专利名称：含89k毒力岛猪链球菌2型核酸的荧光检测试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种含89K毒力岛基因猪链球菌2型核酸的 Taqman-MGB双重荧光探针PCR检测试剂盒及纟企测方法。
(二)
背景技术：
猪链球菌是一种重要的人畜共患病原菌，自1968年国际上首次报道 至2007年止，全世界范围内已超过409例人感染猪链球菌2型(SS2 ) 导致病例发生。早在1990年^火 1991年春，我国长江三角洲某些地区就 已发生因链球菌引起的疾病，症状表现为链球菌中毒性休克综合症 (STSS)， 1998-2005年江苏和四川SS2疫情大暴发，死亡多例，患者大多 表现为STSS,但对何种致病因子引起该病及其致病机理尚未查明。2007 年文献报道，对来自中毒性休克综合症临床病人的1998年江苏分离株和 2005年四川分离抹分别作了全序列基因测定，.发现这两个中国强毒林比 欧洲抹多出一段89K序列片段。阐明该致病因子可能是三次流行的SS2 的一种重要致病因子，可能是引起我国STSS病的关键致病岛，可作为判 定菌抹毒力强弱的指标。2008年报道了没有89K毒力岛基因的SS2毒林 其毒力下降，致病性与一般SS2林相同；其动物试验表明含89K毒力 岛的SS2感染动物后，两天内动物死亡；当敲除了 89K毒力岛中的两组 分细胞信号转导基因SalK/SalR的SS2感染动物时，动物存活14天以上。 可见89K毒力岛为SS2强毒力抹所必有的。
目前针对SS2核酸建立快诊方法的有普通PCR、多重PCR及荧光定 量PCR等方法，但未见有同步检测猪链球菌和89K毒力岛基因的检测方法。为了更好的研究携带89K致病岛基因SS2菌抹感染的流行病学特征， 早期发现病人，及时救治，和有效控制这种病原菌的传播与流行，有必要 建立一个快速、敏感且特异的检测方法。为此，针对SS种特异性16S rRNA 基因以及89K毒力岛基因序列合成TaqMan-MGB引物与探针研制了该方 法。
近几年发展起来的荧光定量PCR技术，它利用了 PCR对脱氧核糖核 酸(DNA)的高效扩增，探针技术的高特异性和光谱技术的敏感性以及 定量特点，不仅克服了常规PCR定性检测的不足，而且具有直观、重复 性好、特异性强、敏感性高和易操作等优点。
荧光定量PCR技术原理荧光定量PCR是利用荧光染料在激发光的 作用下所释放的荧光光能的变化来动态直接反映出PCR扩增产物量的变 化。因荧光信号变量与扩增产物量成正比，通过足够灵^:的自动化荧光定 量PCR仪就可以通过对焚光信号的采集与分析来实现对初始模板的定 量。 —
常用的荧光标记方法可简单分为两大类1、非特异检测一双链DNA 内插式荧光染料；2、扩增序列专一检测一主要指荧光探针和引物探针， 荧光标记的探针共有三类(1)分子信标探针；(2)杂交双探针；(3) Taqman双标记探针。广泛使用的TaqMan 4笨针法是指PCR扩增时在加入 一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性 地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5'端标记有荧光报告基团 (Reporter,R),如FAM、 HEX等，3'端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q )， 如TAMRA、 MGB等。当探针完整的时候，5'端报告基团经仪器光源激 发的荧光正好被近距离的3'端荧光基团淬灭，仪器检测不到5'端报告基团 所激发的荧光信号(就是说5'端荧光基团的发射波长正好是3'端荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3'端荧光基团而发出其它焚光)。随
着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5'—3' 外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将 切割探针，释放5'端报告基团游离于反应液中，远离3'端荧光淬灭基团的 屏蔽，5'端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就 是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累 积与PCR产物形成完全同步。从仪器检测出荧光值出峰的最低循环数
(cycle threshold, Ct)与检测病原核酸量对数值呈线性负相关。根据荧 光定量PCR反应中的Ct值就能算出原始的模板量。
