专利名称：稳定化的核酸暗猝灭剂-荧光团探针的制作方法
技术领域：
本发明概括地涉及用于核酸合成的新颖的材料(例如，固体载体和亚磷酰胺)。示 例性的材料包括用稳定化部分官能化的固体载体和亚磷酰胺。多种材料用稳定化部分和猝 灭剂官能化。本发明也提供了核酸单体和寡聚体，包括使用这些材料合成的荧光标记的探 针。也提供了使用结合核酸靶序列的本发明的寡聚体探针的基于寡聚体的分析和诊断方 法。
背景技术：
在基因组研究和开发中，以及在临床医学中，荧光寡核苷酸探针是遗传分析的重 要工具。一种特别有用的荧光探针类型是自猝灭探针，也称作荧光能量转移探针或FET探 针。尽管使用该基序的不同探针的设计可能在细节上存在差异，FET探针含有连接到寡核 苷酸上的荧光团和猝灭剂。荧光团和猝灭剂设计成，仅作为与预期靶物杂交的结果而产生 信号。尽管FET探针的可用性有限，包含它们的应用的技术正在快速地替代竞争方法。已经为杂交测定开发出含有荧光团-猝灭剂对的探针，在所述杂交测定中，探针 形成发夹结构，即在没有阻止发夹结构形成的互补核酸序列存在下，探针与它自身杂交， 形成环，使得猝灭剂分子到达报道分子附近(参见，例如，WO 90/03446 ；欧洲专利申请号0 601 889 A2)。当存在互补靶序列时，探针与互补靶序列的杂交会破坏发夹结构，并造成探 针形成这样的构象，其中猝灭剂分子与报道分子不再近得足以猝灭报道分子。结果，当与靶 序列杂交时，探针会提供比它们未杂交时更强的荧光信号。包含发夹结构的探针难以设计， 且可能妨碍探针与靶序列的杂交。还已经开发出测定法，用于鉴别发夹结构的存在，其中使用2个分开的探针， 一个含有报道分子，且另一个含有猝灭剂分子(参见，Meringue，等人，Nucleic Acids Research, 22 :920_928 (1994))。在这些测定法中，当与靶序列杂交时，报道分子的荧光信号 减弱，这是由于猝灭剂分子到达报道分子附近。包含报道分子_猝灭剂分子对的探针的一个特别重要的应用是它们在核酸扩增 反应例如聚合酶链式反应(PCR)中的应用，用于检测靶核酸序列的存在和扩增靶核酸序 列。一般而言，核酸扩增技术已经为基因测定和DNA分析开发出了许多新方案(参见，例 如，Arnheim 等人 Ann. Rev. Biochem.，61 131-156 (1992))。具体地，PCR 已经成为非常重 要的研究工具，其应用于例如，克隆、基因表达的分析、DNA测序、遗传作图和药物发现(参 见，Arnheim 等人，同上；Gilliland 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 :2725_2729 (1990)； Bevan ^A, PCR Methods and Applications, 1 222-228 (1992) ；Green ^A, PCR Methods and Applications, 1 :77_90(1991) ；Blackwell 等人，Science, 250 :1104-1110 (1990))。
常用于检测核酸扩增产物的方法要求扩增的产物与未反应的引物分离。这通常如 下实现通过使用凝胶电泳，其基于大小差别，将扩增产物与引物分离，或通过产物的固定 化，使游离的引物被洗掉。但是，已经描述了 3种监视扩增过程的方法，且无需事先分离引 物。它们都是基于FRET，它们都不能直接检测扩增的产物。相反，所有3种方法检测一些与 扩增有关的事件。为此原因，它们伴有高背景的问题，且不是定量的，如下面所讨论的。一种方法，如 Wang 等人(美国专利号 5，348, 853 ；Wang 等人，Anal. Chem. ,67 1197-1203(1995))所述，使用能量转移系统，其中能量转移发生在探针上的2个荧光团之 间。在该方法中，扩增的分子的检测发生在扩增反应容器中，不需要分离步骤。但是，该方 法不检测扩增的产物，而是检测引物从“能量-槽”寡核苷酸的解离。