专利名称：一种人唾液中变形链球菌和茸毛链球菌的检测方法
技术领域：
本发明属于口腔流行病学技术领域，更具体涉及一种人唾液中变形链球菌和茸毛链球菌的检测方法。
背景技术：
龋病是一种细菌感染性疾病。大量研究表明，主要致龋微生物为变形链球菌组。变形链球菌组有几种方法。目前普遍将变形链球菌组分为若干独立菌种。在人类中普遍流行的血清型c及与其具有血清交叉反应的e和f型称为“变形链球菌”(Streptococcus mutans，S.mutans)。D，g型称为茸毛链球菌或远缘链球菌(Streptococcus sobrinus，S.sobrinus)，前两种细菌在人类检出率较高。而其他几种变形链球菌组成员，如仓鼠链球菌(S.cricetus，血清型a)、鼠链球菌(S.rattus，血清型b)、猴链球菌(S.macacae，血清型e)、道勒链球菌(S.downei，血清型h)，很少在人类中检出。因此，在变形链球菌组中变形链球菌和茸毛链球菌为人类的主要致病菌。长期以来，变链菌备受关注。但近来的一些研究表明，茸毛链球菌与变形链球菌相比，可能具有更强的致龋潜力，对龋病的发生和活跃性可能更为重要。当唾液和牙菌斑中变形链球菌与茸毛链球菌同时存在时，此仅单一存在变形链球菌或茸毛链球菌龋病发生率显著增高(Hirose H，Hirosek，Isogai E，eta1.Close association between Streptococcus sobrinus in the saliva of youngchildren and smooth-surface caries increment.Caries Res，1993，27(4)292)(Lindquist B，Emilson CG，et al.Differences in cariogenicity betweenfresh isolates of Streptococcus sobrinus and Streptococcus mutans.CariesRes，1991，25(2)146)。变形链球菌单独感染的情况较常见，而茸毛链球菌常在有较多变链的宿主口内或能分离出变链菌的牙齿上存在。
以往的区分和鉴定变形链球菌和茸毛链球菌的方法包括在轻唾培养基上观察菌落形态、生化鉴定、免疫血清学鉴定、DNA探针等方法。但这些方法存在着费时、灵敏度不高等缺点。
PCR是一种DNA体外扩增技术，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时，对待检原始材料质量要求低等特点。
近来，有许多研究者用PCR检测口腔病源菌。Allaker选择变链菌表面蛋白基因(spaP gene)中192bp片段作为特异性扩增片段，检测在龋损的釉牙本质界(enamel-dentine junction，EDJ)的变形链球菌的检出率；还将PCR法检测出变形链球菌的检出率与一种龋损染色剂的染色效果作了相关分析，结果表明两者密切相关，推测治疗过程中充分去除染色的组织将可预防可能残余的变链菌对牙体组织的继续侵蚀。另外，分别有学者根据牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis，P.g)中纤毛基因(fimA gene)、胶原酶基因(collagenase gene)、16S rRNA基因等序列设计特异性引物，进行PCR反应，以鉴定牙龈卟啉菌，并用PCR反应检测不同人群牙菌斑及唾液中牙龈卟啉菌的检出率。至今，用PCR反应检测不同人群牙菌斑及唾液中变形链球菌和茸毛链球菌国内外少见报道。
发明内容
本发明的目的是提供了一种人唾液中变形链球菌和茸毛链球菌的检测方法，能快速检测变形链球菌和茸毛链球菌，方法简单，成本低廉。
