一种肠道细菌培养方法及其培养基的制作方法

专利名称：一种肠道细菌培养方法及其培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术，特别涉及一种肠道细菌培养方法及其培养基。
背景技术：
在人体的肠道内栖息着大约10"个约400 500种细菌，是人体细胞总数的 10 20倍。肠道内的细菌对人体肠道的生长发育、免疫功能、消化吸收等功能 起着重要的作用。为了更好的研究肠道正常菌群的功能以及与机体的相互关系， 对肠道内细菌的分离、鉴定和定量非常重要。到目前为止，人们对肠道正常菌 群的了解是通过对粪便标本选择性培养计数菌落数而获得的。随着分子生物学 的发展以及分子生物学技术在微生态领域的应用，人们对微生态学的研究取得 了突破性的进展，如Suau A等用针对16SrRNA的细菌域通用引物采用PCR法对 粪便标本的DNA进行特异性扩增，得到284个平均长度500bp的16SrDNA片段， 对这些片段进行测序和种系分析发现284个16SrDNA片段对应于82个分子菌种 (1);变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一个遗传指纹技术，根据PCR扩增16SrDNA 片段的电泳，它能检测微生物的多样性。但这些技术有明显的不足，它们仅仅 只提供样本中的细菌种类和数量，而对于每一细菌的特性，如生化特性、代谢 特性、遗传特性等则不能反映。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种肠道细菌培养方法， 取新鲜粪便放入加有玻璃珠的稀释液A的试管中，在混匀器上混匀3分钟以上， 按连续稀释法，释成10 —' 10 —8个稀释度，将培养基平皿根据不同的涂布浓度 分区，取各相同量的以上稀释后的混合液分别加到分区中，涂布均匀，平板于 恒温箱37'C孵育培养。
所述的细菌为肠道需氧菌或肠道厌氧菌；肠道需氧菌为大肠埃希菌、肠球 菌或酵母菌，肠道厌氧菌为双岐杆菌、乳杆菌、类杆菌或总厌氧菌。
所述的细菌为肠道需氧菌，所用平板置于有氧条件下，于恒温箱37'C孵育培养22 24小时；肠道厌氧菌所用平板放入厌氧盒或手套厌氧箱内，于恒温箱 37"C孵育培养72小时。
留取观察对象新鲜粪便标本2 5g，于0. 5小时内送检，称取0. 5克粪便 样本放入加有玻璃珠的9mL稀释液A的试管中，在混匀器上混匀至少3分钟， 按连续稀释法，释成10 —' 10 —8个稀释度，将培养基平皿根据不同的涂布浓度 分区，取各50uL的以上稀释后的混合液分别加到分区中，涂布均匀，平板于 恒温箱37"C孵育培养。
所述的细菌为大肠埃希菌，所用培养基为伊红美兰培养基。
一种所述培养基的制备方法，所述培养基为肠球菌培养基，取胰胨2g，酵 母粉O. 375g，葡萄糖O. 2g， Na2HP040 . 4g， NaH2PO40. 4g，琼脂0. 4g，加水100mL， 用1MNaOH调pH值至7. 4， 121。C高压15分钟，冷却至55°C，加入叠氮钠40mg， 2, 3， 5 —氯化三苯基四氮唑10mg。
一种所述的培养基的制备方法，所述培养基为双歧杆菌选择性培养基，取 胰蛋白胨IO g，植质蛋白胨5 g，酵母粉2.5 g，吐温-80 1 mL，葡萄糖5 g， 盐酸半胱氨酸0. 5 g， K2HP04 2 g， MgCl. 7H20 0 . 5 g， ZnS04. 7H20 0 . 25 g， CaCl2 0.15 g， FeCl3微量，琼脂12 g，加入IL ddH20，调pH至6. 5， 121。C高压15 分钟。
一种所述的培养基的制备方法，所述培养基为乳酸杆菌选择性培养基，取 MRS 62g，盐酸半胱氨酸0. 5 g，亮绿0. 1 g，加入1L ddH20，用2. 5 M HCL调 pH至5.0， 12rC高压15分钟，冷却至55。C，万古霉素浓度至20 mg/L，混匀 后倒平板。
一种所述的培养基的制备方法，所述培养基类杆菌选择性培养基，在lOOmL EG培养基中，加入已用灭菌水溶解的牛磺胺酸O. lg、新霉素20mg、亮绿20mg， 再用10。/。NaOH调至澄清，12rC高压15分钟，冷却至55。C，加入5 8%的羊血。
