专利名称：一种利用环介导等温扩增技术快速检测伊氏锥虫的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是用于寄生虫病快速检测技术中的一种利用环介 导等温扩增技术快速检测伊氏锥虫的方法。
背景技术：
伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)是一种寄生于脊椎动物造血脏器和血液中的血 鞭毛原虫，虻、吸血蝇是主要的传播媒介，能引起牛、骡、马、羊和犬等家畜严重的伊氏锥虫 病，又称苏拉病，临床主要表现为高热、贫血、黄疸和虫血症、急性者死亡率很高。伊氏锥虫 感染还导致机体严重的免疫抑制，往往引发其他机会性疾病，如炭疽、巴斯德菌属感染。苏 拉病广泛流行于我国江苏、浙江、安徽、云南、贵州、广东、广西、新疆等二十多个省、市、自治 区，动物血清学调查平均阳性率高达5 20 %，有的地方耕牛感染率甚至达64. 47 %，严重 危害家畜健康。最近有报道首例人体感染伊氏锥虫的病例，更应引起广泛的重视。伊氏锥虫感染常用的检测方法包括病原学检查和免疫学诊断，病原学检查主要是 镜检和小鼠接种，存在灵敏度不高的缺点，尤其在慢性感染和低虫血期；免疫学诊断方法中 的抗体检测特异性不高，不能区分现症和既往感染，而抗原的检测虽然特异性较强，但敏感 性不高。为有效控制伊氏锥虫病，需要建立高度敏感、特异和简便的检测技术。聚合酶链反 应(PCR)具有极高的灵敏度和特异性，并已应用于多种寄生虫病的诊断，但PCR需要精密仪 器的配套使用，无法满足基层和现地检测的需求。Notomi T等在2000年开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环媒恒温扩 增法(Loop-MediatedIsothermal Amplification, LAMP),其原理是利用 Bst (Bacillus stearothermophilus)大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内引物(FIP 由FlC和F2组成；BIP由BlC和B2组成)、外引物(F3和B3)，特异地识别靶序列上的6个 独立区域，在等温条件下进行靶序列高效快速扩增。LAMP技术从2003年开始逐步用于医学检测，目前主要是应用于病原微生物的检 测和传染性疾病的诊断，应用环介导等温DNA扩增技术(LAMP)快速检测多种家畜伊氏锥虫 变异表层糖蛋白(VSG)基因目前国内外文献尚无报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于环介导等温DNA扩增技术(LAMP)检测伊氏锥虫高 灵敏度、高特异性的检测方法，使其操作简便、成本低廉，结果易于观察，适用于畜牧饲养场 等对于伊氏锥虫的现场快速检测。本发明是根据环介导等温扩增(LAMP)技术原理，针对伊氏锥虫的特异性片段设 计4条引物，识别靶序列的6个区域，利用BstDNA酶的链置换特性，在等温条件下生成大量 重复的茎环状结构；设计扩增伊氏锥虫变异表层糖蛋白(VSG)基因的4条特异性引物FIP :5’ -ACTGCGGGCAGAATTACCCTGGCCGCAGATAGACACATACG-3’BIP :5’ -CTATGGCGGCGAAGTCGCAGACTTGCTGTTGCCAACCG-3，
F3 :5’ -CGCAGCAAGAGGGTTAGC-3’B3 5' -TTTGTGCCGTCGGCTTTG-3’提取样品DNA后，环介导等温扩增(LAMP)反应体系扩增靶DNA，LAMP检测体系由 一套设计的引物、10XLAMP反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成，并对 LAMP反应条件进行优化，特异性和重复性检验证实该方法可靠性强。本发明四条LAMP引物的伊氏锥虫LAMP检测试剂，还包括LAMP反应液，与四条 LAMP引物共同构成LAMP检测体系，25 μ 1 LAMP检测体系的具体配置为25ul LAMP反应体系的具体配置F3、B30· 1 0· 2μΜ
FIP, BIP1· 2 1· 6μΜ
dNTP1· 4 2. 8mM