TaqMan- MGB探针则是近几年才出现的新型探针，与一般Real-time PCR及TaqMan探针相比，其荧光本底低，分辨率更高，杂交稳定性及特 异性更强，敏感度更高，结果更精确，可以将探针的Tm值提高10。C左 右等优点。
发明内容
本发明是根据上述原理，设计适合含89K毒力岛猪链球菌2型的特 异性引物和特异性探针，提供一种Taqman-MGB双重荧光4果针PClU企测 含89K毒力岛猪链球菌2 型的基因快速检测试剂盒及检测方法。
本发明采用的技术方案是
一种含89K毒力岛基因猪链球菌2型核酸的Taqman-MGB双重荧光 探针PCR检测试剂盒，主要包括特异性扩增引物及特异性探针、PCR緩 冲液、脱氧三磷酸核苦混合物(dNTP)和DNA聚合酶，
所述特异性扩增引物及特异性探针为
16S rRNA上游引物序列为5，- AGCGCAGGCGGTTTGA-3，；
16 S rRNA下游引物序列为
5 ，- ACAGTTTCCAAAGCGTACTATGGTTA -3';
16S rRNA特异性探针序列为
5，- FAM-AGTCTGAAGTAAAAGGC -MGB-3，；
89K上游引物序列为
5,-ATAAAAATACCGCTGTTGGATGGA画3，；
89K下游引物序列为
5，- CGTCTACACCGAATTGTTTTGCA誦3';
89K特异性探针序列为
5,- HEX-CATGGGAGATATAAAGAAC陽MGB陽3，； 其中FAM、 HEX为报告荧光基团，MGB为修饰基团。 如果需要达到定量检测的效果，所述试剂盒还可包括猪链球菌种特异 性16S rRNA和89K毒力岛部分基因克隆质粒标准，所述猪链球菌种特异性 16S rRNA部分基因才示准序歹寸为5，- agcgcaggc ggtttgataagtctgaagtaaaagg ctgtgg cttaaccatagta cgctttggaaactgt -3 ，；所述89K毒力岛部分基因标准序歹'J 为5，- ataa aaataccgctgtt ggatggagcatgggagatataaagaacgttgcaaaacaattcggtgt agacg -3，。以梯度浓度的标准品进行荧光4企测，Cycler threshold value ( Ct 值)与样品中核酸模板量对数值呈线性负相关，可以通过绘制标准曲线计 算出待测样品中SS2核酸含量。克隆质粒标准品以猪链球菌种特异性16S rRNA和含89K毒力岛基因猪链球菌种DNA为模板，分别扩增16SrDNA 、 89K毒力岛基因目的片段，将扩增产物克隆至pMD18-T载体上，转化至 DH5a大肠杆菌中，挑取阳性克隆增殖后提取质粒DNA进行序列测定以鉴定插入序列，并测定质粒DNA浓度进行拷贝数的换算。
本发明关键在于特异性引物和荧光探针的设计，以及克隆质粒标准序 列的设计，试剂盒中的其他组分，比如DNA聚合酶、PCR緩冲液、脱氧 三磷酸核苷混合物等，均可参照本领域常规试剂盒组成。通常的，PCR 反应液通常按如下组成配制(终浓度)1 x PCR buffer、 0.3~0.5 n M的引 物、0.1 0.3 juM的荧光探针、1 5U的DNA聚合酶、0.2 0.4mM的dNTPs, 通常取2 ia L的模板，反应总体积通常为20 50 ji L。
本发明中，所述DNA聚合酶等基础试剂为premix EX Taq DNA聚合酶 试剂，是采用探针法进行Real Time PCR的广谱试剂。试剂中已经将DNA 聚合酶、反应用Buffer、 dNTP等试剂预混在一起，是一种2x浓度的试剂， 进行实验时，PCR^应液的配制十分方便简单。试剂中的DNA聚合酶使 用了改良后的HotStart法。该试剂盒中还附带有ROX Reference Dye,可用 于需要Dye的Real Time PCR扩增仪。ROX Reference Dye II浓度为50x,添 加量为0.5pL ( PCR^应液总体积25 ju L )。
所述脱氧三磷酸核苦混合物为dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP物质的量
比l: 1: 1: l的混合物。
所述空白对照用配置反应体系的DEPC水代替模板。
本发明还涉及一种含89K毒力岛基因猪链球菌2型核酸的Taqman -MGB双重荧光探针PCR检测方法，所述方法包括
(1) 提取待测样品DNA;
(2) 取特异性扩增引物及特异性探针、PCR緩冲液、脱氧三磷酸核苷 混合物和DNA聚合酶，分别加入空白对照或待测样品DNA配成 PCFL良应液，进行PCR扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；所述特异性扩增引物及特异性探针为
16S rRNA上游引物序列为
5,- AGCGCAGGCGGTTTGA陽3 ，；
16SrRNA下游引物序列为
