猪链球菌血清3型aroC基因功能缺陷的突变链球菌菌株SS3ST3 ΔaroC及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明涉及一种猪链球菌血清3型aroC基因功能缺陷的突变链球菌菌株SS3ST3ΔaroC及其制备方法和应用。有助于控制病原体感染。本发明是使用基因工程技术构建了一种芳香簇氨基酸合成缺失突变菌株SS3ST3ΔaroC，该突变株由于aroC基因的功能缺失而不能正常合成芳香簇氨基酸。SS3ST3ΔaroC突变菌作为一种活疫苗，在小鼠体内表现为弱毒性，并有100％的免疫保护能力。本发明的弱毒疫苗，用于预防猪链球菌血清3型感染，安全性强、保护效果好、易大规模生产、具备推广使用的潜力。
【专利说明】
猪链球菌血清3型aroC基因功能缺陷的突变链球菌菌株 SS3ST3 Aar〇C及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及链球菌菌株，具体地指一种猪链球菌血清3型aroC基因功能缺陷的突 变链球菌菌株SS3ST3 △ aroC及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 猪链球菌（Streptococcus suis，SS)导致猪一系列的症状，包括脑膜炎，败血症， 多浆膜炎，关节炎，心内膜炎和肺炎。到目前为止，猪链球菌分为33个血清型，不同血清型以 及同型的不同菌株的致病力都有差异。我国猪群中最流行是血清2型猪链球菌，其次就是血 清3型猪链球菌。由于对SS3毒力因素和保护性抗原一直缺乏全面了解，从而很难有效控制 SS3的感染。因此，预防这种病菌的传播依赖于严格的控制措施。鉴于这种微生物对整个世 界养猪行业的威胁，研制有效疫苗预防SS3感染是非常必要的。然而，关于这种病原的毒性 因子研究太少，从而阻碍弱毒疫苗的研发。
【发明内容】
[0003] 本发明目的是为了有效控制SS3的感染，提供了一种猪链球菌血清3型aroC基因功 能缺陷的突变链球菌菌株SS3ST3 △ aroC及其制备方法和应用。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明提供的一种猪链球菌血清3型aroC基因功能缺陷的 突变链球菌菌株SS3ST3 AaroC，其特征在于:其命名为SS3ST3 AaroC，其SS3ST3 AaroC 为所述链球菌菌株SS3ST3缺少Δ ar〇C基因。
[0005] 本发明提供了一种猪链球菌血清3型aroC基因功能缺陷的突变链球菌菌株 SS3ST3 Aar〇C制备方法，包括以下步骤：
[0006] 1)以SS3ST3基因组DNA为模板，使用Primer Premier5.0设计扩增目的片段aroC基 因的引物对，
[0007] aroCLL:5 '-AAAGAAGCTTCAACGCTTTATCAG-3 '，
[0008] aroCLR:5 '-TTCAGTCGACATACGACTACCACGAC-3 '；
[0009] aroCRL:5 '-GGAGGGATCCAGACTGTTGTTGGAGGAG-3 '，
[0010] aroCRR:5 '-TCGCGAATTCTGGCTACCGCAGCTTTC-3 '；
[0011] 2)PCR扩增目的基因
[0012] a.aroCL基因片段扩增体系：
[0014] aroCL基因片段PCR的条件为：95°C 5min，一次；94°C lmin、55°C 45s、72°C 45s、 30cycle；72〇C 5min,一次；[0015] aroCR基因片段的扩增体系：
[0018] aroCR基因片段条件：95°C 5min，一次；94Γ 1π?η、55Γ458、72Γ 45s、30cycle; 72°C 5min，一次；
[0019] 3)SS3ST3 AaroC的构建