一种所述的培养基的制备方法，所述培养基为总厌氧菌选择性培养基，牛 肉粉2.4g，胰胨10g，酵母粉5g，已用0.訓CL溶解过的胱氨酸0. 2g，Na異4g， 葡萄糖1. 5g，盐酸半胱氨酸0. 5 g，可溶性淀粉1. 5g，琼脂12g，加入1000mL 水，用NaOH调pH至7.8， 121。C高压15分钟，冷却至55。C，加入5 腦的羊 血。
本发明具有以下有益效果本发明的方法较为直观地反映标本中细菌的种类和数量，且对培养的细菌可以作进一步的研究和分析，生化特性、代谢特性、 遗传特性等。目前，虽然分子生物学技术可以快速鉴定厌氧菌，但此类技术主
要依据细菌的RNA或DNA来鉴定，并不能区分活菌或死菌，也不能反映出细菌的 生理状态。如在我们实验室建立的双歧杆菌冻干保存技术就要以厌氧菌培养技 术为基础的，先用选择性培养基将双歧杆菌培养，分离出单个菌落后扩大培养， 再用冻干保存技术保存细菌。
具体实施例方式
下面结合附图
与具体实施方式
对本发明作进一步详细描述
本技术采用连续稀释法，即留取观察对象新鲜粪便标本2 5g，于0.5小时 内送检。称取0.5克粪便样本放入加有玻璃珠的9mL稀释A液的试管中，在混匀器 上混匀至少3分钟，按连续稀释法，释成10 —1 10 —s个稀释度。根据不同细菌的 正常菌数范围，选择不同的稀释度进行培养。根据不同细菌的正常菌数范围， 选择不同的培养基进行分区培养。将培养基平皿根据不同的涂布浓度分区，取 各50uL的以上稀释后的混合液分别加到分区中，涂布均匀；需氧平板置于有氧 条件下，于恒温箱37。C孵育培养24小时后观察结果。厌氧菌所用平板放入厌氧 盒内，于恒温箱37"孵育培养72小时后，计数培养基上生长的菌落数。用对数 值表示其优势菌数量(LogN /g湿便)。需氧菌包括肠道杆菌、肠球菌和酵母菌； 肠道厌氧菌包括双岐杆菌、乳杆菌、类杆菌和总厌氧菌。 一、各细菌的培养基配方
1) 大肠埃希菌 用伊红一美兰培养基，市售成品商品。
2) 肠球菌培养基(即表1中的EC培养基)
在lOOmL中，胰胨2g，酵母粉0. 375g，葡萄糖0. 2g， Na2HP040. 4g， NaH2P040 . 4g， 琼脂0.4g,加水100mL，用1M NaOH调pH值至7. 4， 121。C高压15分钟，冷 却至55。C，加入叠氮钠40mg， 2,3，5 —氯化三苯基四氮唑10mg。
3) 酵母菌培养基
用酵母菌成品培养基，可以选用沙堡氏培养基。
4) 双歧杆菌选择性培养基(即表1中的TPY培养基)
在1000mL中，胰蛋白胨10 g，植质蛋白胨5 g，酵母粉2. 5 g，吐温-80 1 mL，葡萄糖5 g，盐酸半胱氨酸0. 5 g， K2HP04 2 g， MgCl. 7H20 0. 5 g， ZnS04. 7H200.25 g， CaCl2 0.15 g， FeCl3微量，琼脂12 g，加入1L ddH20，调pH至6. 5， 121。C高压15分钟。
5) 乳酸杆菌选择性培养基(即表1中的LBS培养基)
在1000mL中，MRS(BR0TH) 62g，盐酸半胱氨酸0.5 g，亮绿0. 1 g，上加 入IL ddH20,用2.5 MHCL调pH至5.0， 121。C高压15分钟，冷却至55。C， 万古霉素浓度至20 mg/L，混匀后倒平板。
6) 总厌氧菌非选择性培养基(即表1中的EG培养基)
在1000mL中，牛肉粉2. 4g，胰胨10g，酵母粉5g，胱氨酸0. 2g(先用0. 1MHCL 溶解)，Na2HP044g，葡萄糖L5g，盐酸半胱氨酸0.5 g，可溶性淀粉1. 5g，琼 脂12g，加入1000mL水，用NaOH调pH至7, 8， 121。C高压15分钟，冷却至 55°C，加入5 8%的羊血。
7) 类杆菌选择性培养基(即表1中的NBGT培养基) 在EG培养基的基础上(每100mL)，加入牛磺胺酸O. lg，新霉素20mg，亮
绿20mg， 10y。NaOH适量(在EC加血之前，先用灭菌水溶解牛磺胺酸、亮绿和新 霉素，此时液体为混浊，用NaOH调至澄清)，121。C高压15分钟，冷却至55 。C，加入5 8%的羊血。
8) 稀释液A
在誦mL中，加入KH2P044.5g， Na2HP046g，盐酸半胱氨酸0. 5 g，吐温-80 0.5 g，琼脂lg，加入1000mL水，将混合液煮沸，按每支试管9mL分装(每8 支试管中，有一支加入IO粒左右的琉璃珠)，在分装后，用氮气将试管的空气 部分替换，加上塞子，12rC高压15分钟。