5'画ACAGTTTCCAAAGCGTACTATGGTTA -3，；
16S rRNA特异性探针序列为
5，- FAM画AGTCTGAAGTAAAAGGC -MGB-3，；
89K上游引物序列为
5 ，-ATAAAAATACCGCTGTTGGATGGA -3';
89K下游引物序列为
5，- CGTCTACACCGAATTGTTTTGCA-3，；
89K特异性探针序列为
5，- HEX-CATGGGAGATATAAAGAAC -MGB -3，；
其中FAM、 HEX为报告荧光基团，MGB为修饰基团； (3)选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3 15个循环的荧光信
号为阔值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好
的对数增长，则判断为阳性。 为达到定量检测的效果，可同时以猪链球菌种特异性16S rRNA和89K 毒力岛部分基因克隆质粒作为标准在与样品DNA相同条件下进行PCR扩 增反应，以克隆质粒拷贝浓度的对数值为横坐标、标准品Ct值为纵坐标分 别绘制标准曲线；根据样品DNA测得的Ct值，对照相应标准曲线，获得 样品DNA的拷贝浓度；所述猪链球菌种特异性16S rRNA部分基因标准序 歹ll为5，- agcgcaggc ggtttgataagtctgaagtaaaaggctgtgg cttaaccatagta cgctt tggaaactgt -3，；所述89K毒力岛部分基因标准序列为5，- ataa aaataccgctgttg gatggagcatggga gatata aagaacgttgcaaaacaattcggtgt agacg -3'。
所述PCR^良应液涉及可按照常规进行。具体的，所述PCR^应液主要 成分如下
PCR緩冲液终浓度为lxDNA聚合酶0.5-5酶活力单位/反应dNTP终浓度为0》-0.4mM
16SrDNA上游引物终站L度为0.1'
16SrDNA下游引物终沐L度为0丄 0.3jiM
16SrDNA探针终沐L度为0丄、0.3 jaM
89K上游引物终浓渡为0.3'
89K下游引物终浓度为0.3'
89K探针终沐渡为0.4'-0.6(iM
待分析样本DNA终浓.度为10 105ng/jiL
溶剂为DEPC水。
所述PCR扩增反应条件如下:95。C变性10s,l个循环；
60。C退火20s扩增，45个循环。 优选的，所述方法如下
(1) 取待测病人的呼吸道咽拭子、血液或体液，提取待测样品DNA;
(2) 取所述的特异性扩增引物及特异性探针、PCR緩冲液、脱氧三磷酸 核苦混合物和DNA聚合酶，分别加入空白对照或待测样品DNA配成 PCR反应液，进行PCR扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪于60。C 进行下进行双点焚光检测；所述PCR^应液组成如下
premix EX Taq i式剂
终浓度为lx
16SrDNA上游引物
终浓度为0.2(iM
16SrDNA下游引物
终浓度为0.2pM
16SrDNA探针
终浓度为0.2pM
89K上游引物
终浓度为0.4pM
89K下游引物
终浓度为0.4pM
89K探针
终浓度为0.48^M
待分析样本DNA
终浓度为10 102ng/jaL
溶剂为DEPC水；
对于部分需要Dye的Real Time PCR扩增仪。上述PCR^应液中 还需要添加ROX Reference Dye II ，添加量为0.5jiL/25 |i L反应液总体积。
所述PCR扩增反应条件如下95。C变性10s, l个循环；95。C变性 5s, 60。C退火20s扩增，45个循环； (3)选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3 15个循环的荧光信号， 以样品DNA的两项Ct值均< 37并且扩增曲线呈S型为阳性判定原 则其中两项Ct值均〈35且扩增曲线良好可直接判定为阳性，任意 一项Ct值在35 ~ 37之间则重复进行PCR扩增和焚光检测，两次4企测
均能得到良好S型扩增曲线则判定为阳性。 本发明有益效果主要体现在 1、早期诊断PCR可直接检测病原体核酸，在SS2发病早期症状不典型 时期，就可以检测出是否含有含89K毒力岛猪链球菌2型特异性基因，为及早隔离、确诊和治疗提供方便；
2、 取样简单方便可取潜伏期或发病早期含89K毒力岛猪链球菌2型患 者呼吸道咽拭子、血液、体液等标本进行4企测；
3、 与传统的基因扩增技术相比，本发明提供的检测方法省时省力，可在 2小时左右完成4全测；
4、 灵敏度高特异性强，由于采用了两套特异性基因扩增和特异性基因探 针杂交结合的四重技术，诊断的灵敏度更高，特异性更强；
