抗微生物组合物的制作方法

专利名称：抗微生物组合物的制作方法
技术领域：
本发明的内容涉及一类新颖的唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、含有该类细菌的组合物、以及这类唾液链球菌菌株作为抗微生物制剂，特别是预防或治疗龋齿病的用途。
背景龋齿是以牙齿的无机质部分发生溶解为特征的一种疾病。随着龋齿发病的进展，牙齿的珐琅质和牙本质受到破坏，然后引起齿髓及其周围组织发炎。
变异链球菌(MS，mutans streptococcus)是定居在齿斑中的一类产酸性链球菌菌丛，据认为是引起龋齿的主要病因。如今已经识别的有7种不同的变异性链球菌(分别是，变异链球菌(S.mutans)、鼠链球菌(S.rattus)、仓鼠链球菌(S.cricetus)、(S.sobrinus)、(S.ferus)、猕猴链球菌(S.macacae)、和窦内氏链球菌(S.downei))。这7种菌中对于人类龋齿重要的菌种是变异链球菌和S.sobrinus。
多年来，为预防或至少缓解龋齿问题，已开发和试验了各种方法，获得了各不相同的结果。曾提出用青霉素之类的抗生素进行治疗，虽有效但无区别地破坏了口腔内有益和有害细菌，造成口腔内微生物系统失去平衡。
为尽量减少对口腔菌群的破坏作用，研究了能产生抗生素的微生物抑制龋齿形成的能力，已经鉴定的具有此种能力的微生物是能够产生杀菌素样抑制性物质(BLIS)的微生物。已从链球菌属、葡萄球菌属、和肠球菌属内筛选出能够产生BLIS，有可能用于预防龋齿的菌株(Balakrishnan，M.等，Caries Res 2001；3575-80)。
所选出的是致病性变异链球菌的一种无毒性同类菌株，或称为效应性菌株。作为细菌性感染替代疗法的效应菌株，其本身必须无毒性，并能通过竞争性活力和/或抗生素活性，成功地与致病性变异链球菌竞争。已经鉴定到若干变异链球菌的效应菌株(Hillman等，J Dent Res 1987；661092-1094；Jame和Tagg，NZ.，Dent，J，1991；8780-83)，并且都显示了强对抗-变异链球菌的活性。但采用这类变异链球菌效应菌株的缺点是，这类菌株具有潜在的致癌作用。
可避免这种缺点的另一种链球菌是唾液链球菌。在WO 01/27143中，已经鉴定到一些唾液链球菌菌株，可用于治疗至少部分是由sobrinus链球菌引起的龋齿病。但没有记录到可对抗一般MS或特别是对抗变异链球菌的活性。同样，据Balakrishnan报道(同上)，已鉴定到唾液链球菌K3能够有效对抗在胰蛋白酶消化的大豆肉汤、酵母浸膏、碳酸钙、琼脂培养基上生长的sobrinus链球菌，但是对变异链球菌无效。
唾液链球菌TOVE-R(Tanzer，J.M.等；Infect Immun，1985，4844-50)是一种拮抗菌株，具有消减龋齿的作用。该菌株是否能够产生BLIS尚无报道。
本申请人现已鉴定到能产生BLIS的唾液链球菌，其在对抗包括变异链球菌在内的能导致龋齿的MS微生物时具有广谱活性。
本发明致力于广泛研究唾液链球菌的这类新颖菌株，并且采用其中能对抗MS的唾液链球菌菌株来治疗龋齿病，或者至少为公众提供一种有用的选择。
发明概述因而，在一个方面，本发明将广泛地论述唾液链球菌的一种菌株，即可产生唾液素A2并显示具有抗MS活性的生物学纯培养物。顺便指出，该菌株不是唾液链球菌K12(K12)。
在另一方面，本发明供的唾液链球菌的一种菌株，即可产生唾液素A2并显示具有抗MS活性的生物学纯培养物，其碳水化合物代谢对所用的左旋阿拉伯糖、菊粉、糖原、木糖醇、和β-龙胆二糖至少一种物质呈阳性反应，或产生β-半乳糖苷酶阳性；和/或对所用的甘油、α-甲基-右旋-甘露糖苷至少一种物质阴性反应，或产生碱性磷酸酶阴性。
优选该菌株对所用的左旋阿拉伯糖、菊粉、糖原、木糖醇、和β-龙胆二糖之一呈阳性反应，或产生α-半乳糖苷酶阳性；和/或对所用的甘油、α-甲基-右旋-甘露糖苷呈阴性反应，或产生碱性磷酸酶阴性。
本发明还提供保存在德国微生物和细胞培养物收藏股份有限公司的唾液链球菌菌株Mia的生物学纯培养物其序号为Weg 1 b，D-38 124，Braumschweig，德国，收藏号DSM 14685；或者，具有与其相同特性的培养物。
本发明也提供获自唾液链球菌可产生唾液素A2的菌株的提取物，这种提取物具有抗MS活性，特别是，该提取物具有抗变异链球菌活性。该提取物可方便地获自唾液链球菌菌株Mia或K12。
在还有一个方面，本发明还提供一种抗菌组合物，其包括上述唾液链球菌或提取物。
再一个方面，本发明还提供包含上述唾液链球菌或提取物，和稀释剂、运载体、和/或赋形剂的治疗制剂。
在一实例中，该制剂或组合物中还包含第二种抗菌药物。
在另一实例中，该治疗性制剂是食物或饮料形式，优选以乳制品为基础的食物或饮料。可供选择的形式还包括药物、糖锭、和糖果。
本发明还提供至少可抑制对本发明唾液链球菌敏感的细菌生长的方法。该方法包括使敏感细菌与有效抑制剂量的本发明唾液链球菌、提取物或组合物或制剂相接触。
优选的敏感细菌是变异性链球菌属(MS)，更优选变异链球菌。