二、各细菌的菌落形态及细菌镜下形态如下表l。
细菌名生长的涂布浓度菌落形态耐氧革兰染色及形态
称培养基(注3)试验
肠杆菌伊红_101、10_菌落边缘整齐，表ND(注1)G —呈直粗杆菌、短
科细菌美兰培3、 10- 5面有光泽、湿润、到中等长度、端呈
养基10-7光滑、呈灰色圆形
肠球菌EC培IO1、10_菌落呈圆形、NDG +呈球形，单个或
属细菌养基3、 10- 5隆起、中心显红色，排列成对，短链10-fi直径l 2mm
酵母菌沙堡氏10-110 —菌落呈奶油色、光NDG +着色不均，圆形
培养基3 i n10 -6-5滑，直径2 3mm或卵圆形
双歧杆TPY培丄U 10-110 —菌落呈圆形、光滑、p (注2)G'菌体着色不均
菌属细养基310_ 5不透明、直径在匀，形态具多形性，
菌100. 5 1. 5隱呈直、弯、分叉、
棒状或V、 Y字排
歹lj，无鞭毛、芽胞、
荚膜
乳酸杆LBS培10-110 —菌落呈圆形、凸起、PG +菌体呈杆状，无
菌属细养基310-5表面较为粗糙、不鞭毛、芽胞、荚膜
菌10-7透明、颜色较蓝，
直径在0. 5 1. 5mm
类杆菌NBGT10-110 —形成圆形、微凸、PG —菌体中等大小
属细菌培养基10-5、光滑、边缘整齐、0. 5 lum，染色不
10-8半透明、灰白色，均，两端较为浓染，
不溶血中部则较浅
总厌氧EG 培10- 110 —多种形态P多种形态
菌养基310-。、
10-8
注l:由于是需氧菌培养，所以无需做耐氧试验
注2: P表示耐氧试验阳性，即细菌未见有生长
注3:由于不同的标本中细菌的含量有很大的差别，因此要求每一种培养基中有 不同的且成系列的涂布浓度，以便计数得到更为可靠的数据。 三、具体实例
肠道细菌培养方法留取观察对象新鲜粪便标本2 5g，于0.5小时内送
检。称取0. 5克粪便样本放入加有玻璃珠的9mL稀释A液的试管中(记作10 —"， 在混匀器上混匀至少3分钟，用灭菌的移液管取lmL上已混匀液加到另一未加 玻璃珠的9mL稀释A液的试管中(记作10 —2)，在混匀器上混匀，用此法连续稀 释至浓度为IO 8。将各培养基平皿作四区标志，按上表中的涂布浓度，取各50yL的稀释后的混合液分别加到四区中，用涂布棒将混合液在各自的区内涂布 均匀。
把伊红一美蓝平皿、EC平皿和酵母菌平皿于恒温箱37。C孵育培养24小时 后观察结果。计数时，挑取典型细菌菌落，作下菌落形态的文字描述记录，同 时将细菌作革兰染色并镜检，观察和记录革兰染色结果，结合上两步骤，记录 各种培养基中细菌的数量，如在浓度为10 —7的区域内计数所得57个菌落即记作 57X107。
将TPY、 LBS、 NBGT和EG平皿放入厌氧盒内，于恒温箱37'C孵育培养72 小时后观察结果。计数时，挑取典型细菌菌落，作下菌落形态的文字描述记录， 同时将细菌作革兰染色并镜检，观察和记录革兰染色结果。同时对所选菌落作 耐氧试验(即将细菌用接种针挑取后划到血平皿上，于恒温箱37。C孵育培养24 小时后观察结果，如有菌生长则为耐氧试验阴性，反之则阳性)，结合上三步骤， 记录各种培养基中细菌的数量，如在浓度为10 —7的区域内计数所得57个菌落即 记作57X10:
菌数量(LogM/g湿便)，M二20XNX107m (CFU/g)
N为最小稀释浓度的菌落数
n为最小稀释浓度指数的绝对值
m为标本称重的质量
例如上在浓度为10 —7的区域内计数所得57个菌落即记作57X10 — 7，原标 本的称量为0. 5g， M=20X 57X1070. 5 (CFU/g) =22. 8X 109，那么该细菌在 标本中的菌数量(LogM/g湿便)为Log (22.8X 109) /g，即10. 358。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然， 本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从 本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范 围。
权利要求