变形链球菌产生三种葡糖基转移酶(glucosyltransferase，GTF)GTF-I(合成非水溶性葡聚糖的GTF)、GTF-SI(合成水溶性和非水溶性葡聚糖的GTF)、GTF-S(合成水溶性葡聚糖的GTF)。茸毛链球菌产生四种葡糖基转移酶-GTF-I，GTF-S，GTF-SA，GTF-SB。变链菌gtfI基因与茸毛链球菌gtfB基因编码的GTF-I能合成非水溶性葡聚糖，发挥重要致龋作用。而且gtfB和gtfI基因中有种属特异性核苷酸序列，因此根据gtfB(M17361)(Shiroza T，Ueda S and KuramitsuK.Sequence analysis of the gtfB gene from Streptococcus mutans.JBacteriol，1987，169(9)4263-4270)(Ueda S，Shiroza T，and Kuramitsu K.Sequenceanalysis of the gtfC gene from Streptococcus mutans GS-5.Gene，1988，69(1)101-109)和gtfI(D90213)(Abo H，Matsumura T，Kodama T，et al.Peptidesequences for sucrose splitting and glucan binding within Streptococcus sobrinusglucosyltransferase(water-insoluble glucan synthetase).J Bacteriol.1991，173(3)989-996)的核苷酸序列分别设计引物，将两种细菌的引物混合于一个PCR反应中，可明显分辨两种细菌。第一次PCR能检测≥105CFU细菌，第二次PCR能检测≥103CFU细菌。为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施A设计引物。本发明所提供的套式聚合酶链式反应(nested polymerasechain reaction，N-PCR)包括二次PCR，4对引物(变形链球菌第一对正反引物为5′-TAACTACACTTTCGGGTGGCTT和5′-GATGTATCAGTATAAGCGCCAG，第二对正反引物为5′-AAAGCAGATTCTAATGAATCGA 和5′-AATGTAAAATTTTGCCATCAGC；茸毛链球菌第一对正反引物为5′-GGTATCGTCCAAAATCAATCC和5′-TTATCGATACCGTAAGCTGCC，第二对正反引物为5′-TGGTATCGTCCAAAATCAATCC 和5′-AGATTTGCAGTTGGTCAGCATC)。
B细菌染色体DNA及唾液染色体DNA提取。
细菌DNA的提取3ml细菌隔夜培养物，10,000rpm离心，4℃10分钟，去上清，200μlTE缓冲液冲洗二次，将沉淀重悬于内含2mg溶菌酶的200μlTE液中，37℃，30分钟，加40μg蛋白酶K，并加入10％SDS45μl(终浓度1.5％)，混匀，37℃，3小时，等体积苯酚、氯仿抽提二次，无水乙醇沉淀DNA，离心10,000rpm，10分钟，弃上清，70％乙醇洗涤，溶于TE缓冲液中。
唾液染色体DNA的提取1ml唾液，8,000rpm，4℃离心，15分钟，去上清，500μlTE缓冲液洗二次，将沉淀重悬于内含2mg溶菌酶的200μlTE液中，37℃，30分钟，加4μg蛋白酶K，并加入10％SDS45μl(终浓度1.5％)混匀，37℃，3小时，等体积苯酚、氯仿抽提二次，无水乙醇沉淀DNA，离心1,0000rpm，10分钟，弃上清，70％乙醇洗涤，溶于TE缓冲液中。
C第一次PCR。依次加入两对外引物thp3、thp4、thp5、thp6各50pmol，4种dNTP混合物(每种终浓度200μM)4μl，10×反应缓冲液5μl，细菌模板DNA2μl，TaqDNA聚合酶2.5U，灭菌水36μl，混匀。反应按94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次，最后72℃延伸5分钟。
D第二次PCR。将第一次PCR产物取2μl，稀释10倍后，取2μl作模板，以thp7、thp8、thp9、thp10各50pmol，其它成份及步骤同第一次PCR。
E电泳。取扩增产物5μl，1.0％琼脂糖凝胶电泳电压80V，0.5μg/ml溴化已锭染色，以DL2,000DNA Marker为标准对照，在紫外检测仪下观察扩增带。