Mg2+6 16mM反应缓冲液 IOXThermoPol React ion Buffer链置换DNA 聚合酶 BstDNA polymerase8U甜菜碱betaine1· O 1· 6M本发明所述伊氏锥虫环介导等温扩增检测方法，反应条件为63°C恒温60分钟， 80 0C 5分钟终止反应。由于LAMP的扩增效率非常高，可产生大量的焦磷酸镁，可直接通过肉眼观察是否 有白色的焦磷酸镁沉淀来判断是否生成焦磷酸离子，出现白色沉淀为阳性结果，未出现白 色沉淀为阴性结果。或者通过SYBR Green I染色剂颜色变化来判断靶基因是否存在，反应 后的混合液中加入染色剂SYBR Green-Ι,出现绿色的为阳性结果，橙色的是阴性结果。另一种检测结果的方法是取反应后的混合液2 μ 1，加入0. 5μ 1溴酚蓝上样缓冲 液，在2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压为ΙΟΟν，时间为30min，溴化乙锭(EB)染色后在紫外灯 下观察，出现梯度条带为阳性结果，如未出现则为阴性结果。本发明在定性检测时可不需任何特殊设备。该方法与常规检测方法相比，具有操 作简便快速、敏感特异、无需特殊仪器、检测时间比普通PCR短等特点，适合于伊氏锥虫病 现场防治人员使用。
1、图1是LAMP检测伊氏锥虫的敏感性试验，采用SYBR Green I染色方法检测。1) 是阴性对照，2)是IOOpg模板DNA，3)是IOpg模板DNA，4)是Ipg模板DNA，5)是IOOfg模 板DNA，6)是IOfg模板DNA。从结果可看出，LAMP检测伊氏锥虫的最低检测量是lpg。2、图2是LAMP检测伊氏锥虫的敏感性试验，采用电泳方法检测。1)是DNA标志 物DL2000，2)是阴性对照，3)是IOOpg模板DNA，4)是IOpg模板DNA，5)是Ipg模板DNA， 6)是IOOfg模板DNA，7)是IOfg模板DNA。从结果可看出，LAMP检测伊氏锥虫的最低检测 量是Ipgo3、图3是LAMP检测伊氏锥虫的特异性试验，采用SYBR Green I染色方法检测。1) 是阴性对照，2)是伊氏锥虫DNA样本，3)是疟原虫DNA样本，4)是弓形虫DNA样本，5)是广 州管圆线虫DNA样本。从结果可看出，伊氏锥虫样本显示为阳性，其他样本均为阴性，表明与其他寄生虫无交叉反应。4、图4是LAMP检测伊氏锥虫的特异性试验，釆用电泳方法检测。1)是DNA标志物 DL2000，2)是阴性对照，3)是伊氏锥虫DNA样本，4)是疟原虫DNA样本，5)是弓形虫DNA样 本，6)是广州管圆线虫DNA样本。从结果可看出，伊氏锥虫样本显示为阳性，其他样本均为 阴性，表明与其他寄生虫无交叉反应。
具体实施例方式以下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和 权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。如无特别指明，实验所用的引物由上海生工生物技术有限公司合成；BstDNA聚合 酶(大片段购自New England公司；甜菜碱(Betaine)、Mg2+购自SIGMA公司。实施例一、特异性DNA序列查找从美国基因数据库-GENBANK检索获得伊氏锥虫变异表层糖蛋白(VSG)基因序列， 登录号为EF495337. 1，针对该保守靶序列进行LAMP引物设计，该特异性靶序列为161121824303642485460667278849096
catgcaaacc tgccgccaat gaccaggaac aacgtacact cgaagcaagc caccacggcg cgcaggggcg ttgtgtgggc gtgcggcgaa aagcgccgat caacacctgc aatcgcgacc cgaccagcca tgattattta ggtaccggaa aaccctaaac accgaaaccg
aaggcgctcg gtagctctta gggccaagcc aagttaaaac gcagcaagag aaagacaaaa atttcatcgg aaagccgacg gccaactatg ggcttcacaa ggggtgttta agcaacatca gaacgagcag ggccgaacac ctcacagaag gttgaggaat cccataaccg ttaaaaaaag accgtcaact tacacaatag aacaaagcaa aaatgcgaga aaggatgagg aattctcttc
ttggcgtact aaggcaacgt acggcacggc taaagctctt ggttagcagc gcagggtaat cgctaaaatt gcacaaatgc acacctcggc aactaacagc aagcaataac aggtgcacct aattttccaa acgcagcact aaacccttaa gcgcacgaac
3.3.3.3.3. 3.