1、一种肠道细菌培养方法，其特征在于取新鲜粪便放入加有玻璃珠的稀释液A的试管中，在混匀器上混匀3分钟以上，按连续稀释法，释成10-1～10-8个稀释度，将培养基平皿根据不同的涂布浓度分区，取各相同量的以上稀释后的混合液分别加到分区中，涂布均匀，平板于恒温箱37℃孵育培养。
2、 根据权利要求1所述的肠道细菌培养方法，其特征在于所述的细菌为肠 道需氧菌或肠道厌氧菌；肠道需氧菌为大肠埃希菌、肠球菌或酵母菌，肠道厌氧 菌为双岐杆菌、乳杆菌、类杆菌或总厌氧菌。
3、 根据权利要求1或2所述的肠道细菌培养方法，其特征在于所述的细菌 为肠道需氧菌，所用平板置于有氧条件下，于恒温箱37'C孵育培养22 24小时； 肠道厌氧菌所用平板放入厌氧盒或手套厌氧箱内，于恒温箱37"C孵育培养72小 时。
4、 根据权利要求1所述的肠道细菌培养方法，其特征在于留取观察对象新鲜粪便标本2 5g，于0. 5小时内送检，称取0. 5克粪便样本放入加有玻璃珠的 9mL稀释液A的试管中，在混匀器上混匀至少3分钟，按连续稀释法，释成10 —' 10 —8个稀释度，将培养基平皿根据不同的涂布浓度分区，取各50yL的以上稀释 后的混合液分别加到分区中，涂布均匀，平板于恒温箱37'C孵育培养。
5、 根据权利要求1或2所述的肠道细菌培养方法，其特征在于所述的细菌 为大肠埃希菌，所用培养基为伊红美兰培养基。
6、 一种权利要求1所述培养基的制备方法，其特征在于所述培养基为肠球 菌培养基，取胰胨2g，酵母粉0.375g，葡萄糖0.2g， Na2HP040.4g， NaH2P040.4g， 琼脂O. 4g，加水100mL，用1M NaOH调pH值至7. 4， 121。C高压15分钟，冷却至 55°C，加入叠氮钠40mg， 2，3，5 —氯化三苯基四氮唑10mg。
7、 一种权利要求1所述的培养基的制备方法，其特征在于所述培养基为双 歧杆菌选择性培养基，取胰蛋白胨10 g，植质蛋白胨5 g,酵母粉2.5 g，吐温 -80 1 mL，葡萄糖5 g，盐酸半胱氨酸 . 5 g， K2HP04 2 g， MgCl. 7H20 0. 5 g， ZnS04. 7H20 0.25 g， CaCl2 0.15 g， FeCl3微量，琼脂12 g，加入1L ddH20，调pH至6. 5， 121。C高压15分钟。
8、 一种权利要求1所述的培养基的制备方法，其特征在于所述培养基为乳 酸杆菌选择性培养基，取MRS 62g，盐酸半胱氨酸0. 5 g，亮绿0. 1 g，加入1L ddH20，用2. 5 M HCL调pH至5. 0, 121。C高压15分钟，冷却至55'C，万古霉素浓度至 20 mg/L，混匀后倒平板。
9、 一种权利要求1所述的培养基的制备方法，其特征在于所述培养基类杆 菌选择性培养基，在100mL EG培养基中，加入已用灭菌水溶解的牛磺胺酸O. lg、 新霉素20mg、亮绿20mg，再用10%NaOH调至澄清，121。C高压15分钟，冷却至 55°C，加入5 8。/。的羊血。
10、 一种权利要求1所述的培养基的制备方法，其特征在于所述培养基为 总厌氧菌选择性培养基，牛肉粉2.4g，胰胨10g，酵母粉5g，已用0. 1M HCL溶 解过的胱氨酸0.2g， Na2HP044g，葡萄糖1. 5g，盐酸半胱氨酸0. 5 g，可溶性淀粉 L5g，琼脂12g，加入1000mL水，用NaOH调pH至7. 8， 121。C高压15分钟，冷 却至55。C，加入5 8%的羊血。
全文摘要
本发明公开了一种肠道细菌培养方法，取新鲜粪便放入加有玻璃珠的稀释液A的试管中，在混匀器上混匀3分钟以上，按连续稀释法，释成10^-1～10^-8个稀释度，将培养基平皿根据不同的涂布浓度分区，取各相同量的以上稀释后的混合液分别加到分区中，涂布均匀，平板于恒温箱37℃孵育培养。本发明的有益之处在于本发明的方法较为直观地反映标本中细菌的种类和数量，且对培养的细菌可以作进一步的研究和分析，生化特性、代谢特性、遗传特性等。
文档编号C12Q1/10GK101440395SQ20081016305
公开日2009年5月27日 申请日期2008年12月15日 优先权日2008年12月15日
发明者吴仲文, 健 左, 徐凯进, 李兰娟, 王建国, 肖党生, 瑜 陈, 陈云波, 陈春雷 申请人:浙江大学