与经典的细菌培养法相比，N-PCR具有以下优点①N-PCR可直接以唾液为模板，通过PCR反应，进行口腔中变链菌与茸毛链球菌检出率的研究，而经典的细菌培养法需经过细菌的分离和鉴定，步骤繁琐；②N-PCR可以快速从唾液中鉴别出是否存在变形链球菌和茸毛链球菌(仅需6小时)，而经典的细菌培养法相对复杂，一般需4-5天；③N-PCR经两次PCR连续放大提高了检测的灵敏度和特异性，而经典的细菌培养法根据细菌形态和生化特性进行鉴定，受较多人为因素影响，灵敏度和特异性低；④针对个体研究对象1ml唾液样本进行PCR的结果可将细菌感染水平分为三个水平≥105CFU，为高度感染对象；≥103-＜105CFU，为中度感染对象；＜103CFU，为低度感染对象。因此，用套式PCR法在分辨变链菌与茸毛链球菌的同时，可以通过比较两种细菌数量上的差异，结合龋患状况(如以龋失补DMF为指标)，进一步探索哪种细菌与龋病易感性关系更加密切，为预防龋病的发生奠定基础，而经典的细菌培养法无此特点。
图1以thp3，thp4，thp5，thp6为引物第一次PCR扩增变链菌组产物电泳示意图1仓鼠链球菌S.cricetus AHT；2.鼠链球菌S.rattus BHT；3.变形链球菌S.mutansIngbritt；4.茸毛链球菌S.sobrinus OMZ176；5.变形链球菌S.mutans LM-7；6.变形链球菌S.mutans OMZ175；7.茸毛链球菌S.sobrinus 6715；8.道勒链球菌S.downei Mfe28.MarkerDL2,000 Ladder.
图2以thp7，thp8，thp9，thp10为引物第二次PCR扩增变链菌组产物电泳示意图1仓鼠链球菌S.cricetus AHT；2.鼠链球菌S.rattus BHT；3.变形链球菌S.mutansIngbritt；4.茸毛链球菌S.sobrinus OMZ176；5.变形链球菌S.mutans LM-7；6.变形链球菌S.mutans OMZ175；7.茸毛链球菌S.sobrinus 6715；8.道勒链球菌S.downei Mfe28.MarkerDL2,000 Ladder图3以thp3，thp4，thp5，thp6为引物，不同细菌DNA为模板的PCR产物电泳示意图1唾液链球菌S.salivarius HB；2.唾液链球菌S.salivarius HBC 12；3.口腔链球菌S.oralis ATCC 10557；4.轻链球菌S.mitis ATCC 9811；5.血链球菌S.sanguis903；6.格登氏链球菌S.gordonii；7.粘性放线菌A.viscosus ATCC 19246；8.粘性放线菌A.viscous ATCC 29525；9.大肠杆菌E.coli JM 109；10.大肠杆菌E.coliDH 5α；11.牙龈卟啉菌P.g ATCC 33277；12.假单胞菌Pseudomonas AP 930065；13.变形链球菌S.mutans Ingbritt；14.茸毛链球菌S.sobrinus 6715图4以thp3，thp4，thp5，thp6为引物的PCR的灵敏度变形链球菌Ingbritt菌数量依次为1∶108CFU，2∶107CFU；3.106CFU；4.105CFU图5以thp3，thp4，thp5，thp6为引物的PCR的灵敏度茸毛链球菌6715菌数量依次为1107CFU，2106CFU；3105CFU图6以thp7，thp8，thp9，thp10为引物的第二次PCR的灵敏度变形链球菌Ingbritt菌数量依次为1104CFU，2103CFU图7以thp7，thp8，thp9，thp10为引物的第二次PCR的灵敏度茸毛形链球菌S.sobrinus 6715株菌数量依次为1105CFU，2104CFU；3103CFU图8以thp3，thp4，thp5，thp6为引物，PCR扩增直接检测唾液中变形链球菌S.mutans和茸毛形链球菌S.sobrinus.
1.变形链球菌S.mutans Ingbritt；2.茸毛形链球菌S.sobrinus 6715；3.A研究对象的唾液样本；4.B对象的唾液样本；5.C对象的唾液样本图9以thp3，thp4，thp5，thp6为引物，二次PCR扩增直接检测唾液中变形链球菌S.mutans和茸毛形链球菌S.sobrinus.
1.变形链球菌S.mutans Ingbritt；2.茸毛形链球菌S.sobrinus 6715；3.A研究对象的唾液样本；4.B对象的唾液样本；5.C对象的唾液样本具体实施方式
下面根据附图对本发明作进一步详细描述变形链球菌产生三种葡糖基转移酶(glucosyltransferase，GTF)GTF-I、GTF-SI、GTF-S。茸毛链球菌产生四种葡糖基转移酶-GTF-I，GTF-S，GTF-SA，GTF-SB。变链菌gtfI基因与茸毛链球菌gtfB基因编码的GTF-I能合成非水溶性葡聚糖，发挥重要致龋作用。而且gtfB和gtfI基因中有种属特异性核苷酸序列，因此根据gtfB(M17361)和gtfl(D90213)的核苷酸序列分别设计引物(引物序列见表1)，运用套式多聚酶链反应技术使用Taq DNA聚合酶建立PCR反应体系，从变链菌组标准株细菌DNA及唾液提取的混合细菌DNA中扩增出不同长度的目的DNA片段(见表2及图1-3)。
A设计引物。本发明所提供的套式聚合酶链式反应(nested polymerasechain reaction，N-PCR)包括二次PCR，4对引物(变形链球菌第一对正反引物为5′-TAACTACACTTTCGGGTGGCTT和5′-GATGTATCAGTATAAGCGCCAG，第二对正反引物为5′-AAAGCAGATTCTAATGAATCGA 和5′-AATGTAAAATTTTGCCATCAGC；茸毛链球菌第一对正反引物为5′-GGTATCGTCCAAAATCAATCC和5′-TTATCGATACCGTAAGCTGCC，第二对正反引物为5′-TGGTATCGTCCAAAATCAATCC 和5′-AGATTTGCAGTTGGTCAGCATC)。
B细菌染色体DNA及唾液染色体DNA提取。
细菌DNA的提取3ml细菌隔夜培养物，10,000rpm离心，4℃10分钟，去上清，200μlTE缓冲液冲洗二次，将沉淀重悬于内含2mg溶菌酶的200μlTE液中，37℃，30分钟，加40μg蛋白酶K，并加入10％SDS45μl(终浓度1.5％)，混匀，37℃，3小时，等体积苯酚、氯仿抽提二次，无水乙醇沉淀DNA，离心10,000rpm，10分钟，弃上清，70％乙醇洗涤，溶于TE缓冲液中。
唾液染色体DNA的提取1ml唾液，8,000rpm，4℃离心，15分钟，去上清，500μlTE缓冲液洗二次，将沉淀重悬于内含2mg溶菌酶的200μlTE液中，37℃，30分钟，加4μg蛋白酶K，并加入10％SDS45μl(终浓度1.5％)混匀，37℃，3小时，等体积苯酚、氯仿抽提二次，无水乙醇沉淀DNA，离心1,0000rpm，10分钟，弃上清，70％乙醇洗涤，溶于TE缓冲液中。
C第一次PCR。依次加入两对外引物thp3、thp4、thp5、thp6各50pmol，4种dNTP混合物(每种终浓度200μM)4μl，10×反应缓冲液5μl，细菌模板DNA2μl，TaqDNA聚合酶2.5U，灭菌水36μl，混匀。反应按94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次，最后72℃延伸5分钟。
D第二次PCR。将第一次PCR产物取2μl，稀释10倍后，取2μl作模板，以thp7、thp8、thp9、thp10各50pmol，其它成份及步骤同第一次PCR。
E电泳。取扩增产物5μl，1.0％琼脂糖凝胶电泳电压80V，0.5μg/ml溴化已锭染色，以DL2,000DNA Marker为标准对照，在紫外检测仪下观察扩增带。
表1变形链球菌与茸毛链球菌N-PCR引物序列
表2变链菌组在N-PCR反应中扩增的产物长度
经过多组电泳鉴定，证实变形链球菌与茸毛链球菌扩增片段长度(第一次PCR 529bp和700bp，第二次PCR 468bp和663bp)，在琼脂糖凝胶上易于分辨。而非变形链球菌组的标准菌株均未见任何扩增带(见图3)。可见，此PCR反应对变链球菌组细菌亦具有特异性，又因变形链球菌和茸毛链球菌扩增片段长度具有特异性，证明该PCR反应可有效区分这两种菌。并且第一次PCR反应，以105CFU的DNA作模板，可见特异性扩增带。而第二次PCR反应，仅103CFU的DNA作模板都有特异性扩增带(见图4-7)。N-PCR亦可检测唾液样本中的变形链球菌和茸毛链球菌(见图8和9)。因此，针对个体研究对象1ml唾液样本进行PCR的结果可将细菌感染水平分为三个水平≥105CFU，为高度感染对象；≥103-＜105CFU，为中度感染对象；＜103CFU，为低度感染对象。
权利要求
1.一种人唾液中变形链球菌和茸毛链球菌的检测方法，它包括下列步骤A、设计引物所提供的套式聚合酶链式反应包括二次PCR，变形链球菌第一对正反引物为5′-TAACTACACTTTCGGGTGGCTT和5′-GATGTATCAGTATAAGCGCCAG，第二对正反引物为5′-AAAGCAGATTCTAATGAATCGA和5′-AATGTAAAATTTTGCCATCAGC；茸毛链球菌第一对正反引物为5′-GGTATCGTCCAAAATCAATCC和5′-TTATCGATACCGTAAGCTGCC，第二对正反引物为5′-TGGTATCGTCCAAAATCAATCC和5′-AGATTTGCAGTTGGTCAGCATC；B、细菌染色体DNA及唾液染色体DNA提取首先是细菌DNA的提取3ml细菌隔夜培养物，10000rpm离心，4℃10分钟，去上清，200μlTE缓冲液冲洗二次，将沉淀重悬于内含2mg溶菌酶的200μlTE液中，37℃30分钟，加40μg蛋白酶K，并加入10％SDS45μl，混匀，37℃3小时，等体积苯酚、氯仿抽提二次，无水乙醇沉淀DNA，离心10000rpm10分钟，弃上清，70％乙醇洗涤，溶于TE缓冲液中；其次是唾液染色体DNA的提取1ml唾液，8000rpm，4℃离心15分钟，去上清，500μlTE缓冲液洗二次，将沉淀重悬于内含2mg溶菌酶的200μlTE液中，37℃30分钟，加4μg蛋白酶K，并加入10％SDS45μl，混匀，37℃3小时，等体积苯酚、氯仿抽提二次，乙醇沉淀DNA，离心1,0000rpm，10分钟，弃上清，70％乙醇洗涤，溶于TE缓冲液中；C、第一次PCR依次加入两对外引物thp3、thp4、thp5、thp6各50pmol，4种dNTP混合物4μl，10×反应缓冲液5μl，细菌模板DNA2μl，TaqDNA聚合酶2.5U，灭菌水36μl，混匀，反应按94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次，最后72℃延伸5分钟；D、第二次PCR将第一次PCR产物取2μl，稀释10倍后，取2μl作模板，以thp7、thp8、thp9、thp10各50pmol，其步骤同第一次PCR；E电泳取扩增产物5μl，1.0％琼脂糖凝胶电泳电压80V，0.5μg/ml溴化已锭染色，以DL2,000 DNA Marker为标准对照，在紫外检测仪下观察扩增带。
全文摘要
本发明公开了一种人唾液中变形链球菌和茸毛链球菌的检测方法，首先是设计引物，所提供的套式聚合酶链式反应包括二次PCR，4对引物，变形链球菌两对正反引物和茸毛链球菌两对正反引物；其次是细菌染色体DNA及唾液染色体DNA提取；第三是第一次PCR，依次加入两对引物，四种dNTP混合物及模板DNA和Taq酶；第四是第二次PCR，将第一次PCR产物稀释，加入另外两对引物，进行扩增；第五是电泳。本发明方法简单，成本低廉。
文档编号G01N27/447GK1737161SQ20051001913
公开日2006年2月22日 申请日期2005年7月21日 优先权日2005年7月21日
发明者边专, 谭海平, 孟柳燕, 樊明文 申请人:武汉大学