[0020] 以SS3ST3基因组作为模板，aroCLL、aroCLR和aroCRL、aroCRR作为引物扩增DNA片 段，PCR产物使用适当的限制性酶消化，目的片段与pG+h〇st5连接，从而获得重组质粒pGA aroGpG Δ ar〇C经过电转化进入SS3ST3，28°C红霉素平板上筛选阳性克隆；
[0021] 4)阳性克隆的保存
[0022]阳性克隆转接TSB后生长到对数中期时用不含有红霉素的TSB稀释后在28°C生长 到对数初期，把培养瓶转移至37 °C孵育4h;随后，把细菌均匀涂布在TSA平板上37 °C生长，挑 选红霉素敏感克隆用PCR鉴定；鉴定正确的重组克隆于TSB中37°C摇床培养，得到菌液，置 于-80°C冰箱保存。
[0023] 突变链球菌菌株SS3ST3 Aar〇C在制备猪链球菌血清3型弱毒疫苗中的应用。
[0024] 本发明一种突变链球菌菌株SS3ST3 Aar〇C制备猪链球菌血清3型弱毒疫苗的方 法，包括以下步骤：
[0025] 1)把成功的菌种SS3ST3 Aar〇C复苏于5mlTSB中，37°C摇床培养过夜；
[0026] 2)取摇床过夜的菌种2ml于350ml TSB的培养瓶内，37°C摇床培养6-8h;
[0027] 3)把培养瓶中的菌液8000rpm，离心3min，去上清；
[0028] 4)收获的细菌与灭菌的20%脱脂乳混合，使用冷冻真空干燥器制作成细菌冻干活 疫苗，-20 °C低温冰箱保存。
[0029] 本发明的原理
[0030]关于细菌合成芳香族氨基酸需要经历的共同途径如下所示，通过这条途径合成 分支酸。然后又分支酸合成苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。缺失aroC基因后，芳香簇氨基酸合 成途径中断图6所示。
[0031] 在哺乳动物中，叶酸的前体，p-氨基苯甲酸(PABA)不能被动物自身合成。同样，细 菌芳香族氨基酸代谢途径阻断后不能合成PABA，而细菌不能摄取外源叶酸盐，而动物体内 PABA的量是有限的，因此在宿主体内，芳香族氨基酸营养缺陷型的生成受到限制从而表现 出低毒力。
[0032] 通过对猪链球菌SS3ST3的aroC基因经过等位基因置换而使该基因失活，使该菌株 毒力减弱，从而研发相关的弱毒疫苗。
[0033]本发明的有益效果在于：
[0034] 1)本发明的疫苗制作工艺简单，疫苗菌株可大量培养，成本低，周期短，能在全世 界推广使用；
[0035] 2)本发明的疫苗既表现细胞免疫又有体液免疫；
[0036] 3)本发明的疫苗用量小，安全性高，毒力小，使用方便。
[0037]综上所述，本发明采用基因工程技术构建猪链球菌菌株SS3ST3 Aar〇C，此缺陷株 毒力减弱。实验已证明该突变株对小鼠是无毒性的，用其免疫小鼠，小鼠100%得到保护。
[0038] 图1为突变菌SS3ST3 AaroC的构建。用PCR方法鉴定突变菌SS3ST3 AaroC的构 建；
【附图说明】
[0039] 图中，LaneM: DNA marker
[0040] Lane l:SS3TZ-5用aroCLL和aroCRR扩增片段
[0041 ] Lane 2: SS3TZ-5 Δ aroC用aroCLL和aroCRR扩增的片段
[0042] Lane 3:SS3TZ_5用 Aarol和 Aaro2扩增的片段
[0043] Lane 4:SS3TZ-5AaroC用 Aarol和 Aaro2扩增的片段
[0044] 图2为BALB/c小鼠经过腹腔注射野生菌和突变菌SS3ST3 Aar〇C之后的生存曲线 图；图中，4-6周龄小鼠腹腔接种细菌10 X 108CFU，持续观察12天，数据用每组小鼠的存活率 来表示。
[0045] 图3表示使用SS3ST3 Δ ar〇C突变菌、灭活的野生菌疫苗（阳性对照）、佐剂（阴性对 照）、PBS(空白对照)分别免疫小鼠，然后使用野生菌对四组小鼠分别进行攻毒，攻毒的小鼠 持续观察12天，数据用每组存活小鼠的百分比来表示。