因而，该方法依赖于 发射减少的检测；必须使用大部分标记的引物，以便实现反应之前和之后的信号之间的可 靠差异。第二种无需事先分离引物和产物的检测扩增产物的方法是5' _核酸酶 PCR 测定法(也称作 TaqMan 测定法)(Holland 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 7276-7280(1991) ；Lee 等人，Nucleic Acids Res. ,21 :3761_3766 (1993))。该测定法通过 扩增反应过程中双标记的荧光探针("TaqMan"探针)的杂交和切割，检测特定PCR产物 的积累。所述荧光探针由用荧光报道分子染料和猝灭剂染料二者标记的寡核苷酸组成。在 PCR过程中，在且仅在它与要扩增的区段杂交的情况下，该探针被DNA聚合酶的5 ‘-外切 核酸酶活性切割。探针的切割导致报道分子染料的荧光强度的增加。在TaqMan测定法中，供体和猝灭剂优选地位于探针的3 ‘-和5 ‘-末端上，因 为只有当这两个部分彼此不是太接近时，才能满足在荧光团和猝灭剂之间发生5' -3水解 的要求(Lyamichev等人，Science, 260 :778_783 (1993)。该要求是该测定法的一个严重缺 点，因为能量转移的效率随着报道分子和猝灭剂之间的距离的反转6次方(inverse sixth power)而降低。因而，如果猝灭剂与报道分子不能近得足以实现最有效的猝灭，来自未杂交 的探针的背景发射可以是非常高。 再一个依赖于能量转移的应用的检测扩增产物的方法是Tyagi等人(Nature Biotech. ,14 =303-309(1996))所述的“指示标探针”方法，它也是Lizardi等人的美国专利 号5，119，801和5，312，728的主题。该方法采用可以形成发夹结构的寡核苷酸杂交探针。 在杂交探针的一端(5'-或3' _末端)存在供体荧光团，在另一端存在受体部分。在该 方法中，受体部分是猝灭剂，吸收来自供体的能量。因而，当指示标是处于开放构象时，供体 荧光团的荧光是可检测的，而当指示标是处于发夹(关闭)构象时，供体荧光团的荧光被猝 灭。当用于PCR中时，与PCR产物的一条链杂交的分子指示标探针是处于“开放构象”，检测 到荧光，而保持未杂交的那些不会发出荧光。结果，荧光的数量随PCR产物数量的增加而增 力口，因而可以用作PCR进展的度量。因为该方法是基于探针与引物序列之间的模板区域的杂交，它具有许多与之有关 的问题。例如，指示标探针不可能与双链PCR产物的一条链定量杂交，特别是当扩增产物比 指示标探针长得多时。其它限制也已经阻碍FET探针的应用和使用。首先，目前可利用的探针设计具有 比希望更高的荧光噪音背景。在有些情况下，这是由于难以纯化探针，所述探针必须严格地 清除掉任何假的荧光副产物。结果，在它们是可接受之前，探针必须经历至少2个纯化水平。该劳力因素导致非常高的探针成本，约$300-$600/探针。第二个根本限制是探针自身 的固有噪音，它是探针的物理几何学的结果，这对荧光团和猝灭剂相互作用产生限制。最近，已经证实寡核苷酸会以序列特异性的方式结合双链体DNA，形成三链体。单 链核酸(主要是RNA)是寡核苷酸的靶分子，所述寡核苷酸用于通过“反义”机理抑制基 因表达(Uhlmann，Ε·，等人，Chem Reviews(1990)90 543-584 ；van der Krol, A. R.，等人， Biotechniques (1988) 6 :958_976)。根据假说，反义寡核苷酸通过与互补RNA序列杂交，对靶 基因表达产生影响。在该模型中，杂种RNA-寡核苷酸双链体干扰RNA代谢的一个或多个方 面，包括加工、翻译和代谢更新。化学修饰的寡核苷酸已经用于增强它们的核酸酶稳定性。基于可识别的核单体序列，双链体DNA可以被寡聚体特异性地识别。示例性的识 别规则概括在:Maher III，L.J.