5、 采用计算机实时监测技术，在实验进程中即可判断是否含有病原基 因，且实验结果的判断方便准确；
6、 可实现病原核酸的定量分析，利用已知拷贝数、含有89K毒力岛猪链 球菌2型基因重组质粒为标准品制作标准曲线，可对原始标本中的病 原含量进行定量分析。
(四)
图1为含89K毒力岛猪链球菌2型TaqMan-MGB双重荧光定量PCR方 法标准品扩增曲线；
图2为含89K毒力岛猪链球菌2型TaqMan-MGB双重荧光定量PCR方 法标准曲线；
图3为TaqMan-MGB双重荧光定量PCR对人感染含89K毒力岛猪链球 菌2型临床标本的检测。
(五)
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围 并不仅限于此
实施例1:利用本发明所述的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法对浙江省1份疑 似SS2病人应急样本进行检测，结果阳性，见图3。 (1 )标准曲线测定
① 标准溶液获得
以猪链球菌种特异性16S rRNA和含89K毒力岛基因猪链球菌种 DNA为模板，分别扩增16SrDNA、 89K毒力岛基因目的片段，将扩增 产物克隆至pMD18-T载体(Takara公司)上，转化至DH5a大肠杆菌中， 挑取阳性克隆增殖后提取质粒DNA进行序列测定以鉴定插入序列，并测 定质粒DNA浓度进行拷贝数的换算。
取前述克隆质粒标准品101Q copies/ml,按10倍稀释制作109 101 copies/ml梯度溶液。
② 标准曲线的绘制
PCR反应液终浓度组成如下
premix EX Taq ;式剂(2x ) ( Takara 7>司) 12.5|il,
16S rDNA上游引物 0.2^M,
16S rDNA下游引物 0.2jiM，
16SrDNA探针 0.2|iM,
89K上游引物 0.4pM，
89K下游引物 0.4pM，
89K探针 0.48(_iM,
ROX Reference Dye II 0.5^iL 克隆质粒标准梯度溶液 4pL DEPC水补足至25iiL;
16反应条件为95。C变性10s, 1个循环；95。C变性5s， 60。C退火20s 扩增，45个循环。在6(TC进行双点荧光^r测。
标准品的扩增曲线见图1 (图中从左至右，扩增的基因拷贝数依次10 倍稀释)，实心圆标示的"S"型曲线是两个特征基因重组质粒107拷贝/ 反应时的检测结果；实心正方形、实心三角形、实心菱形和星形的"S，， 型曲线的重组质粒浓度分别是106、 105、 104和103拷贝/反应。根据标准 品Ct值，以克隆质粒拷贝浓度的对数为X轴，CT值为Y轴，制得标准 曲线见图2。 (2)样本检测
(1 )提取样品病毒RNA;取浙江省2008年疑似SS2感染患者的血 液应急样本用DNA提取试剂盒[Takara宝生物(大连)工程有 限7>司],^是耳又DNA;
(2)荧光PCR扩增4企测 PCR反应液终浓度组成 -
premix EX Taq酶(2x ) 12.5|il，
16SrDNA上游引物 0.2^M，
16S rDNA下游引物 0.2pM,
16SrDNA探针 0.2pM,
89K上游引物 0.4|iM,
89K下游引物 0.4pM,
89K探针 0.48(iM,
ROX Reference Dye II 0.5 |iL
血液应急样本提取DNA (约1 OOng/ |i L ) 4pLDEPC水补足至25pL;
反应条件为95。C变性10s, 1个循环；95。C5s, 60。C退火20s扩增， 45个循环。在6(TC进行双点荧光检测。
(3)实时荧光PCR过程中，Cycler threshold value (Ct值)与样品中 核酸才莫板量对数值呈线性负相关，可以通过标准曲线(图2)计 算出样品中SS2核S吏含量。样品扩增曲线见图3,荧光增长曲线 超过阈值线，并呈良好的S型增长，判断为阳性，左边的(Ct 值约26)"S，，型曲线是病人血液应急样本的SS2菌16SrRNA基 因测定阳性结果；右边的(Ct值约30) "S"型曲线为是病人血 液应急样本的89k毒力岛基因测定阳性结果。序列表—ST25. txt
SEQUENCE LISTING 〈110>浙江省疾病预防控制中心
<120〉含89K毒力岛猪链球菌2型核酸的荧光检测试剂盒及方法
<130>
<160> 8
<170> Patentln version 3.4
<210> 1
<211> 16
<212> 醒
<213> Unknown
<220>
<223〉人工序列 <400〉 1
agcgcaggcg gtttga 16
〈210〉2
〈211〉26
〈212〉腿
<213>UnknoTO
<220>
〈223〉人工序列
<400〉2
acagtttcca aagcgtacta tggtta 26
<210〉 3