[0046] 图4是小鼠脾脏细胞中IFN-γ和IL-4的mRNA水平:使用突变菌SS3ST3 Aar〇C免疫 小鼠后，然后通过定量PCR的方法检测免疫小鼠脾脏细胞IFN- γ和IL-4的mRNA水平；
[0047]图5为定量PCR分析结果显示免疫后96小时后的小鼠脾脏细胞中的IL-4和IFN- γ mRNA水平显著增加图； 图6为芳香簇氨基酸合成途径图。
[0048]为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但 本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
[0049] 实施例1:突变菌株SS3ST3 Aar〇C的构建
[0050]( -）引物的设计合成
[0051 ] 以SS3ST3基因组DNA为模板，使用Primer Premier5.0设计扩增目的片段aroC基因 的引物，引物由上海生工合成。
[0052] aroCLL：AAAGAAGCTTCAACGCTTTATCAG
[0053] aroCLR：TTCAGTCGACATACGACTACCACGAC
[0054] aroCRL：GGAGGGATCCAGACTGTTGTTGGAGGAG
[0055] aroCRR：TCGCGAATTCTGGCTACCGCAGCTTTC
[0056] (二)PCR扩增目的基因
[0057] aroCL基因片段扩增体系：
[0059] PCR条件：95°C 5min，一次；94°C lmin、55°C 458、72Γ458、3〇εγ(：1θ;72Γ 5min， 一次。
[0060] aroCR基因片段的扩增体系：
[0062] PCR条件：95°C 5min，一次；94°C lmin、55°C 458、72Γ458、3(^γ(：1θ;72Γ 5min， 一次。
[0063] (三）SS3ST3 AaroC的构建
[0064] 以SS3ST3基因组作为模板，aroCLL、aroCLR和aroCRL、aroCRR作为引物扩增DNA片 段。PCR产物使用适当的限制性酶消化，目的片段与pG+h 〇st5连接，从而获得重组质粒pGA aroGpG Δ ar〇C经过电转化进入SS3ST3，28°C红霉素平板上筛选阳性克隆。阳性克隆转接 TSB后生长到对数中期时用不含有红霉素的TSB稀释后在28 °C生长到对数初期。把培养瓶转 移至37°C孵育4h。随后，把细菌均匀涂布在TSA平板上37°C生长，挑选红霉素敏感克隆用PCR 鉴定。鉴定正确的重组克隆于TSB中37 °C摇床培养，得到一定浓度菌液后，-80 °C冰箱保存。 [0065](四）缺陷型突变菌Aar〇C的鉴定：
[0066] 首先，分别以野生菌SS3ST3与突变菌SS3ST3 Aar〇C为模板，
[0067] Δ arο1(ATATTATGGCAGTTGAGGACATCG)、
[0068] Δ aro2(CTTCTGACTGGGCTGCACGCTCT)为引物，PCR得到片段电泳结果(见附图1)。訂 代表野生菌SS3ST3，此泳道扩增出309bp左右的目的片段，而突变菌Δ ar〇C和阴性对照的泳 道未扩增出目的片段。然后，分别以野生菌SS3ST3与突变菌Δ ar〇C为模板，ar〇CLL、ar〇CRR 为引物，PCR的方法获得目的片段，结果（见附图lhWT代表野生菌SS3ST3,此泳道扩增出 1400bp左右的目的片段，突变菌Δ ar〇C的泳道扩增出llOObp左右的目的片段。
[0069] 综合PCR的实验结果，可以表明突变菌株Aar〇C的aroC基因缺失了300bp左右的基 因片段，突变菌株A aroC构建成功。
[0070] 实施例2突变株与野生株对比培养实验
