专利名称:一种反硝化细菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及环境微生物领域，尤其涉及一种反硝化细菌及其应用。
背景技术：
近年来，含氮工业污水的排放以及农业过量施用化肥，导致硝酸盐、亚硝酸盐等含氮化合物污染地下水和地表水，直接或间接危害饮用水水质及人类身体健康。含氮污水进入水体引发的水质恶化及富营养化问题亦日趋严重，氮素污染亟待解决。
生物脱氮处理含氮污水的方法以其成本低、能耗小、处理效果好、不产生二次污染等优点成为主流脱氮技术。近二十年来，国内外发展了一批高效经济的生物脱氮新工艺，包括:同步硝化反硝化工艺、亚硝酸型硝化反硝化工艺、短程硝化-厌氧氨氧化工艺以及限氧自养硝化-反硝化(OLAND)工艺等。
生物脱氮过程包括硝化作用与反硝化作用。硝化作用只能改变氮素在水体中的形态，而不能从污水中脱除，排入环境仍然会引起水体富营养化，还可能生成致癌的亚硝基化合物。亚硝酸或硝酸需进一步在反硝化微生物的作用下还原为氮气，才能实现氮素的根本脱除。因此，反硝化微生物是重要的脱氮功能微生物。
反硝化微生物主要是通过诱导产生硝酸还原酶和亚硝酸还原酶对硝酸盐和亚硝酸盐进行还原。它在分类学上没有专门的类群，是具有反硝化作用的一类微生物的总称。反硝化微生物具有丰富的生物多样性，既涉及古生菌域的众多种类，如嗜热细菌(Pyrobaculum areophilum)、铁细菌(Ferroglobus placidus)等，也涉及细菌域的众多种类。反硝化作用的电子供体可以是有机物也可以是无机物(如硫化氢、氢等)。反硝化细菌的培养需在缺氧或兼氧条件下进行，适宜生长温度为20 35°C，适宜pH为6 8。异养反硝化菌在反硝化作用中占主要地位，迄今为止，国际上已分离到多种反硝化微生物，主要有:产碱杆菌属(Alcaligenes)、水螺菌属(Aquaspirillum)、固氮弧菌属(Azoarcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、陶厄氏菌属(Thauera)等。于爱鸾等(于爱茸，李尤等，《微生物学杂志》，2005，25 (3):77-81)报道了一株兼氧的反硝化细菌，命名为芽孢杆菌W2，在溶解氧(DO)达到2mg/L时，该菌株的除氮率达到97%;张小玲等(张小玲，梁运祥，《淡水渔业》，2006, 36 (5):28-32)报道了一株反硝化细菌，属于芽孢杆菌属，该菌株对硝态氮和亚硝态氮的降解率可分别达到94.79%和99.94%。近年来，国内科研学者如李卫芬等(李卫芬，傅罗琴等，《环境科学》2011,32(8):2403-2408)、杨小龙等(杨小龙，李文明等，《微生物学报》，2011,51(8):1062-1070)、郑佳佳等(郑佳佳，沈涛等，《水生生物学报》，2012,36(1):161-167)都陆续分离出不同种属、不同特性的反硝化细菌。
公开号为CN102220264A的中国专利文献公开了一株兼性厌氧反硝化细菌，该菌株命名为Pseudomonas stutzeri LZ-14,属于假单胞菌属的施氏假单胞菌,该菌株能够有效脱除水体中的氨氮、硝酸氮、亚硝酸氮及其混合物，降低总氮浓度，总氮去除率75.9%，还可同时去除有机污水中的CODcr，去除率为53.1 %， 但是对硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的耐受性不高，仅为40mg/L，具体的脱氮速率也未经报道，很难确定其实际脱氮能力。[0007]又如公开号为CN102220265A的中国专利文献公开了一株反硝化细菌，该细菌命名为Paenibacillus sp.XP1，该细菌强化香蒲湿地脱氮，在水力停留时间96小时的情况下，氮的去除率由14%升高到94%，仍存在脱氮效率不高的问题，该菌株的最佳C/N为7，在低C/N的污水脱氮的实际应用上受到一定制约，