aggagataga cgatcgacaa aaaagttaaa gcacaaaagt agccatgcaa
C C 3.3.3.3.3.3.
cttatttgta ctggaagcca gcacttcgca gatttacgcg ggccgcagat tctgcccgca tctaaagcac cgacggtaac cccaggagac cgttgcagcg cggcaacgac cgcacacggc taatttcgga aatcaatctg gactttagca aagcaacaag tggcaaggac aggaacagaa gttgcaacag aaaagaagta tactgaaaca ggttgtcgaa agaagaaaag
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gcacaacgga tcgcggcagc atagcgtcga gcagcaccac gagcagcggc gcggcgaagt acagcaagtt acgcgctagg agggcgacat atgtaggaag gcgggatcaa gcaaagttga cacaccacac aaatggagaa ccgcaacggc caacagaacc tcaaggagtt caaagaaagt tttacacagc aagcagaatc gcgaaaaaaa ctaaaaagtg
3.3.3. C 3.3.3. C 3.C
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二、引物的设计LAMP方法中的引物设计是LAMP法实现扩增的关键所在，应用PrimerExplorerV3 软件设计引物。LAMP扩增的靶序列长度控制在300bp以下，LAMP最少需要4条引物，分别 是正向内引物FIP，由F2区段(与靶基因F2c区段完全互补)和Flc区段(同靶基因3’末 端的Flc序列相同)组成；正向外引物F3(与靶基因F3c区段完全互补)；反向内引物BIP， 由B2区段(与靶基因3’末端的B2c区段完全互补)和Blc区段(同靶基因3’末端Blc 序列完全相同)组成；反向外引物B3(与靶基因B3c区段完全互补)。各区段的设计规则 与PCR相同。内引物长度通常超过40个碱基，外引物为20个碱基左右。除了引物的长度、 碱基组成外，需要考虑引物与靶序列的环状结构等。三、LAMP1、伊氏锥虫基因组DNA提取实验室建立伊氏锥虫的动物感染模型。使用Takara 公司的基因组提取试剂盒提取伊氏锥虫的基因组DNA，分光光度分析A260/A280 > 1. 8，为 检测体系提供模板，-80°C冰箱中储存备用。2、LAMP反应的条件反应体系包括引物FTP、BIP、F3、B3 ；dNTP、Mg2+、链置换型DNA聚合酶(BstDNA polymerase)、Betaine、核酸模板，终体积25 μ 1。LAMP反应在60 65°C恒温条件下进行。 最佳反应条件因引物的效率和模板DNA质量变化而不同，因此通过比较试验确定最佳反应 时间、反应温度和试剂浓度。每个反应设立阴性与阳性对照。3、反应的敏感性、特异性分析将伊氏锥虫基因组DNA梯度稀释后进行LAMP检测，由最低DNA检出量分析反应的 敏感性，由图1，图2可知，LAMP方法的最低检测量为Ipg ；以疟原虫、弓形虫、广州管圆线虫、伊氏锥虫等四种寄生虫核酸为模板检测体系的 特异性。LAMP检测体系的特异性良好，与疟原虫、弓形虫、广州管圆线虫DNA没有交叉反应， 可以特异性地检测伊氏锥虫，参见图3，图4。4、LAMP反应的鉴定分析(1)直接观察LAMP反应中核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应 溶液中的Mg2+结合，产生副产物-焦磷酸镁白色沉淀。它有极高的特异性，可以用肉眼观察 或浊度仪检测反应管中的沉淀浊度判断扩增与否。(2)显色反应直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Green-I，无扩增反应的管子呈 橙色，有扩增反应的管子将变为绿色。(3)琼脂糖凝胶电泳取反应后的混合液 1，加入0. 5μ 1溴酚蓝上样缓冲液，在 2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压为ΙΟΟν，时间为30min。EB染色剂染色后在紫外灯下观察。 LAMP反应会产生各种片断长度的茎环结构的扩增产物，因此在电泳图谱中显示为从点样孔 处开始的拖尾条带现象。5、根据优化结果，确定了最佳的LAMP检测体系，在实际操作中可以存在一定的浮 动范围，具体如下F3、B30. 1 ~ 0. 2 μ MFIP、BIP1·2 1·6μΜdNTP1· 4 2. 8mM