[0071] 将构建好的突变株和野生株复苏接种含有THB培养基静置培养6h。细菌计数，然后 分别取l〇4CFU的细菌接种于20ml含有添加芳香簇氨基酸（酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸各 100mg/L)和不添加芳香簇氨基酸的THB培养基中静置培养，每小时取200μ1测量菌液的 0D600值，绘制生长曲线。观察结果(见附图2):由于缺失了aroC基因，导致该菌为芳香簇氨 基酸营养缺陷型，因此在未补加芳香簇氨基酸的培养基中生长速度显著下降，但是当培养 基中添加三种芳香簇氨基酸后，其生长速度和野生株在未补加芳香簇氨基酸的培养基中生 长速度一致。
[0072]实施例3小鼠毒力实验
[0073] 20只4-6周龄BALB/c小鼠，随机分为2组，一组注射野生菌SS3ST3,另一组注射突变 菌SS3ST3 AaroC，用于对比两种菌株的毒力大小。
[0074] 细菌使用PBS重悬后，菌液适当稀释到10 X 108CFU/ml，小鼠腹腔注射500μ1，观察 小鼠存活状态，记录小鼠的死亡时间，并对结果进行分析，小鼠持续观察12天。
[0075]实验结果:野生菌一组的小鼠9天内死亡率达80%，并表现严重的临床症状，突变 菌SS3ST3 Δ ar〇C-组小鼠12天内100 %存活，且没有任何临床症状。
[0076]实验结果表明：缺陷菌株AhasB的毒力显著下降。
[0077]实施例4 Δ ar〇C主动免疫保护实验
[0078] 把40只4-6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为4组，每组10只。第1组小鼠，第一次腹腔 注射500μ1突变菌SS3ST3 AaroC进行免疫，菌液浓度为2xl06CFU/ml，14天后以同样的剂量 再次免疫;第2组小鼠作为阳性对照以同样的方法注射灭活的疫苗进行免疫，该灭活苗是灭 活野生菌与弗氏佐剂乳化的混合灭活疫苗，第一次腹腔注射500μ1，后续免疫为每2周1次。 第3组小鼠使用相同的弗氏佐剂乳化的PBS以同样的方法注射小鼠作为阴性对照，第4组小 鼠使用PBS以同样的方法注射小鼠作为空白对照。
[0079] 4组小鼠全部免疫完成后，每组小鼠腹腔注射致死剂量的野生菌，观察每组小鼠的 存活率，并记录结果。
[0080] 实验结果：由于没有疫苗的免疫保护，第3组与第4组小鼠在接入致死剂量的野生 菌后，5天内全部死亡。第2组小鼠在野生菌灭活疫苗的免疫保护下，存活率达80 %。第4组小 鼠得到突变菌株SS3ST3 Δ ar〇C的免疫保护，直到研究结束小鼠存活率为100%。除此之外， 所有阴性对照和空白对照的小鼠都表现出明显的临床症状，例如被毛粗糙零乱，刺激反应 迟缓等现象，然而使用突变菌SS3ST3 △ aroC免疫的小鼠没有表现任何临床症状。
[0081] 实验结果表明：突变菌SS3ST3 △ aroC的免疫效果比野生菌灭活疫苗的免疫效果 好，经过突变菌SS3ST3 △ aroC免疫过的小鼠抵抗力强，再次受到野毒感染后保护率达到 100%〇
[0082]实施例5诱导免疫反应类型
[0083] T细胞群由两个亚群组成，分别是Thl亚群和Th2亚群。Thl亚群表达IFN-γ，能够激 活K细胞细胞毒作用，引起迟发型超敏反应，介导细胞免疫反应。Th2亚群表达IF-4，促进抗 体的产生，引起体液免疫。小鼠经突变菌SS3ST3 Aar〇C免疫后，可以通过检测小鼠脾脏细 胞内IFN- γ和IL-4的mRNA水平间接的评价这两个细胞亚群的活性。
[0084] 6只BALB/c小鼠随机分为两组，一组腹腔注射1 X 106CFU Aar〇C，另一组注射PBS， 剂量都为〇. 5ml。注射96h后，对每只小鼠的脾脏细胞分别进行提取RNA。使用定量PCR的方法 鉴定IFN- γ和IL-4的转录水平。
[0085] 实验结果：定量PCR分析结果显示免疫后96小时后的小鼠脾脏细胞中的IL-4和 IFN- γ mRNA水平显著增加。除此之外，IFN- γ的mRNA水平显著高于IL-4的mRNA水平(见附图 5)〇