公开号为CN102676431A的中国专利文献公开了一种反硝化细菌LR，该菌株联合水体植物联合去氮，并未描述该细菌直接应用水体中脱氮能力，在利用DM培养液测定该细菌的脱氮能力时，该菌株在60h后氮素去除率才达到90%以上。
综合上述文献及相关专利报道，虽然文献和相关专利报道的反硝化细菌都表现出一定的脱氮效率，但这些报道大都基于实验室的研究，在给定的实验室条件下得出了的结论，虽然具有一定的参考价值，但实际在污水脱氮应用中脱氮效果如何，有待进一步验证，而且大多数报道的反硝化细菌硝酸盐和亚硝酸盐的耐受力不高或脱氮效率不高等问题，在实际应用上受到一定制约。
因此筛选具有高效脱氮能力的反硝化细菌，直接采用人工培养生产，然后经化学方法固定后投加到污染水体中，对于控制水体富营养化，处理污水和净化水域有着极大的利用价值。
发明内容
本发明提供了一种反硝化细菌，脱氮能力高，可有效去除污水或水体中的硝酸盐
氮、亚硝酸盐氮及化学需氧量。
一种反硝化细 菌，分类命名为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia), 完整命名为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmal tophi I ia) CM-NRD3,该菌株已于 2012 年 11 月 12 日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2012455。
本发明菌株在固体培养基上，菌落呈浅黄色，圆形，表面光滑湿润，显微镜观察该菌株为杆状，大小为(0.6 0.8) μ Χ (1.2 1.4) μ m，革兰氏反应呈阳性。
所述固体培养基的成分为:
CH3COONa, 2.5g/L ；NaNO3,1.2g/L ；K2HPO4,0.5g/L ；MgS04.7H20,0.lg/L ;微量元素溶液，2mL/L ;琼脂，1.5 2% ;pH调节至7.2 7.6 ;
其中，微量元素溶液组分为:
EDTA, 2.06g/L ；FeS04.7H20,1.54g/L ；MnCl2.4H20,0.2g/L ；ZnSO4.7H20,0.lg/L ；CuSO4.5H20，0.02g/L ；Na2Mn04,0.lg/L ；CoCl2.6H20，0.002g/L。
本发明还提供了所述嗜麦芽寡养单胞菌CCTCC M 2012455在污水生物脱氮中的应用。
具体包括:在污水处理系统的缺氧池或/和厌氧池内中加入填料和接入嗜麦芽寡养单胞菌CCTCC M 2012455，挂膜完成后向缺氧池或/和厌氧池内连续通入污水进行处理。
为促使菌株快速的生长在填料上，在加入填料的同时还向缺氧池或/和厌氧池内加入营养物质。所述营养物质包含菌株生长的碳源、氮源和无机盐。所述碳源可以葡萄糖，所述氮源可以为硝酸钠，所述无机盐可以为FeSO4.7H20, MnCl2.4H20、ZnSO4.7H20等。[0021 ] 所述污水处理系统为厌氧-好氧工艺系统、厌氧-缺氧-好氧工艺系统、序批式活性污泥系统、流化床生物膜反应器系统等。
填料为细菌的生长提供载体，所述的填料可以为聚氨酯海绵、拉西环、活性炭等。
所述填料在厌氧池或缺氧池中的填充率为20 30%。填充率过大，不利于菌株形成优势种群的，填充率过小，则细菌生长的生物量过少，影响脱氮效率。
在向污水处理系统接入本发明菌株前，通常先对本发明的菌株进行扩大培养。所述扩大培养的温度为30 35°C，时间为1.5 4天。
所述挂膜的时间为3 4天。时间过短，菌株尚未在填料上繁殖足够的生物量形成生物膜，时间过长，则菌株老化，反硝化能力下降。