，等人，Science (1989) 245 :725_730 ；Moser, H. E.，等人， Science(1987)238 :645_650 ；Beal, P.A.，等人，Science(1992) 251 :1360_1363 ；Cooney， M.，等人，Science (1988) 241 :45 6_459 ；和 Hogan，Μ. Ε.，等人，EP 公开 375408。单链和双链体靶序列的序列特异性的靶向可以用于诊断、分析和治疗。在有些其 中要实现这样的结合的情况下，长时间地稳定化得到的双链体或三链体是有利的。以前引证了三链螺旋(或三链体)复合物作为抑制靶基因表达的工具的应用(国 际申请号PCT/US89/05769)。已经证实，三链螺旋结构会干扰靶基因表达(国际申请号PCT/ US91/09321 ；Young, S. L.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (1991) 88 10023-10026)，这证实了 该方案的可行性。欧洲专利申请号92103712. 3，Rahim, S. G.，等人(Antiviral Chem. Chemother. (1992)3 293-297)和国际申请号PCT/SE91/00653描述了在5-位置具有不饱和基团的嘧 啶核单体。5-丙炔基和5-乙炔基属于所述的衍生物。已经描述了在尿嘧啶的5-位置具有不饱和烷基的核单体的合成(DeClercq， Ε.，等人，J.Med. Chem. (1983)26 :661_666 ；Goodchild, J.，等人，J. Med. Chem. (1983)26 1252-1257)。已经描述了含有5-丙炔基修饰的嘧啶的寡聚体(Froehler，B. C.，等人， Tetrahedron Letters(1992)33 :5307_5310)。已经描述了 5-丙炔基-2'-脱氧尿苷、5-丁炔基-2' _脱氧尿苷和有关的化 合物向5'-三磷酸盐的转化，随后通过大肠杆菌聚合酶将单体掺入寡聚体(Valko，K.，等 人，J.Liquid Chromatog. (1989) 12 2103-2116 ；Valko, K.等人，J. Chromatog. (1990)506 35-44)。进行这些研究，作为在尿嘧啶的5-位置具有一系列取代的核苷酸类似物的结 构_活性分析。检查了核苷酸类似物作为大肠杆菌聚合酶底物的活性，并与诸如单体的疏 水性等特征相关联。没有呈现关于含有类似物的寡聚体的性质的信息。具有增强的对互补靶核酸序列的亲和力的寡聚体将会具有提高的用于诊断用途、 治疗用途和研究剂的性质。此外，本领域需要改良的探针，用于快速地、灵敏地、可靠地和定 量地检测核酸(例如，扩增产物)。理想的探针会产生最小的背景信号，且可以容易地和廉 价地制备。非常令人惊讶地，本发明提供了这样的探针。本发明的寡聚的FET和FRET探针 具有提高的对双链和/或单链靶序列的结合亲和力。
图1是显示用稳定化部分官能化的本发明的固体载体的示例性制备的流程图。
图2是显示用官能部分衍生的本发明的固体载体的示例性制备的流程图。
发明内容
本发明提供了一种新的亚磷酰胺和固体载体类型，其用于合成修饰的核酸寡聚体 和核酸探针(例如寡聚体，例如寡核苷酸)，它们是使用所述亚磷酰胺或在所述新载体上方 便地合成的形式。示例性的固体载体包括至少一种猝灭剂，其通过连接物结合至固体载体。 不同的示例性的实施方案提供了固体载体或用部分官能化的亚磷酰胺，所述部分会稳定化 本发明寡聚体与靶核酸的双链体、三链体或更高阶聚集体(例如，杂交)。固体载体(和寡 聚体)的示例性组分包括使核酸的杂交稳定化的部分，例如，嵌入剂、小沟结合部分、用稳 定化部分(例如，炔基部分和氟代烷基部分)修饰的碱基和构象稳定化部分，例如在共同拥 有的美国专利申请
发明者M·赖特勒, R·M·库克 申请人:生物检索技术股份有限公司