Mg2+6 16mM反应缓冲液 IOXThermoPol Reaction Buffer链置换DNA 聚合酶 BstDNA polymerase 8U甜菜碱betaine1. O 1. 6M 权利要求
一种伊氏锥虫环介导等温扩增检测方法，其特征在于根据恒温核酸扩增方法的技术原理，针对伊氏锥虫的特异性片段设计4条引物，识别靶序列的6个区域，利用BstDNA酶的链置换特性，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构；设计扩增伊氏锥虫变异表层糖蛋白(VSG)基因的4条特异性引物为FIP5’ ACTGCGGGCAGAATTACCCTGGCCGCAGATAGACACATACG 3’BIP5’ CTATGGCGGCGAAGTCGCAGACTTGCTGTTGCCAACCG 3’F35’ CGCAGCAAGAGGGTTAGC 3’B35’ TTTGTGCCGTCGGCTTTG 3’提取样品DNA后，环介导等温扩增(LAMP)反应体系扩增靶DNA，环介导等温扩增(LAMP)检测体系由一套设计的引物、10×LAMP反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成，并对LAMP反应条件进行优化。
2.根据权利要求1所述的伊氏锥虫环介导等温扩增检测方法，其特征在于四条LAMP引 物的伊氏锥虫LAMP检测试剂，还包括LAMP反应液，与四条LAMP引物共同构成LAMP检测体 系，25 μ 1 LAMP检测体系的具体配置为F3、B30· 1 0· 2μΜFIP, BIP1· 2 1· 6μΜdNTP1· 4 2. 8mMMg2+6 16mM反应缓冲液 IOXThermoPol Reaction Buffer链置换 DNA 聚合酶 BstDNA pol ymerase8U甜菜碱 betai ne1. O 1. 6M
3.根据权利要求2所述的伊氏锥虫环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述试剂 的检测反应条件为63°C恒温60分钟，80°C 5分钟终止反应。
4 根据权利要求3所述的伊氏锥虫环介导等温扩增检测方法，其特征在于，扩增结果 的检测可以直接观察反应混合液中是否出现白色沉淀，出现白色沉淀为阳性结果，未出现 白色沉淀为阴性结果。
5 根据权利要求4所述的伊氏锥虫环介导等温扩增检测方法，其特征在于，反应后的 混合液中加入染色剂SYBR Green-Ι,出现绿色的为阳性结果，橙色的是阴性结果。
6.根据权利要求4所述的伊氏锥虫环介导等温扩增检测方法，其特征在于，另一种检 测结果的方法是取反应后的混合液2 μ 1，加入0. 5μ 1溴酚蓝上样缓冲液，在2%的琼脂糖 凝胶中电泳，电压为100伏，时间为30分钟，溴化乙锭(EB)染色剂染色后在紫外灯下观察， 出现梯度条带为阳性结果，如未出现则为阴性结果。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域中寄生虫病的快速检测技术，公开一种伊氏锥虫的环介导等温扩增(LAMP)检测方法。该方法包括两对用于检测伊氏锥虫的环介导等温扩增引物FIP、BIP、F3与B3，和一种利用上述两对引物检测伊氏锥虫的LAMP方法，其中包括反应模板的制备、LAMP反应体系、LAMP反应程序和检测结果判断。其操作简便、成本低廉，结果易于观察，非常适用于畜牧饲养场等对于伊氏锥虫的现场快速检测。
文档编号C12Q1/04GK101892313SQ20101020223
公开日2010年11月24日 申请日期2010年6月13日 优先权日2010年6月13日
发明者卓敏敏, 楼涤, 童群波, 陆绍红, 陈睿 申请人:浙江省医学科学院