污水处理时，缺氧池或/和厌氧池内的温度为20 40°C，pH为7 7.5，其中缺氧池内的溶解氧浓度为0.2 0.5mg/L，厌氧池内的溶解氧的浓度小于0.2mg/L。
在该条件下，有利于本发明细菌生长增殖，保持高效的脱氮能力，对污水中的硝酸盐氮或亚硝酸盐氮进行还原。
与现有技术相比，本发明的有益效果为:
(I)本发明菌株对硝酸盐氮和亚硝酸盐氮均具有很强脱氮能力，尤其对硝酸盐氮，该菌株的反硝化能力非常高，最高反硝化速率可达19.86mg.L-1.h—1，是一般反硝化菌的1.45 18.22 倍。
(2)本发明菌株能很好的利用亚硝酸盐，适合多种氮素污染型的水质，也可以用于短程硝化反硝化工艺，能应用于低C/N水体的生物脱氮处理，有利于其推广应用。
(3)本发明菌株不仅能去除硝酸盐氮、亚硝酸盐氮或其混合物，还能去除污水或水体中的化学需氧量，实际生活污水总氮去除率达到80%以上，化学需氧量去除率达到90%以上，较现有技术有很大提升。
(4)本发明细菌为兼氧细菌，在厌氧和缺氧的条件都表现出很好的脱氮效果，并且对硝酸盐氮的耐受性很高。
图1为嗜麦芽寡养单胞菌CCTCC M 2012455的透射电镜照片；
图2为嗜麦芽寡养单胞菌CCTCC M 2012455基于16S rDNA序列同源性构建的系统发育树；
图3为嗜麦芽寡养单胞菌CCTCC M 2012455脱氮时硝酸盐氮浓度与反硝化速率的关系;
图4为嗜麦芽寡养单胞菌CCTCC M 2012455脱氮时亚硝酸盐氮浓度与反硝化速率的关系;
图5为温度对嗜麦芽寡养单胞菌CCTCC M 2012455生长速率的影响；
图6为pH对嗜麦芽寡养单胞菌CCTCC M 2012455生长速率的影响；
图7为嗜麦芽寡养单胞菌CCTCC M 2012455在最优条件下的生长曲线及反硝化效果;
图8为嗜麦芽寡养单胞菌CCTCC M 2012455对生活污水中总氮(TN)的去除曲线；
图9为嗜麦芽寡养单胞菌CCTCC M 2012455对生活污水中化学需氧量(CODcr)的去除曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。
实验测定方法
总氮(TN)的测定:碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法；
化学需氧量(CODer)的测定:快速消解分光光度法；
pH值的测定:玻璃电极法；
硝酸盐氮(NO3--N):紫外分光光度法；
亚硝酸盐氮(Ν02_-Ν):N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法；
细菌生长量:比池法，以0D_表示。
实施例1嗜麦芽寡养单胞菌CCTCC M 2012455的分离鉴定
(I)液体培养基
CH3COONa, 2.5g/L ；NaNO3,1.2g/L ；K2HPO4,0.5g/L ；MgS04.7H20,0.lg/L ;微量元素溶液，2mL/L ;pH调节至1.2 1.6，121°C灭菌20分钟；
其中，微量元素溶液组分为:
EDTA, 2.06g/L ；FeS04.7H20,1.54g/L ；MnCl2.4H20,0.2g/L ；ZnSO4.7H20,0.lg/L ；CuSO4.5H20，0.02g/L ；Na2Mn04,0.lg/L ；CoCl2.6H20，0.002g/L。
固体培养基为上述液体培养基成分中添加1.5 2%的琼脂。
(2)菌株分离和筛选
本发明菌株从嘉兴污水处理厂连续运行的移动床生物膜(MBBR)反应器中填料生物膜上分离获得。
①取填料生物膜上的污泥样品系列稀释10°、IOiUO2UO3UO4UO5倍后，用液体培养基30°C，150r/min富集反硝化细菌；
②选择稀释度最高的阳性培养液涂布于固体培养基上，30°C倒置培养，菌落长出后用划线法分离纯化；