<211> 17
<212〉 DNA
<213> Unknown
<220〉
<223>人工序列
<■〉 3
agtctgaagt aaaaggc 17
<210>4
<211>24
<212〉DNA
<213>Unknown
<220>
<223〉人工序列
<400〉4
ataaaaatac cgctgttgga tgga 24
<210>5
<211>23
<212>腿
〈213〉Unknown
<220>
<223〉人工序列
<400>5
cgtctacacc gaattgtttt gca 23
<210> 6 〈211> 19 <212> DNA序列表—ST25. txt
<213> Unknown <220>
<223> 人工序列 <400〉 6
C3tgggagat ataaagaac 19
<210〉 7 <211〉 68 <212> 腿
<213> Streptococcus suis <400> 7
agcgcaggcg gtttgataag tctgaagtaa aaggctgtgg cttaaccata gtacgctttg 60 gaaactgt 68
<210> 8 <211> 69 <212〉 DNA
<213〉 Streptococcus suis <400〉 8
ataaaaatac cgctgttgga tggagcatgg gagatataaa gaacgttgca aaacaattcg 60 gtgtagacg 69
权利要求
1. 一种含89K毒力岛基因猪链球菌2型核酸的Taqman-MGB双重荧光探针PCR检测试剂盒，主要包括猪链球菌种特异性扩增引物及特异性探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性扩增引物及特异性探针为16S rRNA上游引物序列为5’-AGCGCAGGCGGTTTGA-3’；16SrRNA下游引物序列为5’-ACAGTTTCCAAAGCGTACTATGGTTA-3’；16S rRNA特异性探针序列为5’-FAM-AGTCTGAAGTAAAAGGC-MGB-3’；89K上游引物序列为5’-ATAAAAATACCGCTGTTGGATGGA-3’；89K下游引物序列为5’-CGTCTACACCGAATTGTTTTGCA-3’；89K特异性探针序列为5’-HEX-CATGGGAGATATAAAGAAC-MGB-3’；其中FAM、HEX为报告荧光基团，MGB为修饰基团。
2. 如权利要求l所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括猪链球菌种 特异性16S rRNA和89K毒力岛基因片段标准品，所述猪链球菌种特异性 16S rRNA基因片賴:标准品序列为5 ，- agcgcaggc ggtttgataagtctg aagt aaaaggctgtgg cttaaccatagtacgctttggaaactgt画3，；所述89K毒力岛片l爻才示准品 序歹'J为5，國ataa aaataccgctgttggatggagcatgggagatataaagaacgttgcaaaaca att cggtgtagacg -3，。
3. 如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述脱氧三磷酸核苷混合 物为dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP物质的量比l: 1: 1: l的混合物。
4. 一种含89K毒力岛基因猪链球菌2型核酸的Taqman-MGB双重荧光探针 PCR4佥测方法，所述方法包括(1) ^是耳又4寺测才羊品DNA;(2) 取特异性扩增引物及特异性4笨针、PCR緩冲液、脱氧三磷酸核苷 混合物和DNA聚合酶，分别加入空白对照或待测样品DNA配成 PCRA应液，进行PCR扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进 行荧光检测； '所述特异性扩增引物及特异性探针为16S rRNA上游引物序列为5 ，- AGCGCAGGCGGTTTGA-3 ，；16 S rRN A下游引物序列为5 ，- ACAGTTTCCAAAGCGTACTATGGTTA -3';16S rRNA特异性探针序列为5，- FAM-AGTCTGAAGTAAAAGGC画MGB醫3，；89K上游引物序列为5 ,画ATAAAAATACCGCTGTTGGATGGA國3 ，；89K下游引物序列为5，- CGTCTACACCGAATTGTTTTGCA -3，；89K特异性探针序列为5，- HEX画CATGGGAGATATAAAGAAC画MGB -3，； 其中FAM、 HEX为报告焚光基团，MGB为修饰基团； (3)选择荧光检测模式FAM和HEX荧光，基线调整取3~ 15个循环的 荧光信号为阈值线；若待测样品的两条荧光增长曲线均超过阈值 线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法同时以猪链球菌种特异 性16S rRNA和89K毒力岛基因片段标准品在与样品DNA相同条件下进 行PCR扩增反应，以标准品扩增产物拷贝浓度的对数值为横坐标、标准 品Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品DNA测得的Ct值，对照相应 标准曲线，获得样品DNA扩增产物的拷贝浓度；所述猪链球菌种特异 性16S rRNA基因才示准品序列为5，- agcgcaggc ggtttgat aagtctgaagtaaaag gctgtgg cttaaccatagtacgctttggaaactgt -3 ，；戶斤述89K毒力岛才示准品序歹l]为 5， - ataa aaataccgctgttggatggagcatgggagatat aaag aacgttg caa aacaattcggtgt agacg画3'。
6. 如权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述PCR良应液主要成分如PCR緩冲液终浓度为DNA聚合酶0.5~5酶活力单位/反应16SrDNA上游引物终浓度为0.1 0.3jiM16SrDNA下游引物终浓度为0.1 0.3|iM16SrDNA探针终浓度为0.1~0.3(iM89K上游引物终浓度为Q.3 0.5(iM89K下游引物终浓度为0.3 0.5pM89K探针 终浓度为0.4 0.6pM脱氧三磷酸核苷混合物 终浓度为0.2 0.4mM待分析样本DNA 终浓度为10~105ng/|aL溶剂为DEPC水。
7. 如权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述PCR扩增反应条件如下 95。C变性10s， l个循环；95。C变性5s, 60。C退火20s扩增，45个循环。
8. 如权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法如下(1) 取待测病人的呼吸道咽拭子、血液或体液，提取待测样品DNA;(2) 取所述的特异性扩增引物及特异性探针、PCR緩冲液、脱氧三磷 酸核苦混合物和DNA聚合酶，分别加入空白对照或4寺测样品DNA 配成PCR^应液，进行PCR扩增反应，反应管置于定量荧光PCR 仪于60'C进行下进行双点荧光4企测；所述PCR^应液组成如下premix EX Taq i式剂16SrDNA上游引物16SrDNA下游引物16SrDNA探针89K上游引物89K下游引物89K探针待分析样本DNA溶剂为DEPC水；所述PCR扩增反应条件如下:终浓度为lx 终浓度为0.2(oM 终浓度为0.2|iM 终浓度为0.2pM 终浓度为0.4|iM 终浓度为0.4jiM 终浓度为0.48&M 终浓度为10 102ng/jaL95T变性10s, l个循环；95。C变性5s， 60。C退火20s扩增，45个循环； (3)选择荧光检测模式FAM和HEX荧光，基线调整取3 15个循环的 荧光信号，以样品DNA的两项Ct值均〈37并且扩增曲线呈S型为 阳性判定原则其中两项Ct值均<35且扩增曲线良好可直接判定 为阳性，任意一项Ct值在35 ~ 37之间则重复进行PCR扩增和荧光 检测，两次检测均能得到良好S型扩增曲线则判定为阳性。
全文摘要
本发明提供了一种Taqman-MGB双重荧光探针PCR检测含89K毒力岛猪链球菌2型的基因快速检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒的特异性扩增引物及特异性探针为16S上游引物5’-AGCGCAGGCGGTTTGA-3’；16S下游引物5’-ACAGTTTCCAAAGCGTACTATGGTTA-3’；16S特异性探针5’-FAM-AGTCTGAAGTAAAAGGC-MGB-3’；89K上游引物5’-ATAAAAATACCGCTGTTGGATGGA-3’；89K下游引物5’-CGTCTACACCGAATT GTTTTGCA-3’；89K特异性探针5’-HEX-CATGGGAGATATAAAG A AC-MGB-3’；其中FAM、HEX为报告荧光基团，MGB为修饰基团。本发明方法取样方便简单，检测速度快，灵敏度高、结果准确，可用于SS2发病早期诊断。
文档编号C12Q1/14GK101440400SQ20081016303
公开日2009年5月27日 申请日期2008年12月4日 优先权日2008年12月4日
发明者朱水荣, 王志刚 申请人:浙江省疾病预防控制中心