[0086]实验结果表明：突变菌株AaroC可以激活小鼠体内Thl和Th2两个细胞群的免疫反 应，同时表现细胞免疫和体液免疫，并且细胞免疫水平显著高于体液免疫水平。
[0087]上述使用的材料均购于市面。
[0088]其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描 述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经 创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
【主权项】
1. 一种猪链球菌血清3型aroC基因功能缺陷的突变链球菌菌株SS3ST3 A aroC，其特征 在于：其命名为SS3ST3 AaroC，其SS3ST3 AaroC为所述链球菌菌株SS3ST3缺少AaroC基 因。2. -种权利要求1所述猪链球菌血清3型aroC基因功能缺陷的突变链球菌菌株SS3ST3 A aroC制备方法，其特征在于:包括W下步骤： 1. WSS3ST3基因组DNA为模板，使用Primer Premie;r5.0设计扩增目的片段aroC基因的 引物对， aro化L:5 '-AAAGAAGCTTCAACGCTTTATCAG-3 '， aroCLR:5 '-TTCAGTCGACATACGACTACCACGAC-3 '； aroC化：5 '-GGAGGGATCCAGACTGTTGTTGGAGGAG-3 '， aroCRR:5 '-TCGCGAATTCTGGCTACCGCAGCTTTC-3 '； 2. PCR扩增目的基因 。。^nPT丑：曲t±?铅由^牛骑"C玄.aro化基因片段PCR的条件为：95°C 5min，一次；94°C lmin、55°C 45s、72°C 45s、 30巧cle;72°C 5min，一次； aroCR基因片段的扩增体系：aroCR基因片段条件：95°C 5min，一次；94°C lmin、55°C45s、72°C 45s、30巧cle;72°C 5min，一次； 3. SS3ST3AaroC的构建 WSS3ST3基因组作为模板，aro化Uaro化R和aroCRUaroCRR作为引物扩增DNA片段， PCR产物使用适当的限制性酶消化，目的片段与pG、ost5连接，从而获得重组质粒pG A aroC;pG A aroC经过电转化进入SS3ST3,28°C红霉素平板上筛选阳性克隆； 4) 阳性克隆的保存 阳性克隆转接TSB后生长到对数中期时用不含有红霉素的TSB稀释后在28°C生长到对 数初期，把培养瓶转移至37 °C解育4h;随后，把细菌均匀涂布在TSA平板上37 °C生长，挑选红 霉素敏感克隆用PCR鉴定；鉴定正确的重组克隆于TSB中37°C摇床培养，得到菌液，置于-80 °C冰箱保存。3. 突变链球菌菌株SS3ST3 A aroC在制备猪链球菌血清3型弱毒疫苗中的应用。4. 一种突变链球菌菌株SS3ST3 A aroC制备猪链球菌血清3型弱毒疫苗的方法，其特征 在于:包括W下步骤： 1) 把权利要求2构建成功的菌种SS3ST3 A aroC复苏于SmUSB中，37°C摇床培养过夜； 2) 取摇床过夜的菌种2ml于350ml TSB的培养瓶内，37°C摇床培养6-8h; 3) 把培养瓶中的菌液SOOOrpm，离屯、3min，去上清； 4) 收获的细菌与灭菌的20%脱脂乳混合，使用冷冻真空干燥器制作成细菌冻干活疫 苗，-20°C低溫冰箱保存。
【文档编号】C12R1/46GK105985920SQ201510825069
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年11月24日
【发明人】章红军, 赵祖凯, 魏子贡, 樊翠华, 罗小锋
【申请人】武汉天种畜牧股份有限公司