③经多次划线纯化后，挑取单菌落接种至液体培养基中，300C，150r/min恒温培养3 5天，定期观察产气情况并测定硝酸盐氮含量，从中筛选出反硝化活性高的菌株，将其命名为CM-NRD3，对该菌株进行形态观察和鉴定。
a、CM-NRD3菌株的菌落、菌体形态观察
菌体形态学研究:对菌体进行革兰氏染色，在光学显微镜(Leica，德国)16X100油镜下进行观察。
菌体内部结构研究:对菌体进行超薄切片，用透射电子显微镜(JEM-1200EX，日本)观察菌体内部结构。
本发明菌株的菌落呈浅黄色，圆形，表面光滑湿润。显微镜下观察发现，该菌株的菌体呈杆状，大小为(0.6 0.8) μ mX (1.2 1.4) μ m，革兰氏染色反应呈阳性，图1为本发明菌株的透射电镜照片。
b、CM-NRD3菌株的分子生物学鉴定
用细菌基因组DNA提取试剂盒(BS423，上海生工生物工程有限公司)提取CM-NRD3菌株的DNA，采用细菌通用引物扩增16S rDNA，将获得的PCR产物纯化后委托宝生物工程有限公司(Takara)测序。
细菌通用引物为:
上游引物(27f):5，-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3，；
下游引物(1492r):5，-GGYTACCTTGTTACGACTT-3，。
PCR扩增体系如表I。
表I PCR扩增体系
权利要求
1.一种反硝化细菌，其特征在于，命名为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)CM-NRD3，保藏编号为 CCTCC NO:M2012455。
2.如权利要求
1所述的反硝化细菌在污水生物脱氮中的应用。
3.如权利要求
2所述的应用，其特征在于，在污水处理系统的缺氧池或/和厌氧池内中加入填料和接入嗜麦芽寡养单胞菌CCTCC M2012455，挂膜完成后向缺氧池或/和厌氧池内连续通入污水进行处理。
4.如权利要求
3所述的应用，其特征在于，在加入填料的同时还向缺氧池或/和厌氧池内加入营养物质。
5.如权利要求
3所述的应用，其特征在于，所述污水处理系统为厌氧-好氧工艺系统、厌氧-缺氧-好氧工艺系统、序批式活性污泥系统或流化床生物膜反应器系统。
6.如权利要求
3所述的应用，其特征在于，所述填料为聚氨酯海绵。
7.如权利要求
3所述的应用，其特征在于，所述填料在厌氧池或缺氧池中的填充率为20 30%。
8.如权利要求
3所述的应用，其特征在于，所述挂膜的时间为3 4天。
9.如权利要求
3所述的应用，其特征在于，污水处理时，缺氧池或/和厌氧池内的温度为20 40℃ph为7 7.5。
专利摘要
本发明公开了一种反硝化细菌及其应用，该反硝化细菌命名为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)CM-NRD3，已于2012年11月12日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NOM2012455。本发明还提供了嗜麦芽寡养单胞菌CCTCC M2012455在污水或水体中生物脱氮的应用。本发明菌株对硝酸盐氮和亚硝酸盐氮均具有很强脱氮能力，还能去除污水或水体中的CODcr，适合多种氮素污染型的水质，也可以用于短程硝化反硝化工艺，能应用于低C/N水体的生物脱氮处理，有利于其推广应用。
文档编号C12R1/01GKCN103074277SQ201210585869
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月28日
发明者谢柳, 杨岳平, 杨浩峰, 周俊利, 胡安辉, 张挺 申请人:浙江至美环境科技有限公司, 湖州环境科技创新中心, 浙江大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan