀醋酸150mL。(2)硝化细菌的检测检测过程依照申请号为200910220600. 8，发明名称一种改进的硝化细菌Diphenylamine-Griess检测方法的专利申请案进行。取上述亚硝酸细菌培养液于白瓷比色板上，加格里斯试剂甲液和乙液各一滴，培养液呈红色，如图2所示。说明有亚硝酸菌的存在，证明有亚硝化作用。在亚硝酸细菌培养液中加入盐酸(HCl H20 = 1 1)5 8滴使之酸化，再加入数粒氨基磺酸铵，看到试管底部有气体逸出，培养基颜色基本无色；当停止放气时，再加入一粒氨基磺酸铵，此过程中 NO2-转化为队而逸去，培养基颜色为无色。加Griess试剂，培养液不呈现红色，证明培养物中不含有NO”(因为NO2-影响硝酸的显色反应，所以必须去除)。将反应后的培养液滴加到白瓷比色板上，然后滴加3-5滴二苯胺，培养液呈现蓝色，如图3所示。这表示亚硝酸已被氧化成硝酸，说明硝酸化的存在，则证明筛选出来的细菌是硝酸细菌。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种耐低温硝化细菌的筛选方法，其特征在于1)富集培养取样品接种于硝化细菌培养基中在，接种量为0.5-lml，在15-20°c、 150-160r/min下恒温振荡培养10-20天，待用；2)稀释培养取上述培养的样品在好氧条件下倍比稀释；3)稀释分离取上述稀释的各梯度的菌悬液分别培养于硝化细菌培养基中于好氧培养箱中10-15°C恒温培养直至长出菌落；4)纯化分离挑取上述稀释分离后的各梯度单菌落于硝化细菌培养基中进行平板划线分离，于10_15°C培养箱中培养7-14d，得到单菌落；所得菌落进行多次平板划线分离，直至获得纯菌落；5)检测将上述获得的纯菌落进行性能检测，选取好氧硝化性能优异的菌株，即筛选出好氧硝化细菌菌株；所述硝化细菌培养基为亚硝酸细菌培养基和硝酸细菌培养基；亚硝酸细菌培养基成分为每升培养基是由2. Og (NH4) 2S04、0. 25gNaHP04、0. Olg MnSO4. 4Η20、0· 75g Κ2ΗΡ04、0· 03g MgSO4. 7Η20、1· Og CaCO3和蒸馏水组成，ρΗ7· 2 ；硝酸细菌培养基成分为每升培养基是由 1. Og NaNO2U. Og Na2C03>0. 25g NaH2PO4U. Og CaC03、0. 75g Κ2ΗΡ04、0· Olg MnS04、0. 03gMgS04 · 4H20 和蒸馏水组成，pH7. 2。
2.按权利要求1所述耐低温硝化细菌的筛选方法，其特征在于所述硝化细菌的检测 将筛选出的好氧硝化细菌菌株接种于氨氧化能力鉴定培养液中，于10-15°C条件下培养 7-14天，培养期间每隔3天取2ml培养液，再取出的培养液中将格里斯试剂1_2滴直接点滴入，培养液变红即具有硝化活性。
3.按权利要求1所述耐低温硝化细菌的筛选方法，其特征在于所述格里斯试剂为A 液和B液，A液为对氨基苯磺酸0. 5g、稀醋酸150mL ；B液为α -萘胺0. lg、蒸馏水20mL、稀醋酸150mL。
4.按权利要求1所述耐低温硝化细菌的筛选方法，其特征在于所述氨氧化能力鉴定培养液为亚硝酸细菌培养基，其成分为每升培养基是由2. Og(NH4)2SO4^O. 25g NaHPO4, 0. Olg MnSO4. 4Η20、0· 75g Κ2ΗΡ04、0· 03gMgS04. 7Η20、1· Og CaCO3 和蒸溜水组成，ρΗ7. 2。
全文摘要
本发明涉及环境微生物技术领域，具体的说是一种耐低温硝化细菌的筛选方法。取样品接种于硝化细菌培养基中，接种量为0.5-1ml，在10-15℃、150-160r/min下恒温振荡培养10-20天，取上述样品在好氧条件下倍比稀释；取稀释的各梯度的菌悬液分别培养于硝化细菌培养基中于好氧培养箱中10-15℃恒温培养直至长出菌落；纯化分离挑取稀释分离后的各梯度单菌落于硝化细菌培养基中进行平板划线分离，于10-15℃培养箱中培养7-14d，得到单菌落；进行多次平板划线分离，直至获得纯菌落；将获得的纯菌落进行性能检测，选取好氧硝化性能优异的菌株，即筛选出好氧硝化细菌菌株；采用本发明方法筛选出来的耐低温硝化细菌可用于北方地区污水处理冬季低温运行，同时可以提高低温条件下污水处理系统出水NH3-N和COD的处理效果。
文档编号C12R1/01GK102286390SQ20101020242
公开日2011年12月21日 申请日期2010年6月18日 优先权日2010年6月18日
发明者代秀兰, 匡德舜, 张丹, 张巍, 晁雷, 李晓东, 赵军, 郎咸明 申请人:辽宁北方环境保护有限公司, 辽宁省环境科学研究院