本发明在另一方面还提供一种至少可抑制MS或变异链球菌生长的方法。该方法包括使MS和变异链球菌与有效抑制剂量的以下物质相(i) 本发明的唾液链球菌、其提取物、组合物或制剂；或(ii) 唾液链球菌K12或其抗MS或变异链球菌活性提取物，或者含有K12或其活性提取物的组合物或制剂相接触。
在还有一个方面，本发明提供预防或治疗处理需要的个体中至少部分由变异链球菌引起的龋齿病的方法。该方法包括给予所述个体有效量的(i) 本发明的唾液链球菌、其提取物、组合物或制剂；或(ii) 唾液链球菌K12或其抗变异链球菌活性提取物，或者含有K12或其活性提取物的组合物或制剂。
以至少抑制该个体口腔中变异链球菌的生长。
在还有一个方面，本发明提供一种控制龋齿的发生和严重程度的方法，包括在易患龋齿的个体口腔内施用可控制龋齿量的本发明唾液链球菌、其提取物、组合物或制剂。
在由MS所引起的龋齿病的一实例中，例如，还可采用唾液链球菌K12或其抗MS的活性提取物，或含有这类成分的组合物或制剂。
优选唾液链球菌作为食物、饮料、或营养剂的一部分给药。
本发明的方法可以包括对个体进行初步预处理，以至少减少已存在的正常菌群。
本发明还涉及在上述组合物和方法中采用本发明的唾液链球菌或其提取物。
另一个方面，本发明还涉及在上述方法中，采用唾液链球菌菌株(包括K12)及其活性提取物，用于抑制、控制、预防、或治疗至少部分由变异链球菌，更常见由MS所引起的龋齿病。
尽管以上对本发明作了广泛描述，但本领域技术人员知道，本发明的范围不限于此，还包括以下各实施例所述的内容。
发明详述如前所述，本发明第一个方面涉及可产生唾液素A2并显示抗MS的活性的唾液链球菌菌株。当该唾液链球菌菌株在胰蛋白酶消化的大豆肉汤、碳酸钙、酵母浸膏琼脂培养基(TSBCaYE agar)中生长时，可理想地表现出对包括变异链球菌的MS的广谱抗性作用。例如，在纳入本文参考文献的WO 01/27143中描述了唾液素A2以及产生A2的唾液链球菌菌株(菌株K12)。
在本发明的一项实例中，描述了唾液链球菌Mia菌株，以及具有同样特性的唾液链球菌菌株。采用可研究碳水化合物代谢的API 20链球菌试剂盒(bioMérieux)和API 50 CH(bioMérieux)进行检测，菌株Mia在其生物化学特性方面与菌株K12有所不同，此类差异小结如下API 20 Strep kit(API 20链球菌试剂盒)MiaK12β-半乳糖苷酶+ -碱性磷酸酶- +API 50CH甘油 - +厌氧性左旋阿拉伯糖 + -α-甲基右旋甘露糖苷 - +需氧性菊粉 + -糖原 + -木糖醇 + -β-龙胆二糖 + -本发明采用的菌株宜至少显示有1项，优选至少3项，更优选至少6项，还要优选全部可与菌株Mia的生物化学特性相鉴别。
菌株Mia还表现出比菌株K12更强的抗MS，尤其是抗变异链球菌的活性。
唾液链球菌菌株Mia是一株可产生具有对抗其他细菌，具体是链球菌。更具体是MS，包括变异链球菌的活性作用的杀菌素样抑制性物质(BLIS)的菌株。唾液链球菌菌株Mia，于2001-12-12收藏在德国Braunschweig的德国微生物和细胞培养物保藏有限公司，序号为Weg 1 b，D-38124，收藏号是DSM 14685。
如前所述，MS是龋齿病的主要致病因子，其中尤其重要的是变异链球菌。尽管过去已经报道了可有效拮抗链球菌的可产生BLIS的唾液链球菌菌株，但是可有效拮抗MS，特别是变异链球菌的可产生BLIS的唾液链球菌则是首次得以鉴定。
本发明的唾液链球菌菌株显示出广谱抗菌活性，尤其是在TSBCaYE-琼脂培养基中生长时。因而，这种唾液链球菌本身在治疗方面可作为有效的抗菌药物。在本文中，“治疗”这一词汇包括预防性治疗。治疗这一用途包括治疗或预防微生物感染，具体是链球菌感染。本发明的唾液链球菌特别适合用于对抗MS和变异链球菌。适合采用本发明菌株或提取物进行治疗的病征，包括龋齿病、咽喉痛、以及呼吸困难。
本发明还涉及获自唾液链球菌能产生唾液素A2的菌株，特别是本发明菌株的提取物。这类活性提取物同样可在治疗制剂和方法中采用。该提取物可采用本领域已知的方法方便地通过细胞培养和离心获得。
“治疗制剂”是适合给予需要治疗的个体，特别是龋齿易感性个体的本发明的唾液链球菌菌株或提取物制剂。通常，本发明的治疗制剂由本发明的唾液链球菌菌株或其提取物，以及可接受的运载体、稀释剂和/或赋形剂组成。
“可接受的运载体、稀释剂和/或赋形剂”指用于向个体输送本发明唾液链球菌菌株或其提取物的工具。这类工具应与该细菌细胞活力或该提取物活性相容。适合用于本发明的唾液链球菌活菌株和提取物给药的可接受运载体是本领域技术人员熟知的。适用的运载体通常是惰性的，可以是固体或液态。
在一项实例中，所述运载体是药物学上认可的运载体。适合用于唾液链球菌菌株的药物学上认可的运载体包括但不限于水、缓冲盐水溶液(例如，磷酸缓冲盐水)、药物学上认可的培养基(例如，BACa、TSBCaYE琼脂)、或能保持细菌活力的其他溶液。此外，药物学上认可的运载体可以是水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。适合口服活的或冻干的细菌的各种药物学上认可的运载体是本领域熟知的(例如，参见雷明顿药物科学，第18版，Gennaro编辑，1990，Mack出版发行公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州，本文收录作为参考文献；以及商品供应的口服活乳酸杆菌配方的药用组合物LACTINEXTM。)本领域所知的适用固态运载体包括例如，碳酸镁、硬脂酸镁、纤维素、滑石；糖类如果糖、蔗糖、甘露醇、乳糖；淀粉；面粉；以及脱脂乳粉，和可食用粉类，但不限于此。可给予提取物的运载体同样也是熟知的。
典型的稀释剂，例如有淀粉、乳糖、甘露醇、高土、磷酸钙或硫酸钙、无机盐如氯化钠以及粉状糖或纤维素。
所述组合物也可包括赋形剂类，例如，制备药片的辅助剂、树脂、填充剂、粘结剂、润滑剂、溶剂、润滑剂、崩解剂、防腐剂、缓冲剂、调味剂、调色剂、甜味剂、如需要还有芳香剂。对于增加片剂流动性和可压轧性，优选的赋形剂是ProSolvTM(Penwest，纽约州，美国)。优选的甜味剂是异麦芽糖(isomalt)。
一般的粘结剂包括淀粉、白明胶、糖类如乳糖、果糖和葡萄糖等。天然的或合成的口香胶也适用，包括金合欢树胶、藻酸盐、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷黄芪胶等。聚乙二醇、乙基纤维素和蜡也可用作粘结剂。目前优选的粘结剂是EmdexTM(Penwest，纽约州，美国)。
在成形过程中为防止脱模时发生模盘粘结采用的润滑剂包括润滑性固态材料，例如滑石粉、硅土、硬脂酸镁和硬脂酸钙、聚乙二醇、硬脂酸、以及氢化植物油。
崩解剂是在受到潮湿时可使加药糖锭膨胀而崩解释放其中的唾液链球菌或提取物的物质。崩解剂包括淀粉、粘土、纤维素、褐藻胶和口香胶；尤其是玉米和马铃薯淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、木纤维素、阳离子交换树脂、褐藻酸、胍尔豆胶、柑橘果酱、羧甲基纤维素、海绵粉、以及月桂基硫酸钠。
本发明的唾液链球菌菌株或其提取物，可配制在适合口服的各种组合物中。例如，唾液链球菌菌株，可从唾液链球菌培养物制备成冻干品或菌体细胞糊给药，或可直接施用于口腔。该菌株或提取物还可配制成漱口水、口腔冲洗剂、牙膏、含漱剂、胶囊剂、加药糖锭、糖浆、絮状物、咀嚼口香胶和咀嚼型片剂形式给药；但不限于此。
治疗用制剂可包括食物、糖果或饮料。在一项实例中，该食物或饮料是乳制品为基础的食物或饮料，包括例如酸乳酪、干酪、乳汁、乳粉、加乳饼干以及调味乳。就糖果而言，该制剂可以是，例如WO 00/05972中所述的咀嚼用口香胶。一种优选的配方采用本发明的唾液链球菌的冻干制品的乳粉制剂，其方式类似先前曾报道的双歧菌乳粉(Bifidus Milk Powder)的制备方法(Nagawa等(1988)；J.Dairy.Sci711777-1782)。
一种唾液链球菌口服给予的制剂，是将冻干的唾液链球菌菌株与脱脂乳粉(或同类制品)的混合物经过调味处理以提高其适口性的制剂。
目前本发明唾液链球菌或其提取物的优选口服制剂是加药糖锭、咀嚼型片剂或胶囊。特别优选的是加药糖锭。本发明的一种吸吮型加药糖锭含有本发明的唾液链球菌菌株或提取物，与异麦芽糖和emdex。加药糖锭可通过直接压轧、或者湿性颗粒或干性颗粒制备。加药糖锭可以采用制药技术中熟知的包衣。
该治疗制剂中还可含有营养成分，以维持该制剂内的细菌活力。如前所述，该制剂还可含有调味剂、调色剂、芳香剂，或者可以提高该制剂适口性，和/或提高患者顺从性而不损害该制剂效果的其他化合物。制备口服制剂的方法是本领域熟知的(参见，例如，雷瑞明顿药物科学，第18版，同上，本文收录作为参考文献)。
对于一般的抗微生物应用，也可制造供其他给药方法，包括局部给药，但不限于此制剂。
上述的K12及其活性提取物，同样可按上述方法制备，包含在所述的组合物和制剂中。
本发明的制剂和组合物，还可包含一种或多种第二抗菌药剂。此第二种药物可以是，例如抗生素、或其他抗菌药物，或可产生抗菌物质的微生物。有用的抗菌物质包括乳酸链球菌肽和其他BLIS。该第二种抗菌物质优选BLIS或能产生BLIS的微生物。BLIS可以是唾液素A、A1、A2、和b的一种或多种。其他能产生抗菌物质的微生物包括已知的唾液链球菌，例如K12和K30。
本发明唾液链球菌菌株主要发现于舌头表面。当其与在齿斑内生长的唾液链球菌，例如，TOVE-R(同上)相组合时可产生有益的作用。
本发明的制剂和组合物还可包含其他抗癌药物，例如木糖醇、氟化物、澳大利亚桃金娘树蜜和鞣酸。
对于龋齿治疗，可将本发明的唾液链球菌菌株类或其提取物给予易感龋齿的个体，该个体通常口腔内有变异链球菌或MS定居，其龋齿至少部分是由变异链球菌，更常见由MS所引起。
术语“个体”本文用于包括人、马、犬、猫、猪、绵羊、牛、山羊，但是不限于此。
本发明的唾液链球菌或K12可通过各种方式口服。例如，以上述组合物或制剂的形式，或悬浮液，连续释放剂型(例如，含有唾液链球菌菌株的口腔内植入物)、或冻干粉剂。也可直接将唾液链球菌菌株的冻干品、培养物或菌体细胞糊施加于个体的牙齿或舌头上给予。只要能将该治疗制剂施加于口腔内，任何给药方式都是适宜的。在一项实例中，唾液链球菌或其提取物给药是通过直接施加于个体的牙齿上，例如，用牙刷和/或絮状物将其加在牙齿上。
通常，个体给药的唾液链球菌剂量，是能够有效地取代宿主口腔中的致龋齿MS菌株，或者至少能替代变异链球菌的剂量。“能有效取代宿主口腔中致龋齿MS或至少能替代变异链球菌的剂量”，指能使唾液链球菌菌株在口腔内定居，并且能够显著减少其中定居的致龋齿变异链球菌或MS的有效剂量(例如，通过细菌之间竞争营养物，和/或通过唾液链球菌菌株产生的BLIS)。
当用于指本发明的治疗制剂时，术语“单位剂量”指对于个体适用的单一剂量的物理学不连续单位。每一个单位含有经计算能够产生所需治疗效果的预定量的活性物质(活的唾液链球菌或其活性提取物)，和所需的稀释剂、运载体或赋形剂。
根据不同个体的差异，包括躯体大小、体重、年龄、疾病严重程度(例如，定居MS所引起的龋齿的坚韧度和/或数量)、以及对于治疗的反应性(例如，个体口腔对于细菌定居的易感性)，具体的剂量有很大的不同。确定适宜的给药途径和剂量的方法，可由消费者自己认为是否适合，或者由主治牙科医师或其他临床医师以每个病例为基础来确定。这类确定方法是本领域普通技术人员的常规工作。(参见例如，雷明顿药剂科学，第8版，Gennaro编辑，Mack出版发行公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州，1990)。
通常，给予个体的唾液链球菌的数量范围，约为102-1015个细菌，优选约103-1014个细菌，优选约105-1012个细菌。一般每剂大约109-1010个菌落形成单位(CFU)。每份加药糖锭制剂采用3.8×109个菌落形成单位/毫升。
可以给予多剂唾液链球菌菌株，使之在个体的口腔内定居，取代该个体原来定居的致龋齿MS菌株，尤其是变异链球菌。可能只需要给予患者唾液链球菌菌株或提取物一次，或需重复给予。重复治疗可以是每月一次，每周一次，每天一次，每天两次，或者根据需要而定。为了方便起见，给药可作为患者常规护齿措施而奏效，例如，作为加药糖锭、口香胶、牙膏、或漱口水的一种成分。
为了有利于细菌定居，在一项实例中，本发明的治疗方法包括对个体作初步预处理，以至少减少其口腔内存在的正常菌群，包括致龋齿微生物。该预处理包括给予一种抗微生物性物质的步骤，例如，双氯苯双胍己烷、乳过氧化物酶、绿茶、或凤梨汁(冻干品)，但不限于此。或者可接着给予所述个体处方规定的抗生素疗程，例如，青霉素、红霉素、或羟氨卞青霉素。然后给予本发明的唾液链球菌，或唾液链球菌K12，以减少环境微生物群，重建该微生物群。
目前，优选的龋齿治疗方案包括，用双氯苯双胍己烷凝胶刷牙2-5天，优选3天，进行预处理。宜在施用凝胶后2小时，再给予加药糖锭1-4小时。通过当天间隔1-4小时，每隔2小时，再给予2-5次，优选3次加药糖锭。此方案可持续2-4天，以利于细菌定居。为了维持其作用，须在每天常规刷牙之后，服用1、2、或3粒加药糖锭，一般1-2粒加药糖锭。此方案可根据需要持续进行。
通过培养基个体口腔的细菌，并且根据BLIS的产生和采用本领域熟知的鉴定细菌菌株的其它方法，可确定唾液链球菌菌株在个体口腔内是否已成功地定居。
本发明的方法和用途还包括采用上述一种或多种第二抗菌物质，和/或抗癌性物质。
在本说明书中使用时，术语“包含、含有、已包含、或包含有”它们可解释为具体指存在着的所述特性、整体性、步骤、或组成成分；但不排除存在的或外加的一种或多种其它特性、整体性、步骤、成分，或其组合。
现在参照以下的实验章节内容，以不受限制方式，阐明本发明的各个方面。
实验项目鉴定分离健康成年人口腔的菌株Mia。在37℃和5％CO2条件下在Mitis唾液琼脂(Mitis salvarius agar)中培养，具有唾液链球菌的典型形态如下菌落形状和大小圆形，直径1-2毫米菌落边缘(边界)完整(光滑)隆起状态凸面色泽蓝色质地粘液样在血琼脂[哥伦比亚琼脂基(GIBCO)含有5％人血液]上，在37℃和5％CO2条件下，无溶血性，形态如下菌落形状和大小圆形，直径＜1毫米菌落边缘(边界)完整(光滑)隆起状态凸面色泽白色质地粘液样在血琼脂或在胰蛋白酶消化的大豆肉汤(BBL)+1.5％琼脂和0.1％碳酸钙的Davis琼脂上，该菌的生长与大多数唾液链球菌的典型生长相比较，看来更牢固地粘附于琼脂表面。该菌株的API 20链球菌鉴定代码(API 20 Strep Identification code)是5050451，对应于唾液链球菌(98.4％相同性)。
参照基因文库数据库(GENEBANK database)进行16 rRNA序列分析，确定该菌株属于唾液链球菌(同源性99.9％)。
生物化学特性鉴定唾液链球菌的MIA菌株的生物化学特性鉴定，采用研究碳水化合物代谢的API20链球菌试剂盒(bioMérieux)和API 50CH(bioMérieux)进行测定。
API 20链球菌测试结果如下产生丙酮阳性水解作用阴性β-葡萄糖苷酶 阳性吡咯烷基芳基酰胺酶 阴性α-半乳糖苷酶 阴性β-葡萄糖醛酸酶 阴性β-半乳糖苷酶 阳性碱性磷酸酶 阴性亮氨酸芳基酰胺酶阳性精氨酸二水合酶 阴性核糖阴性左旋-阿拉伯糖 阴性甘露醇 阴性山梨醇 阴性乳糖阳性海藻糖 阳性菊粉阴性棉籽糖 阳性淀粉弱 阳性糖原阴性β-溶血作用 阴性
API 50CH测试结果如下甘油阴性赤藓醇 阴性右旋-阿拉伯糖 阴性左旋-阿拉伯糖 阳性(仅在厌氧条件下)核糖阴性右旋-木糖 阴性侧金盏花醇 阴性B甲基木糖苷 阴性半乳糖 阳性右旋-葡萄糖 阳性右旋-果糖 阳性右旋-甘露糖 阳性左旋-山梨糖 阴性鼠李糖 阴性卫矛醇 阴性肌醇阴性甘露醇 阴性山梨醇 阴性α-甲基-右旋-甘露糖苷 阴性α-甲基-右旋-葡萄糖苷 阳性(仅在厌氧条件下)N-乙酰基-葡萄糖胺 阳性苦杏仁苷阳性熊果苷 阳性七叶苷 阳性水杨苷 阳性纤维二糖阳性麦芽糖 阳性乳糖阳性蜜二糖 阳性(仅在需氧条件下)蔗糖阳性海藻糖 阳性菊粉阳性(仅在厌氧条件下)松三糖 阴性右旋-棉籽糖 阳性Amidon 阳性糖原阳性(仅在厌氧条件下)木糖醇 阳性(仅在需氧条件下)β-龙胆二糖 阳性右旋-松二糖 阴性右旋-来苏糖 阴性右旋-塔格己酮糖 阳性(仅在厌气条件下)右旋-岩藻糖 阴性左旋-岩藻糖 阴性右旋-阿拉伯糖醇 阴性左旋-阿拉伯糖醇 阴性葡萄糖酸酯 阴性2-鲸蜡-葡萄糖酸酯 阴性5-鲸蜡-葡萄糖酸酯 阴性唾液链球菌菌株MIA在Christenens尿素琼脂上生长时尿素酶为阳性。
抑制活性测定杀菌素样抑制性物质(BLIS)延迟性拮抗作用的试验按照Tagg和Bannister的延迟性拮抗作用试验，在血琼脂培养基、哥伦比亚琼脂基(GIBCO)+0.1CaCO3+5％人血液(BACa)上测定产生的LBIS时，菌株Mia的P-型命名是677。
唾液链球菌MIA菌株的P-型生产菌株的定型(P-型)可用于描述细菌对抗一组标准指示菌株的抗微生物活性。这方法是由Tagg和Bannister首先描述的(J.Med.Microbiol.1979；12397-411)。
为了P-定型培养唾液链球菌菌株MIA，在血琼脂+0.1％碳酸钙平板，或胰蛋白酶消化的大豆-酵母浸膏-碳酸钙琼脂(胰蛋白酶消化的大豆肉汤30(毫升)、酵母浸膏20克、碳酸钙2.5克、琼脂15克、蒸馏水1000毫升)进行径向划线，在37℃ 5％CO2条件下培养18小时，使之生长。将平板表面的生长物刮下，用氯仿灭活处理。然后与9个指示菌株进行交叉接种。在37℃ 5％CO2条件下培育18小时之后，记录抑制生长的情况。将9个指示菌株分成每3株为一组，以代码方式记录其抑制模式(例如I1、I2、I3、I4、I5、I6、I7、I8、I9)。根据指示菌株在每组3例中是否分别占据1、2、或3位，给对抗各指示菌株的阳性反应记4、2或、1分。无抑制记分为0。每一组3例的总记分可特定地作为对抗3例指示菌株的反应情况。完成的P-定型代码写作3位数字序列，可连续确定该3例指示菌株内的反应情况。
唾液链球菌MIA菌株在血琼脂+碳酸钙平板上为677P型，在胰蛋白酶消化的大豆-酵母浸膏-碳酸钙琼脂平板上为777P型。
此结果相应于抑制一组9个指示菌株(除了指示菌株3之外)所有9种细菌。这种模式是产生唾液素A的唾液链球菌，例如菌株20P3所得到的典型模式(Ross等，Appl.Envir.Microbiol 1993；592014)。不过，当采用胰蛋白酶消化的大豆肉汤(BBL)+Davis琼脂(1.5％)+0.25％碳酸钙+酵母浸膏(2％)[TSBCaYE]进行测试时，其P-定型为777(即，所有9个指示菌株都被抑制)。在作为指示菌株进行测试时，与对抗指示菌株3的活性增长相关联，还提高了对抗其他细菌的活性(表1)。
表1菌株Mia在血琼脂碳酸钙(BACa)培养基和胰蛋白酶消化的大豆肉汤碳酸钙酵母浸膏(TSCaYE)培养基上的抗微生物活性细菌在培养基上测试时的易感性BACaTSCaYE产芽孢梭状芽孢杆菌++(Clostridiumsporogenes)产气荚膜梭状芽孢杆菌 ++(Clostridiumperfringenes)粘性放线菌 T14++(Actinomycesviscosus) M100 ++奈斯楞德氏放线菌 10301 ++(Actinomycesnaeslundii)
表亲链球菌 OMZ176 - +(Strepcoccussorbrinus)变异链球菌 ATCC1044 9- +(Strepcoccusmutans)OMZ175 - +633K - +H7 - +13M- +E49- +K58- +K60- +M46- +MUTI - +MUTII - +致死性白喉棒状杆菌- +(Crynebacteriumdiphtheriaegravis)粪肠球菌 98 - +(Enterococcusfaecalis)hirae肠球菌9790 - +(Enterococcushirae)无乳链球菌 211B + +(Streptococcusagalactiae) P3 + +多育链球 菌14 + +(Streptococcusuberis) D618 + +短小乳酸杆菌 - +(Lactobacillusbrevis)干酪乳酸杆菌 - +(Lactobacilluscasei)嗜酸性乳酸杆菌+ +(Lactobacillusacidophilus)肺炎链球菌 PK2+ +(Streptococcuspneumoniae) PK34 + +
粘膜炎募拉菌 4-+(Moraxellacatarrhalis) K-+单核细胞增多症李斯特菌 10403 + +(Listeriamonocytogenes)单核细胞增多症李斯特菌 215 + +(Listeriamonocytogenes)粘膜性口腔球菌 Coup+ +(Stomatococcusmucilagenosus)淋病萘瑟菌 - +(Neisseriagonnorhoea)脑膜炎奈瑟菌 - +(Neisseriameningitidis)少乳奈瑟菌 - +(Neisserialactomica)流行性感冒嗜血杆菌 30 - +(Haemophilusinfluenzae)37 - +腐物寄生性葡萄球菌 7292- +(Staphilococcussaprophticus)孔氏葡萄球菌 20260 - +(Staphilococcussaprophticus)抗变异链球菌活性的延迟性拮抗作用试验采用基本上按照Tagg和Bannister所述的延迟性拮抗试验，确定了产唾液素A2菌株的抗变异链球菌的抑制活性谱[J.Med.Microbial.1979；12397]。简而言之，在含或不含酵母浸液(YE)的TSBCa培养基和BACa培养基上，按1厘米宽度作径向划线培养各产生菌株。在37℃厌氧环境下培养24小时之后，用载玻片将肉眼可见的生长菌刮下，使琼脂表面残留的细胞接触氯仿蒸气30分钟予以杀灭，再在空气中晾30分钟。然后，用棉拭子将接种18小时的Todd Hewitt肉汤(THB)指示菌株培养物与原来的划线培养物交叉划线接种。在5％(v/v)CO2和37℃培养18小时后，记录各指示菌株的抑制程度。
胰蛋白酶消化的大豆肉汤碳酸钙酵母浸膏(TSBCaYE)培养基(每500毫升)胰蛋白酶消化的大豆肉汤(BBL) 15克Davis琼脂7.5克酵母浸膏(Difco) 10克CaCO31.25克血琼脂碳酸钙酵母浸膏(BACaYE)培养基(每500毫升)哥伦比亚血琼脂基材(Difco)22克CaCO30.5克酵母浸膏(Difco) 10(克)结果见表2所示。
表2当在BACa或TSBCa培养基中添加酵母浸时进行迟延性拮抗试验比较唾液链球菌菌株Muia与K12的抗变异链球菌活性
菌株Mia在唾液中产生的抑制活性如下制备唾液样品收集刺激产生的唾液，60℃加热0.5小时，然后12000×g离心10分钟。取其上清液补加0.5％麦芽糖、0,5％CaCO3和0.25微克/毫升(终末浓度)半胱氨酸。
经补加成分的上清液用作基础液体培养基，在37℃培养菌株Mia。该接种菌株是取自18小时的TSBYECa培养物，用量比率是每2毫升上清液100微升培养物。按所示补加不同的等份量。
经厌氧条件下培育24小时后，测定各唾液培养物样品的原液或旋转蒸发10×浓缩液对指示菌株OMZ175、MutII和I1的抑制活性。培养在含麦芽糖、半胱氨酸、CaCO3的唾液中培养物的10倍浓缩上清液具有拮抗变异链球菌菌株OMZ175的抑制活性，见下表所示。因此当唾液链球菌菌株Mia在唾液中培养时，可产生抗变异链球菌的活性。
抑制活性的试验方法采用表面斑点方法作终点滴定测定抑制性活性。此方法中，将生理盐水配的测试制备物的二倍系列稀释液，分别以20微升液滴滴在血琼脂培养基表面。当液滴被琼脂收干，使培养基表面接触氯仿蒸汽30分钟而灭菌。晾干后，用棉拭子将指示菌株的18小时THB培养物均匀接种在培养基表面。经培养后，每毫升任意单位(AU)的抑制活性效价为最高稀释倍数的倒数显示出明确的抑制性活性。结果见表3所示。
表 3菌株Mia在唾液中产生的抑制性活性添加物 培养物上清液拮抗指示菌株的活性(AU/ml)未浓缩 浓缩10倍(speedvac)I1 OMZ175 MutII I1 OMZ175MutII仅用唾液00 0 1 0 0M 00 0 1 0 0M，Cy 00 0 1 0 0M，C20 0 2 0 0Cy，Ca 00 0 0 0 0M，Cy，Ca 40 0 4 2 0M＝0.5％麦芽糖，Cy＝0.5％半胱氨酸，Ca＝0.1％CaCo3
唾液链球菌Mia体内拮抗MS的活性一例试验对象在第一天用2％洗必泰凝胶刷牙2分钟。洗必泰处理2小时后，吸吮一片含有3.8×109个菌落形成单位的唾液链球菌菌株MIA药片，然后每隔2小时再服用3片。第二天，该对象重复同样程序一次。在该试验的其余25天，在早晨和晚上用商品牙膏刷牙后，各吸吮一片含菌药片。
对照个体用2％的洗必泰凝胶每天一次洁牙，共3天。其余时间用商品牙膏刷牙。
在试验开始前和试验间隔期，收集全部对象的唾液样品，以测定其中的MS数(每毫升唾液的菌落形成单位(cfu))。唾液样品用灭菌生理盐水稀释，并螺旋形接种在变异菌选择琼脂平板上。在37℃厌氧条件下培养平板2天。测定服用片剂对象唾液样品中的唾液链球菌菌株MIA的数量。将稀释的唾液样品螺旋形接种在Mitis唾液琼脂平板上。37℃和5％CO2培养18-24小时，然后记数唾液链球菌菌落数。采用以下方案测定唾液链球菌菌株MIA的菌落形成百分率。将泥土微球菌和变异链球菌菌株OMZ175的THB新鲜培养物，分别涂布在血琼脂/钙平板表面。然后，挑出唾液链球菌菌落移入此两种平板中。37℃5％CO2培养平板18-24小时。唾液链球菌菌株MIA菌落可在两种平板上的穿刺培育物周围产生抑制区带。菌落形成百分率用阳性菌落数除以挑出的菌落总数来求得。
对照个体(表4)和细菌定居个体(表5)二者中，用2％洗必泰凝胶刷牙导致MS计数减池了1.7-2.4log。在对照个体中，用该凝胶刷牙后1-6天之间，个体的MS细胞计数增加至预处理时的水平。试验对象在用凝胶预处理后，定居率达100％，并在余下的试验期间保持高定居率(表5)。第27天，MS的数量仍保持1.7log低于预处理水平。此结果表明，唾液链球菌菌株MIA的定居能够预防高水平MS的再建立。
表4.2％洗必泰凝胶对对照个体中的MS水平的作用
表5.唾液链球菌菌株MIA的定居对于MS的作用
抗MS的活性提取物的制备将含有2％酵母浸液和0.25％碳酸钙的熔化胰蛋白酶消化的大豆琼脂100毫升，倒入1升Schott瓶中，瓶中加入1ml在Todd Hewitt肉汤中经37℃和含5％CO2的空气培养的唾液链球菌菌株MIA的过夜培养物。该培养物在37℃厌氧条件下培养18-24小时。此瓶在厌氧条件下预培养后，加入含有2％酵母浸液和0.25％碳酸钙的胰蛋白酶消化的大豆肉汤100毫升，再在37℃厌氧条件下培养24小时。离心该肉汤，除去菌体细胞，加入硫酸铵至50％(W/V)，并4℃培育18小时。然后离心样品，沉淀物用1毫升milli Q水重悬。采用在血琼脂平板中进行孔穴扩散试验，测试该样品的抗MS活性。各孔加入50微升样品，在空气中干燥。然后用氯仿处理平板。将培养过夜的指示菌株涂布在平板表面，于37℃和含5％CO2的空气下培养18-24小时。记录对各指示菌株的抑制区带(从孔穴的边缘至细菌细胞生长受抑制的边缘的距离)(表6)。
表6唾液链球菌Mia提取物的孔穴扩散试验
施用剂量示例加药糖锭成分 每945毫克加药糖锭唾液链球菌3.8×109CFU(冻干品)异麦芽糖 600毫克EmdexTM150毫克ProSolv HDTM50毫克硬脂酸镁 15毫克调味剂10毫克将以上成分混匀后，采用干式压制法制成片剂。
产业用途上述结果证明，唾液链球菌菌株，尤其是菌株Mia的抗菌作用，能够拮抗广谱的微生物，特别是链球菌。这些菌株是已作鉴定的首批能产生BLIS的唾液链球菌，具有拮抗MS，特别是变异链球菌的活性。这类菌株及其相关的活性提取物可用于治疗个体，对抗链球菌感染，特别在口腔内感染的有害作用。这些方法包括治疗其主要致病因子是MS或变异链球菌种的龋齿。本发明的唾液链球菌提取物和组合物，也可用于治疗呼气困难和咽喉疼痛。
应当理解只通过实例提供了以上的描述，和本领域技术人员知道可考虑，在所用的材料和技术两个方面进行变化。
权利要求
1.一种唾液链球菌菌株的生物学纯培养物，其特征在于，所述菌株是唾液素A2(Salivaricin A2)产生菌株，并显示具有抗-MS活性，附带条件是该菌株不是唾液链球菌K12(K12)。
2.一种唾液链球菌菌株的生物学纯培养物，其特征在于，所述菌株是唾液素A2产生菌株，显示有抗-MS活性，并且在碳水化合物代谢上对所用的左旋-阿拉伯糖、菊粉、糖原、木糖醇、和β-龙胆二糖中至少一种物质呈阳性反应，或产生β-半乳糖苷酶阳性；和/或对所用的甘油、α-甲基-右旋-甘露糖苷中至少一种物质呈阴性反应，或产生碱性磷酸酶阴性。
3.如权利要求2所述菌株的生物学纯培养物，其特征在于，所述菌株对所用的左旋-阿拉伯糖、菊粉、糖原、木糖醇、和β-龙胆二糖之一呈阳性反应，或产生β-半乳糖苷酶阳性；和/或对所用的甘油、α-甲基-右旋-甘露糖苷之一呈阴性反应，或产生碱性磷酸酶阴性。
4.保存在德国微生物和细胞培养物收藏股份有限公司的一种唾液链球菌Mia菌株的生物学纯培养物，序号为Weg1b，D-38124，Braunschweig，德国，收藏号DSM 14685；或者具有其相同特性的培养物。
5.一种从唾液链球菌的产唾液素A2菌株获得的提取物，其特征在于，这种提取物具有抗MS活性。
6.如权利要求5所述的提取物具有抗变异链球菌活性。
7.如权利要求5或权利要求6所述的提取物，该提取物获自权利要求1-4任一项所述的唾液链球菌。
8.如权利要求5或权利要求6所述的提取物，该提取物获自唾液链球菌K12。
9.一种抗菌组合物，其含有权利要求1-4任一项所述的唾液链球菌，或权利要求5-8任一项所述的提取物。
10.一种含有权利要求1-4任一项所述的唾液链球菌，或者含有权利要求5-8任一项所述的提取物和稀释剂、运载体、和/或赋形剂的治疗制剂。
11.如权利要求9或权利要求10所述的组合物或制剂，其中还包含一种或多种第二抗菌药物。
12.如权利要求9或权利要求10所述的组合物或制剂，其中所述的第二抗菌药物选自乳链菌肽、BUS和能产生BLIS的微生物。
13.如权利要求12述的组合物或制剂，其中所述BLIS选自唾液素A、A1、A2、和B的一种或多种BLIS。
14.如权利要求12所述的组合物或制剂，其中可产生BLIS的微生物是K12和/或K30。
15.如权利要求9-14任一项所述的组合物或制剂，其中还包含有一种或多种第二抗致龋药物。
16.如权利要求15所述的组合物或制剂，其特征在于，其中所述的第二抗致龋药物选自木糖醇、氟化物、澳大利亚桃金娘树蜜或鞣酸。
17.如权利要求9-16任一项所述的组合物或制剂，是可口服的组合物或制剂。
18.如权利要求9-17任一项所述的组合物或制剂，其特征在于，其中所述组合物或制剂包含在食物或饮料中。
19.如权利要求18所述的组合物或制剂，其特征在于，所述的食物或饮料是牛奶为基础的食物或饮料。
20.如权利要求19所述的组合物或制剂，其特征在于，所述的食物或饮料是奶粉、牛奶饼干、牛奶、调味牛奶、酸奶酪或干酪。
21.如权利要求9-17任一项所述的组合物或制剂，其特征在于，其中所述组合物或制剂是药物、糖锭、或糖果形式。
22.如权利要求21所述的组合物或制剂，是糖锭形式。
23.如权利要求21所述的组合物或制剂，其剂型是漱口水、口腔冲洗液、牙膏、含漱剂、糖浆、口腔喷雾剂、胶囊、絮状物、咀嚼口香糖、或药片。
24.如权利要求17-23任一项所述的组合物或制剂，是单位剂型。
25.如权利要求24所述的组合物或制剂，其每一剂含有大约105-1012、优选109-1010CFU的唾液链球菌。
26.一种至少能抑制对权利要求1-4任一项所述唾液链球菌敏感的细菌生长的方法，其特征在于，该方法包括使该敏感细长与权利要求1-4任一项所述的唾液链球菌、权利要求5-8任一项所述的提取物、或权利要求9-25任一项所述的组合物或制剂的有效抑制剂量相接触。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，其中敏感细菌是MS。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，其中敏感性细菌是变异链球菌。
29.一种至少能够抑制MS或变异链球菌细菌生长的方法，其特征在于，该方法包括使MS或变异链球菌与有效抑制剂量的下列物质(i)权利要求1-25任一项所述的唾液链球菌、其提取物、组合物或制剂；或(ii)唾液链球菌K12或其抗-MS或抗变异链球菌的活性提取物，或含有K12或其活性提取物的组合物或制剂。
30.一种治疗需要治疗的个体中至少部分由变异链球菌所引起的龋齿的方法，其特征在于，该方法包括给予所述个体有效量的(i)权利要求1-25任一项所述的一种唾液链球菌、其提取物、组合物或制剂；或(ii)唾液链球菌K12或抗-变异链球菌的活性提取物，或含有K12或其活性提取物的组合物或制剂；以至少抑制所述个体口腔内变异链球菌的生长。
31.一种控制龋齿发生或严重程度的方法，其特征在于，该方法包括在易患龋齿的个体口腔中导入龋齿控制量的权利要求1-25任一项所述的唾液链球菌、其提取物、组合物或制剂。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，其中龋齿是由MS所引起。
33.一种控制MS所引起的龋齿发生或严重程度的方法，其特征在于，该方法包括在易患龋齿的个体口腔中导入龋齿控制量的唾液链球菌K12、其抗-MS活性提取物，或者含有这类成分的组合物或制剂。
34.如权利要求26-33任一项所述的方法，其中唾液链球菌或提取物作为食物、饮料或营养剂的一部分给药。
35.如权利要求26-33任一项所述的方法，其中唾液链球菌或提取物是以权利要求9-25任一项所述的组合物或制剂给药。
36.如权利要求26-35任一项所述的方法，其中包括预处理个体初步步骤，以至少减少已存在的正常菌群。
37.如权利要求36所述的方法，其中用抗微生物剂或抗生素进行预处理。
38.如权利要求37所述的方法，其中抗微生物剂是双氯苯双胍己烷。
39.一种控制龋齿发生或严重程度的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(a)给予所述患者可有效减少正常菌群包括存在的致龋齿微生物的剂量的抗生素或抗微生物剂。；以及(b)给予细菌菌群已减少的环境，权利要求1-4任一项所述的唾液链球菌，或者含有该唾液链球菌的组合物或制剂以重建所述环境的菌群。
40.在制备用于至少能抑制权利要求1-4任一项所述的对唾液链球菌敏感的细菌生长的组合物或制剂方面，权利要求1-4任一项所述的唾液链球菌，或权利要求5-8任一项所述的提取物的用途。
41.在制备用于至少能抑制变异链球菌细菌生长的组合物或制剂中，权利要求1-4任一项所述的唾液链球菌，或权利要求5-8任一项所述的提取物，或者K12，或其抗变异链球菌的活性提取物的用途。
42.在制备用于至少能够抑制MS细菌生长的组合物或制剂中，权利要求1-4任一项所述的唾液链球菌，或权利要求5-8任一项所述的提取物，或者K12，或其抗变异链球菌活性提取物的用途。
43.在用于预防或治疗至少部分由变异链球菌所引起的龋齿的组合物或制剂的制备中，权利要求1-4任一项所述的唾液链球菌，或权利要求5-8任一项所述的提取物，或者K12，或其抗变异链球菌活性提取物的用途。
44.如权利要求37所述的用途，其中龋齿是由MS所引起。
45.在制备用于控制龋齿发生和严重程度的组合物或制剂中，采用如权利要求1-4任一项所述的唾液链球菌，或权利要求5-8任一项所述的提取物的用途。
全文摘要
本发明提供一类新颖的唾液链球菌、含有该类细菌的组合物、以及这类唾液链球菌菌株作为抗微生物药剂的用途。这类菌株至少对于变异链球菌(S.mutans)和/或MS是细菌抑制剂，因而，具有许多治疗用途。此用途包括但不限于作为治疗制剂的一部分，可用于控制、治疗、或预防龋齿病。
文档编号A61P1/02GK1639318SQ03804466
公开日2005年7月13日 申请日期2003年2月21日 优先权日2002年2月22日
发明者C·N·齐尔科特, J·R·塔格 申请人:布利斯技术有限公司