专利名称：：抗菌肽的制作方法抗菌肽本发明涉及新型抗菌肽和肽衍生物，特别涉及在医学中应用的新型抗菌肽和肽衍生物。此外，本发明涉及用于杀死微生物如细菌或真菌的组合物和方法，以及治疗微生物感染的方法。本发明还涉及用于药物筛选分析的方法。尽管抗生素治疗进步显著，但严重细菌和真菌感染的发生率不断增加。每年美国有超过四千万住院患者，并且约两百万患者获得医院内感染，其中50%-60%与抗生素抗性细菌[1]有关。在美国与医院感染相关的死亡数目估计为每年60，000-70，000，并且在德国高达10，000[2]。然而在20世纪70年代耐药革兰氏阴性菌是主要问题，过去十年，与多药耐药革兰氏阳性致病菌相关的发病数不断增加[3]。目前，迅速出现的抗性菌株涉及革兰氏阳性和革兰氏阴性病原体[4]。抗性(resistance)首先在其中单突变足以引起临床上重要级别的菌种中形成，例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)，随后在其中需要多突变的细菌中形成，例如大肠杆菌(E.coli)和淋球菌(Neisseriagonorrhoeae)。这主要归因于氟喹诺酮(fluoroquinolones)的广泛使用[5]。革兰氏阴性抗性的重要原因包括大肠杆菌(Escherichiacoli)和肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)中的超广谱内酰胺酶[6]。几乎一半的软下疳致病原杜克雷嗜血杆菌(Haemophilusducreyi)的临床菌株携带提供对羟氨苄青霉素、氨苄青霉素和一系列其它内酰胺的抗性的基因[7]。同样地，对于鼠伤寒沙门氏杆菌(SalmonellaentericaserovarTyphimurium)，其对四环素的抗性已经从1948年的零水平增加到1998年的98%水平[8]。这使继续寻找新型抗生素成为必要。诱导型抗菌肽代表汇集现代生物化学、免疫学和药物设计的研究领域。已经从植物、动物和微生物中分离出大小为13至超过100个氨基酸残基的肽类抗生素[9]。单一动物产生约6-10种肽类抗生素，每种肽通常显示完全不同的活性谱[10]。可以充分确定的是绝大多数的抗菌肽，包括已充分研究的防御素、杀菌肽(cecropin)和蛙皮素，通过“裂解/离子载体”机制起作用。所有“细胞溶解酶”肽的共同主题是对细菌细胞质膜有透化效果[11，12，13]。能够在脂双层中形成亲水离子(质子)通道的阳离子、两性分子结构对该活性很重要；质子漏引起许多必要生命过程所需膜电位的耗散，因此引起细胞死亡。由于这些肽对膜的扰动不依赖于手性分子的识别，因此不破坏总体两性分子结构或基本净电荷的氨基酸取代在功能上耐受[14，15]。直接作用于细菌膜的肽通常在较高浓度下也对哺乳动物膜产生毒性效应，这限制了它们作为未来药物的潜力。当将脯氨酸插入α-螺旋型抗微生物肽的序列中时，肽类通透大肠杆菌细胞质膜的能力随着掺入的脯氨酸残基数目而大大降低。在这点上，令人感兴趣的是某些至少对所选择的革兰氏阴性病原体具有最大活性的天然抗菌肽属于富含脯氨酸的肽家族[16]。这样的副作用可以通过其它靶向特定细菌蛋白的抗微生物肽或其它不与哺乳动物类似物交叉反应的胞内或胞外化合物克服。这看起来对于最初从昆虫类分离的富含脯氨酸的抗微生物肽包括apidaecin而言是真实的。随着大小和生物化学性质的巨大变化，结构_活性关系和构象_活性关系成为抗菌肽研究的焦点并不令人感到惊讶。将天然抗菌肽库完全调整到它们的生物学效能不仅在普通生物化学领域很重要，而且正受到制药工业的关注。尽管基于肽的抗生素的体外试验存在问题，但一些天然阳离子抗菌肽已经进入了临床试验阶段[17]。而这些抗菌肽中的某些在早期临床试验中已经显示出了作为局部试剂的功效迹象，其它在全身治疗时显示出活性。例如，阳离子蛋白rBPI21目前已经完成了用于脑膜炎球菌血症(meningococcaemia)的肠胃外用途的III期临床试验[17]。最初从蜜蜂中分离的apidaecin属于富含脯氨酸的抗微生物肽家族，并显示类似于红蝽抗菌肽(pyrrhocoricin)、果蝇肽(drosocin)和formaecin的序列(表1)[18]。apidaecin是仅包含具有高度保守的PRPPHPRI/LC-末端的未修饰L-氨基酸和较高含量脯氨酸(33%)的18-20个残基长度的肽。使用常规Fmoc/tBu策略，能够容易地将它们进行固相合成。该肽以纳摩尔剂量抑制多种革兰氏阴性细菌的存活，而革兰氏阳性菌不受影响。致死活性几乎是即时的并且显示与常规的“裂解”机理无关[19]。另外，apidaecin-抗性突变体对“成孔”肽的敏感性未减少，并且D-对映异构体缺乏抗菌活性。当前模型是apidaecin对细菌的拮抗效应涉及手性靶标的立体选择性识别[19]。包括作为该家族成员的apidaecin在内的富含脯氨酸的抗微生物肽不仅通过通透细菌膜杀死细菌，而且立体特异性地与未被apidaecin识别的靶蛋白结合，并最终导致细胞死亡。此外，与具有规定二级结构的AMP如蜂毒肽(mellitin)或短杆菌肽S(gramdicidinS)形成显明对比，富含脯氨酸的肽看起来在体外对真核细胞无毒并且不溶血。在哺乳动物血清中，apidaecin由于在N-和C-末端切割而在一小时内完全降解，所述切割可以由氨基-和羧肽酶切割、内切蛋白酶切割或所有上述切割引起。前述代谢物失去抗微生物活性，MIC值通常高于125μg/mL。表1来自apidaecinIa或Ib(西方蜜蜂(Apismellifera))[1幻、果蝇肽(黑腹果妮(Drosphilamelanogaster))[20]、formaecin1(公牛虫义(Myrmeciagulosa))[21]禾口红蝽抗菌肽(无翅红蝽(Pyrrhocorisapterus))[22]的序列的比较。SEQIDNo.肽序歹Ij~IapidaecinlaGNNRPVYIPQPRPPHPRI~~2apidaecinlbGNNRPVYIPQPRPPHPRL~161果蝇肽GKPRPYSPRPTSHPRPIRV~162Formaecin1GRPNPVNNKPTPYPHL~163红蝽抗菌肽VDKGSYLPRPTPPRPIYNRN仍然需要新型抗细菌和抗真菌化合物、新型抗细菌和抗真菌药物组合物、其使用方法、以及能够用于药物筛选分析以检测新药物抗生素的新型化合物。本发明的一个目的是提供新型抗菌肽，其优选具有增加的稳定性。本发明的另一目的是提供用于药物筛选分析的方法。所述第一个目的通过本发明的肽或肽衍生物实现，所述肽或肽衍生物具有至少16个残基并具有以下通式Sub1-X1-N-X2-X3-P-V-Y-I-P-X4-X5-R-P-P-H-P-Sub2(通式1)其中X1为中性残基或在生理条件下具有净正电荷或带正电荷侧链的部分，其在用Sub1修饰后仍然带正电荷。优选的残基X1优选选自中性残基(例如顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、顺式-3-羟脯氨酸、反式-3-羟脯氨酸、瓜氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基甘氨酸、二羟基苯丙氨酸、N-乙基天冬酰胺、N-乙基甘氨酸、高丝氨酸、青霉胺、四氢吡喃基甘氨酸、别苏氨酸、3，5-二硝基酪氨酸)或带正电荷的残基，包括精氨酸、δ-羟赖氨酸、高精氨酸、β“高精氨酸、D-精氨酸、甲基精氨酸(优选α-N-甲基精氨酸)、硝基精氨酸(优选N(G)-硝基精氨酸)、亚硝基精氨酸(优选N(G)-亚硝基精氨酸)、精氨醛(精氨酸中的-COOH被-CHO取代)、胍基丙酸、2，4-二氨基丁酸、β-高精氨酸、ε-N-甲基赖氨酸、别羟赖氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，2’-二氨基庚二酸、赖氨酸、鸟氨酸、对称-二甲基精氨酸、不对称-二甲基精氨酸、2，6_二氨基己炔酸、组氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、对氨基苯甲酸，和3-氨基-酪氨酸；X2为具有极性侧链的残基(例如天冬酰胺、丝氨酸、瓜氨酸或谷氨酰胺)或在生理条件下具有净正电荷或带正电荷侧链的部分(例如赖氨酸或精氨酸、鸟氨酸或高精氨酸)。优选的残基X2选自包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、瓜氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、顺式-3-羟脯氨酸、反式-3-羟脯氨酸、瓜氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基甘氨酸、二羟基苯丙氨酸、N-乙基天冬酰胺、N-乙基甘氨酸、高丝氨酸、青霉胺、四氢吡喃基甘氨酸、别苏氨酸、3，5_二硝基酪氨酸以及精氨酸、赖氨酸、δ-羟赖氨酸、高精氨酸、2，4_二氨基丁酸、高精氨酸、β_高精氨酸、D-精氨酸、甲基精氨酸(优选α-N-甲基精氨酸)、硝基精氨酸(优选N(G)-硝基精氨酸)、亚硝基精氨酸(优选N(G)-亚硝基精氨酸)、精氨醛、胍基丙酸、ε-N-甲基赖氨酸、别羟赖氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，2’-二氨基庚二酸、鸟氨酸、对称-二甲基精氨酸、不对称_二甲基精氨酸、2，6-二氨基己炔酸、组氨酸、1-甲基-组氨酸、3-甲基-组氨酸、对氨基苯甲酸，和3-氨基-酪氨酸的组；X3为在生理条件下具有净正电荷或带正电荷侧链的部分。优选的残基X3选自包括精氨酸、赖氨酸、S“羟赖氨酸、高精氨酸、2，4_二氨基丁酸、高精氨酸、β-高精氨酸、D-精氨酸、甲基精氨酸(优选α-N-甲基精氨酸)、硝基精氨酸(优选N(G)-硝基精氨酸)、亚硝基精氨酸(优选N(G)-亚硝基精氨酸)、精氨醛、胍基丙酸、ε-N-甲基赖氨酸、别羟赖氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，2’-二氨基庚二酸、鸟氨酸、对称-二甲基精氨酸、不对称-二甲基精氨酸、2，6_二氨基己炔酸、组氨酸、1-甲基-组氨酸、对氨基苯甲酸、3-甲基-组氨酸，和3-氨基-酪氨酸的组；X4为具有极性侧链的中性残基，例如天冬酰胺或瓜氨酸，或在生理条件下具有净正电荷或带正电荷侧链的部分。优选的残基X4选自包括天冬酰胺、高谷氨酰胺、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、顺式-3-羟脯氨酸、反式-3-羟脯氨酸、瓜氨酸、N-甲基丝氨酸、N-甲基甘氨酸、二羟基苯丙氨酸、N-乙基天冬酰胺、N-乙基甘氨酸、高丝氨酸、青霉胺、四氢吡喃基甘氨酸、别苏氨酸和3，5-二硝基酪氨酸以及精氨酸、赖氨酸、δ-羟赖氨酸、高精氨酸、2，4-二氨基丁酸、β-高精氨酸、D-精氨酸、甲基精氨酸(优选α-N-甲基精氨酸)、硝基精氨酸(优选N(G)-硝基精氨酸)、亚硝基精氨酸(优选N(G)-亚硝基精氨酸)、精氨醛、胍基丙酸、a-N-甲基赖氨酸、别羟赖氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，2’-二氨基庚二酸、鸟氨酸、对称_二甲基精氨酸、不对称-二甲基精氨酸、2，6_二氨基己炔酸、组氨酸、对氨基苯甲酸、1-甲基_组氨酸、3-甲基-组氨酸，和3-氨基-酪氨酸的组；X5为脯氨酸或脯氨酸衍生物，如顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、顺式-3-羟脯氨酸、反式-3-羟脯氨酸、β-环己基丙氨酸、3，4_顺式-甲醇基脯氨酸、3，4_脱氢脯氨酸、高脯氨酸或假脯氨酸；中性残基被定义为在生理条件下具有不带电荷侧链的氨基酸残基。生理条件被定义为pH7.4、37°C且渗透压为300毫渗摩/kg。极性侧链被定义为带有至少一个能够与其它极性基团形成氢键的极性基团(例如羟基、氨基、酰胺或巯基)的侧链。脯氨酸衍生物为包含被取代或未被取代吡咯烷环的衍生自脯氨酸的结构。在生理条件下具有净正电荷或带正电荷侧链的部分为碱性氨基酸残基。疏水部分为在脂肪族或芳香族氨基酸侧链上不带极性基团的中性残基，优选比丙氨酸更疏水。Sub1为氨基酸X1的自由N-末端氨基或N-末端氨基的修饰(以Sub1取代氨基酸X1序列的N-末端氨基)，具有通式NR1RySub1=NR1R2，而R1和R2彼此独立，优选地选自氢或以下基团(i)直链、支链、环状或杂环烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、环己基；(ii)直链、支链、环状或杂环烃酰基，例如乙酰基或甲酰氧基(甲酰基)、丙酰基、正丁酰基、异丁酰基、戊酰基、己酰基，或环己酰基；(iii)报道基团，例如荧光染料(例如荧光素，Alexa488)或生物素；(iv)与COR3(见下文)一起、使其N-和C-末端桥联以获得环肽的连接子，例如基于胍、乙二醇寡聚体、2，4_二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸、2，2’-二氨基庚二酸、锁链素(desmosin)或异锁链素(isodesmosine)。Sub2为C-端氨基酸的自由C-末端羧基或C-末端羧基的修饰，优选具有通式COR3(R3取代末端氨基酸的羟基)X6-COR3或X7-COR3或X6X7-COR3。优选地，COR3选自⑴羧基(R3为自由羟基)、酯(R3为烃氧基)、酰胺(R3为胺)或酰亚胺；(ii)与Sub1—起、使其N-和C-末端桥联以获得环肽的连接子；(iii)具有R3的COR3,R3为选自Pro、Ile、Leu、Arg、Val的另外氨基酸残基或者R3为优选具有包含至少一个选自Pro、Ile、Leu、Arg、Val的氨基酸的两个或三个氨基酸的肽，所述选自Pro、lie、Leu、Arg、Val的氨基酸由以下基团取代羧基(R3为自由羟基)、酯(R3为醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇)、酰胺(R3为胺)或酰亚胺(R3为烃基胺或二烃基胺，例如甲基胺、乙基胺、二甲胺或环己基胺)。(iv)具有R3的C0R3，R3为形成二聚结构或寡聚结构的其它支链氨基酸，例如赖氨酸、羟赖氨酸、鸟氨酸、2，4_二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸、2，2’-二氨基庚二酸、锁链素、异锁链素或这些支链氨基酸的组合。因此，C-末端肽衍生物能够特别地形成酯(R3=烃氧基)、酰胺(R3=酰胺)、酰亚胺或由选自Pro、lie、Arg、Val的额外氨基酸延伸的肽，所述氨基酸在C-末端再被修饰为酯、酰胺或酰亚胺。此外，能够通过在肽的N-末端或C-末端修饰而形成另外的肽衍生物。例如，这些变化能够是经由永久性键合或能够在某些条件下切割的连接(例如二硫桥键或酸不稳定连接基团)的烃基或烃酰基(具有直链或者为支链或环状或杂环状)或胍基的加成、或者大分子或报道部分的加成，。形成本发明肽或肽衍生物的所有天然氨基酸、非天然氨基酸或氨基酸衍生物(如亚氨基酸)能够为L-构型或者D-构型。然而，如果没有另外指明，序列中的氨基酸构件优选为L-构型。X6和X7为任选的另外残基。因此，在X6和X7不存在的情况下，在上述序列中最后一个脯氨酸(P)具有自由C-末端羧基或与Sub2连接。因此，在残基X6和X7中至少一个存在的情况下，肽具有例如以下通式之一Sub1-X1-N-X2-X3-P-V-Y-I-P-X4-X5-R-P-P-H-P-X6-X7-COR3(通式2)Sub1-X1-N-X2-X3-P-V-Y-I-P-X4-X5-R-P-P-H-P-X6-COR3(通式3)Sub1-X1-N-X2-X3-P-V-Y-I-P-X4-X5-R-P-P-H-P-X7-COR3(通式4)X6选自脯氨酸或脯氨酸衍生物或在生理条件下具有净正电荷或带正电荷侧链的部分。优选的残基&选自包括脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、顺式-3-羟脯氨酸、反式-3-羟脯氨酸、β_环己基丙氨酸、3，4_顺式-甲醇基脯氨酸(methanoproline)、3，4_脱氢脯氨酸、高脯氨酸、假脯氨酸以及精氨酸，优选D-精氨酸、δ-羟赖氨酸、高精氨酸、2，4_二氨基丁酸、β-高精氨酸、ε-N-甲基赖氨酸、别羟赖氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，2’-二氨基庚二酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、甲基精氨酸(优选α-N-甲基精氨酸)、硝基精氨酸(优选N(G)-硝基精氨酸)、亚硝基精氨酸(优选N(G)-亚硝基精氨酸)、精氨醛、胍基丙酸、对称_二甲基精氨酸、不对称-二甲基精氨酸、2，6_二氨基己炔酸、组氨酸、1-甲基_组氨酸、3-甲基-组氨酸、或3-氨基-酪氨酸的组。Χ7选自脯氨酸或脯氨酸衍生物、极性部分(例如丝氨酸)或疏水部分。优选的残基Χ7选自包括如下的组脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、顺式-3-羟脯氨酸、反式-3-羟脯氨酸、β-环己基丙氨酸、3，4-顺式-甲醇基脯氨酸、3，4-脱氢脯氨酸、高脯氨酸或假脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、S-羟赖氨酸、瓜氨酸、高丝氨酸，或别苏氨酸以及苯丙氨酸、N-甲基-亮氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、叔丁基甘氨酸、环己基丙氨酸、丙氨酸、β“丙氨酸、1-氨基_环己基碳酸、N-甲基-异亮氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、N-甲基缬氨酸、或优选具有一至三个残基，优选脯氨酸、异亮氨酸或任何上述部分的短肽序列，或包含几个肽单位的支链连接子，所述肽单位诸如赖氨酸、羟赖氨酸、鸟氨酸、2，4_二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸、2，2’-二氨基庚二酸、锁链素、异锁链素，C-末端氨基酸为例如通式1中的最后一个脯氨酸⑵、Χ6(在通式3中)或X7(在通式2和4中)。其中OH代表C-末端的自由羧基(Sub1=NH2且Sub2=RI-OH或RL-OH,R3=-0Η)的具有根据SEQIDNo.1(GNNRPVYIPQPRPPHPRI-OH)禾口SEQIDNo.2(GNNRPVYIPQPRPPHPRL-OH)的未修饰的apidaecinIa和Ib的天然序列不在本发明的范围内。本发明的肽或肽衍生物与天然存在的apidaecin肽相比具有至少一种以下优势(i)由于较高的蛋白酶抗性而在哺乳动物血清中的半衰期延长，以及(ii)对一种或几种细菌菌株，特别是人病原体，或者真菌或其它微生物感染的抗微生物活性增强，以及(iii)肽对包括红细胞在内的人细胞无毒。本发明肽和肽衍生物的实例具有根据SEQIDNo.3-121以及122-159的序列(见实施例1中的表2)。次优选的是根据SEQIDNo.92、141和142的肽和肽衍生物(见实施例1中的表2)。本发明的肽和/或多聚体肽构建体的特征在于高的抗细菌和/或抗真菌效能以及在哺乳动物血清中良好的代谢稳定性，所述肽和/或多聚体肽构建体被修饰以提高抗微生物或抗真菌活性并将活性谱扩展到其它细菌或真菌以及改善对蛋白酶和肽酶的稳定性。在位置3(X2),4(X3)和IO(X4)处的适当修饰提高野生型apidaecin序列对不同细菌的抗细菌活性，如下文所讨论的并在实施例中示出。假定第一位置(Sub1J1J2和X3)负责更好地穿过膜转运入细胞内，而位置IO(X4)还可以有助于抑制细胞内靶向。此外，残基X2能够进一步稳定N-末端肽序列不受降解，并由此延长在血清中的半衰期。本发明的优选实例为具有带正电荷残基X4(位置10)的序列，如选自SEQIDNo.9-18、20-25、27-31、34-40、45-49、55-56、64-69、81-83、86-91、97-100、102-104、112、113、117、119、122-128、131、134、137、138、145-147和150-159的序列。次优选的是在X4(位置10)处具有谷氨酰胺(Q)的序列。本发明的优选实例为具有带正电荷残基作为X3(位置4)的序列，如选自SEQIDNo.10、68、95、97、100、122-131、134、137和155的序列。此外，自由N-末端氨基和C-末端羧基优选被修饰，因为这些末端在血清、全身体液、组织、器官或细胞中易于被肽酶和蛋白酶降解，并且这些末端看起来对肽、肽衍生物及其多聚体的抗菌活性非常关键。增强蛋白酶抗性可增加肽在血清中的半衰期。另外，末端的修饰还能够使肽与诸如其它氨基酸序列的其它部分偶联(由此可能产生多聚体肽或蛋白质)，或者与其它能够起到载体或标记作用的生物分子偶联。在具体实施方案中，载体分子还起到靶向分子的作用，能够定位细菌感染并能够与细菌结合以便携带(细菌)细胞附近的抗菌化合物以侵袭或甚至将其转运穿过细菌膜进入细菌细胞内。这样的靶向部分能够是已知结合脂多糖(LPS)分子的分子，所述脂多糖(LPS)分子形成革兰氏阴性菌的外部。例如，用于该用途的已知化合物为锚定肽(anchorp印tide)，诸如乳酸杆菌的AcmA基序，或针对脂多糖的抗体。后者是优选的，因为它们还具有内在抗菌效应并因此能够用于增强本发明肽的作用。作为N-末端氨基酸即Sub1-X1，在生理环境下即在(人)体内具有带正电荷的部分是非常有利的。因此生理环境意指PH为约6-8并且温度为约30°C-40°C。在肽或肽-衍生物的Sub1或&中，该正电荷很可能为抗细菌功能所需。实现N-末端对蛋白水解切割稳定的一个实例为酰化(Sub1=酰基-NH-)，如带正电荷氨基酸如鸟氨酸或赖氨酸(Sub1-X1=酰基-Orn或酰基-Lys)的α-氨基的乙酰化(Sub1=乙酰基-ΝΗ-)。该酰化(优选乙酰化)将正电荷完整地保留在氨基酸侧链上。实现N-末端对蛋白水解切割稳定的另一实例为胍基化(优选Sub1=N(CH3)2-(C-N+(CH3)2)NH-),这同时在位置1处引入带正电荷基团。本发明的更优选实例为具有带正电荷残基作为X1和X4(位置1和10)的序列，如选自SEQIDNo.12和13、16、18、21-24、27-30、35-40、64、65、66、81-83、86_88、112、113、117、119、124-128、131、134-137的序列。本发明的其它优选实例为具有脯氨酸、脯氨酸衍生物或带正电荷残基作为X6(位置17)的序列，如选自SEQIDNo.10、23、24、27、28、70、109-113、121、127、128、131-134、136、138、139、145、146和148-155的序列。本发明的其它优选实例为具有脯氨酸、脯氨酸衍生物、极性部分或疏水部分作为X7(位置18)的序列，如选自SEQIDNo.10、24、27-37、42、44、46、47、68-77、83、93、94、96、107-110,114,115和126,144的序列。非常优选的实例为在位置I(X1)或IO(X4)处具有正电荷氨基酸(如鸟氨酸、精氨酸或赖氨酸)和修饰的C-末端的肽，特别是SEQIDNo.7-8、11-13、20、21、22、25、38-40、45、65-67、131、134-137的肽。最优选的肽在位置1(残基X1)处包含鸟氨酸，在位置10(残基X4)处包含精氨酸，在位置11(残基X5)处包含脯氨酸或羟脯氨酸，在位置17(Sub2中的残基X6)处包含精氨酸或其衍生物(如鸟氨酸、高精氨酸)，以及乙酰化或胍基化N-末端，例如SEQIDNo.40,88,131、134-137。由实施例能够看出，将C-末端小修饰为酰胺(Sub2=-NH2)已经显著地改善了对大肠杆菌和伤寒沙门菌的抑制效应。具有酰胺作为C-末端的优选序列为SEQIDNo.4,6,7、8、14、20、38、39和134。还优选在位置17(X6)和/或18(X7)和/或C-末端(Sub2)处的修饰，例如甲基、丙基、酰胺和脯氨酸，以减少C-末端降解。由实验结果能够发现在位置17和18处的氨基酸显然对抗菌作用也非常关键，因为在这些位置处以丙氨酸置换单个氨基酸破坏了野生型apidaecin抗菌活性的功效。本发明最优选的实例为满足以下所有优势的肽(i)由于较高的蛋白酶抗性而在哺乳动物血清中的半衰期延长，以及(ii)对一种或几种细菌菌株，特别是人病原体，或者真菌或其它微生物感染的抗微生物活性增强，以及(iii)肽对包括红细胞在内的人细胞无毒。抗微生物肽的作用非常复杂，因为它们必须穿透细菌细胞膜并进入细胞质以特异性抑制细胞内细菌靶标而不对哺乳动物细胞和血细胞产生毒性。要解决的另一重要问题是肽或肽衍生物对肽酶或蛋白酶降解的稳定性。因此，理想的肽具有高的抗细菌活性(低MIC值)、无细胞毒性、无溶血活性、和几小时的血液中半衰期。本发明所述的最佳肽衍生物具有超出天然apidaecin序列十倍的增加的抗微生物活性。这通过C-末端的酰胺化和通过在在位置IO(X4)处以碱性残基、最优选为精氨酸或鸟氨酸置换Gln而部分实现。当这些肽在血清中的半衰期较短时，优选对N-末端进行修饰(甲酰化、乙酰化、胍基化)以减少通过氨基肽酶或氨基蛋白酶的降解。在N-末端优选为正电荷以实现良好的抗细菌活性。天然apidaecin序列的位置I(X1)处的甘氨酸优选由如精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸的碱性残基取代，最优选由鸟氨酸取代，因为鸟氨酸的C-末端肽键不被胰蛋白酶和相关酶切割。出于同样的原因，天然apidaecin序列的Arg-17(X6)优选被取代以减少内切蛋白酶对Arg-17(X6)^PLeu/IIe-IS(X7)之间肽键的切割。实例为用鸟氨酸取代Arg-17(X6)或Leu-IS(X7)的N-甲基化，这两者均使血清稳定性增强超过24倍，使半衰期从15min延长至超过360min。尽管没有肽对C0S-7细胞系或血红细胞产生毒性，但用反式-4-Hyp取代Pro-Il(X5)可能进一步降低可能的位点效应，因为极性取代降低肽或肽衍生物与哺乳动物细胞膜结合的倾向但不降低抗细菌活性。有利地，本发明的肽或肽衍生物不诱导抗性或诱导低于野生型肽的抗性。有利地，本发明的多种肽或肽衍生物显示出扩展的抗微生物活性谱，显示出抗如枯草杆菌(Baccilussubtilis)和母牛分枝杆菌(Mycobacteriumvaccae)的细菌的活性，这在天然野生型apidaecin肽中未观察到。这些具有抗枯草杆菌活性的序列的共同特征为带正电荷的N-末端。这些具有抗母牛分枝杆菌活性的序列的共同特征为带正电荷的N-末端、带电荷残基(优选精氨酸或鸟氨酸)作为X4(位置10)和带电荷残基(优选鸟氨酸)作为X1(位置1)。这些优选序列的实例选自SEQIDNo.65、83、131和155。本文使用的术语“肽”意指通过肽键偶联的氨基酸的序列，其中所述氨基酸优选构成肽的二十个天然氨基酸之一，并且其中所述氨基酸能够为L-构型或D-构型，或者为D-别构型(仅在一个手性中心反转)的异亮氨酸和苏氨酸。本发明的术语肽衍生物(或肽模拟物)不仅包括例如在N-或C-末端通过上述基团Sub1和Sub2修饰的肽，还包括通过以非天然构成蛋白的氨基酸残基的化学部分如非蛋白原α-氨基酸、β-氨基酸取代和/或修饰一个或多个氨基酸残基而改变的肽，或具有改变的主链的肽。改变的主链意味着至少一个肽键已经由例如不可切割的键如被还原的酰胺键、烃基化酰胺键或硫代酰胺键取代。能够与前述氨基酸残基的COOH-基团以及以下氨基酸残基的NH2-基团形成共价键的部分也包括在内，因此所述部分不一定需要保持肽主链结构，例如糖氨基酸二肽电子等排体、氮杂肽、6_均聚物、y_肽、Y-内酰胺类似物、低聚(苯撑乙烯)、乙烯磺酰肽、聚-N-取代甘氨酸，或低聚氨基甲酸酯。这些修饰优选在易于酶降解的位置进行，特别是在三个N-末端残基(位置1至3，-X1-N-X2)和二个C-末端残基(在位置16后，-X6-X7)。因此，优选地，X1-N(例如，Gly-Asn)、N-X2(例如，Asn-Asn)、X2-X3(例如，Asn-Arg)、X6-X7(例如，Arg-Leu或Arg-Ile)之间的至少一个键为不可切割的键。该不可切割的键被定义为对蛋白酶切割不敏感的键并优选选自还原的酰胺键、烃基化酰胺键或硫代酰胺键。还原的酰胺键为其中羰基部分(C=0)被还原为羟基部分(HCOH)或亚甲基部分(CH2)的肽键。烃化酰胺键为其中氮(N-α)或碳(C-α)被优选具有1至3个C-原子的烃基取代的肽键，优选实例为N-甲基化。本发明的肽或肽衍生物能够为直链，即其中序列的第一个和最后一个氨基酸分别具有自由NH2-和COOH-基团或分别以Sub1和Sub2修饰，或者它们可以为环状，即当第一个和最后一个氨基酸通过肽键或连接子偶联时。本发明另一目的是制备上述新型抗菌化合物的方法。本发明的肽或肽衍生物能够通过常规方法合成制备或适用时重组制备。apidaecin衍生的抗菌肽或肽衍生物的具体实例在以下实验部分详细公开。优选地，本发明的肽或肽衍生物通过已知的化学合成技术常规制备，例如诸如Merrifield所公开的技术[23]。可选择地，通过在宿主微生物或细胞内克隆并表达携带编码上述肽之一的核酸序列的DNA片断，本发明的肽可以通过重组DNA技术制备。。核酸编码序列能够通过合成制备[24]，或者可以通过定点诱变衍生自现有核酸序列(例如编码野生型apidaecin的序列)。由此制备的编码序列能够通过已知技术使用聚合酶链反应(PCR)中对应设计的引物由RNA(或DNA)扩增。例如通过琼脂糖凝胶电泳纯化后，将PCR产物连接在载体中，以及最后由适当重组质粒转化的宿主细胞中。多种宿主细胞在重组技术中众所周知，例如大肠杆菌、芽胞杆菌(Bacillus)、乳酸杆菌(Lactobacilli!)、链霉菌(Str印tomyces)、哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或C0S-1细胞)、酵母(例如酵母菌(Saccharomyces)、裂褶菌(Schizophyllum))、昆虫细胞或病毒表达系统(例如杆状病毒系统)。其它适当宿主细胞的选择和用于转化、培养、扩增、筛选、产物制备和纯化的方法能够由本领域技术人员通过参考已知技术来完成[25]。当通过常规重组方法制备时，本发明的肽可以通过常规切割技术从宿主细胞中分离，或者可以通过常规方法例如液相色谱法优选亲和色谱法从细胞培养基中分离。抗微生物肽能够表达为单肽或与N-或C-末端结合的若干肽序列的寡聚体，或者甚至是N-或C-末端标签，以使重组肽或蛋白构建体更易于纯化。可以进一步采用常规分子生物学技术和定点诱变来修饰序列并提供期望的非天然肽序列。所有这些重组技术为熟练技术人员已知，并已被报道用于许多抗微生物肽包括apidaecin[26]、perinerin[27]和防御素[28]。肽中还可以包括经由基因工程技术得到的非天然存在的氨基酸。这已经被Noren等人和Ellman等人广泛描述[29，30]。随后，肽能够从宿主细胞的培养物或体外翻译系统中分离。这能够通过现有技术水平的常规蛋白纯化和分离技术实现。这样的技术可以例如包括免疫吸附或色谱法。也可以在合成期间提供具有标签(例如组氨酸标签)的肽，其允许快速结合并纯化，其后标签被酶促除去以获得活性肽。如果肽自身不能够被编码或被表达，但与能够被编码或被表达的肽非常相似，则能够应用所述方法制备与其类似的肽，随后通过其中所述肽被化学或酶技术修饰的一个或多个步骤制备最终肽或肽模拟物。能够应用于制备肽的方法的一些更全面的综述描述于文献[31,32,33,34,35]中。本发明的肽和肽衍生物能够单独使用或组合使用或以多聚体的形式或以支链多聚体的形式使用。本发明肽的适当组合包含经由间隔区彼此顺序偶联的本发明肽的多联体，例如肽二聚体、肽三聚体等形式，其中个别肽随后被对齐。该多聚体能够由具有相同序列的肽和肽衍生物组成或由若干通式1的序列组成。单肽或肽衍生物能够与生物相溶性蛋白偶联，例如人血清白蛋白、人源化抗体、月旨质体、微团、合成聚合物、纳米颗粒和噬菌体。可选择地，本发明的单独结合肽或肽衍生物的多聚体以树枝状聚合物或聚簇的形式制备，其中三个或以上的肽连接到一个共同中心。在一个实施方案中，上述通式1的多种肽或肽衍生物被组织在多聚体构建体或组合物中。例如，为了将两个或以上的肽连接在一起或与将其与载体连接，在肽的N-或C-末端包含任选的氨基酸(例如-Gly-Ser-)或其它氨基酸或化合物间隔区。该组合物可以采用表达为与载体蛋白偶联的合成肽的一个或多个上述肽的形式。可选择地，组合物包含多种肽，其各自被表达为多抗原肽并任选地与载体蛋白偶联。可选择地，所选肽顺序连接并被表达为重组产生的蛋白或多肽。在一个实施方案中，多种肽顺序连接，其间有或没有间隔氨基酸，以形成更大的重组蛋白。可选择地，重组蛋白能够与载体蛋白框内融合。在另一实施方案中，多聚体构建体包含至少两个上文定义的肽(其可以是与通式1相同或不同的肽)，一个肽连接到另外一个肽或多个肽的的任何氨基酸。许多其它肽可以与组合物中另外肽的任何氨基酸连接。在包含至少两个肽的多聚体组合物的另一实施方案中，第二或其它肽与组合物中另外肽的支链构建体连接。可选择地，各其它肽与组合物中另一肽的Sub1或Sub2共价连接。在包含至少两个肽的多聚体构建体或组合物的另一实施方案中，至少一个或多个肽与载体连接。在另一实施方案中，一个或多个所述肽是与载体蛋白融合的合成肽。可选择地，具有或不具有侧翼序列的多种上述肽在多肽中可以顺序结合。所述肽或该多肽与相同载体偶联，或者不同肽可以作为肽与相同或不同免疫学惰性载体蛋白单独偶联。适当的载体可以增强肽的稳定性或递送、提高肽的制备、或改变肽的活性谱。载体的实例为人血清蛋白、聚乙二醇、其它生物聚合物或其它天然或非天然存在的聚合物。在一个实施方案中，期望部分为能够增强肽稳定性的蛋白或其它分子。本领域技术人员能够容易地选择适当的结合部分。本发明的多聚体组合物的优选实例具有对应于SEQIDNo.83和119的结构(Ac-OrnAsnAsnArgProValTyrlleProArgProArgProProHisProArgLeu)2_Dab和(OrnAsnAsnArgProValTyr11eProArgProArgProProHisProArgLeu)2_Dab。其它优选的二聚体选自<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在另一实施方案中，肽为多抗原肽(“MAP”)的形式，其能够例如根据Tam等人所述的“MAP-系统”设计[36]。该系统如所描述的那样利用赖氨酸残基的核心基体，在其上合成本发明相同肽的多个拷贝[见例如37]。每一MAP包含本发明的一个或多个肽的多个拷贝。在一个实施方案中，MAP包含至少三个并优选四个或以上的肽。结合本说明书，本领域技术人员可以仅借助于常规技术和知识由上文确认的通式的肽容易地制备多种多聚体构建体。本发明意在包括所有这样的多聚体组合物和构建体。然而多聚体形式的其它组合物通过珠形成，本发明肽或肽模拟物的暴露于所述珠的表面上。然后所述珠可以起到用于肽或肽模拟物的载体的作用，并且可以类似地起到可检测标记的作用。多聚体能够例如通过使肽或肽模拟物链的N-末端生物素化并随后与链霉抗生物素蛋白络合来制备。由于链霉抗生物素蛋白能够以高亲和力结合四个生物素分子或结合体(conjugates)，因此能够通过该方法形成非常稳定的四聚体肽复合物。多聚体可以包含本发明的相同或不同肽或肽模拟物。然而，优选地，本发明的多聚体包含两个或以上肽或肽模拟物，其中每一组分构成总杀生活性的一个方面(靶向、抗微生物活性、清除)。本发明的另一目的是发明的肽或肽衍生物在医学或药剂学中的用途，例如用于抗生素治疗，或者在抗微生物(特别是杀菌)组合物中的用途。本发明另一目的是包含一种或多种本发明的肽或肽衍生物或多聚体构建体的药物组合物，无论是否存在其它药物活性化合物的。本发明的另一部分是本发明的肽作为药物的用途和/或用于制备能够用作抗生素的药物的用途。所述肽可以在药物组合物中可以单独应用。可选择地，为了增强药代动力学或生物利用度而不引发免疫应答，如上所述将一种或多种肽与其它部分融合或结合。许多单肽或多聚体构建体可以混合在一起形成单一组合物。本发明的药物组合物包含治疗有效量的一种或多种本发明的肽或肽衍生物。一旦配制好，本发明的药物组合物能够在治疗微生物(特别是细菌)感染的方法中直接给予个体，所述方法包括给予有需要的个体治疗有效量的本发明的组合物。本发明的组合物被设计成治疗由感染的哺乳动物例如人的所选细菌或真菌导致的感染。至少一种或几种本发明的肽或多聚体构建体可以与药学上可接受的载体和其它任选组分配制成抗微生物(特别是抗细菌或抗真菌)组合物。为了用于这样的组合物，所选肽可以优选通过合成来制备，但也可以如上文所公开的通过重组来制备。组合物的直接递送一般通过局部施用或其它给药形式实现，所述其它给药形式为口服、肠胃外、皮下、舌下、病灶内、腹膜内、静脉内或肌肉内、经肺，或者递送至组织间隙。药物组合物还可以包含适当的药学上可接受的载体或稀释剂并且可以为胶囊剂、片剂、锭剂、糖衣丸、丸剂、滴剂、栓剂、粉末、喷雾、疫苗、软膏、糊剂、乳膏、吸入剂、贴剂、气雾剂等的形式。作为药学上可接受的载体，能够使用最适合具体剂型并与肽、肽模拟物(肽衍生物)、肽轭合物或肽模拟物轭合物相容的任何溶剂、稀释剂或其它液体介质、分散剂或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、胶囊剂、固体粘合剂或润滑剂。因此，药物组合物优选包含药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”还包括用于治疗剂，诸如抗体或多肽、基因和其它治疗剂给药的载体。术语是指自身不诱导对接受组合物的个体有害的抗体产生的任何药物载体，所述载体可以被施用而没有不适当的毒性。合适的药学上可接受的载体可以是大的代谢慢的大分子，例如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性病毒颗粒。这样的载体为本领域普通技术人员所熟知。肽或功能等同物的盐通过已知的方法制备，所述方法通常包括将肽或肽模拟物或肽轭合物或肽模拟物轭合物与药学上可接受的酸混合以形成酸加成盐，或者与药学上可接受的碱混合以形成碱加成盐。本领域技术人员在考虑化合物的具体预期用途后能够容易地确定酸或碱是否为药学上可接受的。例如，并非所有的体外应用可接受的酸和碱都能够用于治疗组合物。取决于预期用途，药学上可接受的酸包括有机酸和无机酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、羟基乙酸、草酸、丙酮酸、琥珀酸、马来酸、丙二酸、肉桂酸、硫酸、盐酸、氢溴酸、硝酸、高氯酸、磷酸和硫氰酸，所述酸与肽和功能等同物的自由氨基形成铵盐。与肽和功能等同物的自由羧基形成羧酸盐的药学上可接受的碱包括乙基胺、甲基胺、二甲基胺、三乙基胺、异丙基胺、二异丙基胺，和其它单-、二-和三烃基胺以及芳基胺。此外，还包括药学上可接受的溶剂合物。本文中能够使用药学上可接受的盐，例如诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等的无机酸盐；以及诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等的有机酸的盐。在Remington’sPharmaceuticalSciences(雷明顿药物科学)(MackPub.Co.,N.J.,1991)中可获得药学上可接受的受体的全面讨论。治疗组合物中的药学上可接受的载体可以包含液体，例如水、盐水、甘油和乙醇。另外，辅助物质例如润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等等可以在这样的介质中存在。通常，治疗组合物被制成可注射型，为液体溶液或者悬浮剂；也可以制成在注射前适合在液体介质中溶解或悬浮的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义内。为了进行治疗性处理，可以如上所述制备肽、肽_衍生物、肽轭合物或肽_衍生物轭合物并将其应用于有需要的个体。肽、肽_衍生物、肽轭合物或肽_衍生物轭合物可以通过任何适当途径给予个体，优选以适合这种途径的药物组合物的形式并以有效地进行预期治疗剂量。本发明的药物组合物可以包含其它活性剂，例如常规抗生素(如例如万古霉素、链霉素、四环素、青霉素)或其它抗微生物化合物，例如抗真菌剂，例如伊曲康唑(itraconazole)或咪康唑(myconazole)。还可以添加减轻其它感染症状，例如发热(例如水杨酸)或皮疹的化合物。次于用于处理感染的治疗用途，还用于生物战，也可以将本发明的肽或肽衍生物用于能够用于消毒或清洁表面和/或设备的消毒剂或清洁剂(例如杀菌组合物)。另一应用领域是在包装领域，其中肽能够与包装材料连接或植入包装材料中，或者作为易于被微生物降解的其它材料的防腐剂。本发明的肽或肽衍生物尤其可用于食品的包装，因为它们在接触或摄取后无毒。本发明的另一部分提供治疗哺乳动物微生物(特别是细菌或真菌)感染的方法，所述方法包括给予患有所述感染的哺乳动物有效抗微生物量的本文所述药物组合物。本文使用的术语“治疗有效量”指治疗剂，即本发明的肽、肽模拟物、肽轭合物或肽模拟物轭合物降低或防止细菌生长和定植，或显示可检测的治疗或预防作用的量。所述作用能够通过例如培养活组织检查和测定细菌活性或者通过评估细菌感染进展或严重性的任何其它适当的方法来检测。个体的准确有效量取决于个体体重和健康状态、疾病状态的性质和程度、以及选择用于给药的治疗剂或治疗剂的组合。具体地，本发明的组合物能够用于降低或防止细菌感染和/或并发的生物或物理表现，例如减轻发热。使临床医师确立起始剂量的方法在本领域是已知的。确定给予的剂量必须安全和有效。根据对引起感染的病原体、感染的严重性、患者的年龄、体重、性别、一般身体状况等的考虑来选择存在于各抗细菌有效剂量中的本发明蛋白质、肽或核酸序列的量。依赖于所用药物组合物和任选存在的其它组分例如抗生素、抗真菌剂等，诱导有效抗细菌或抗真菌作用而无显著不良副作用所需的活性组分的量会改变。出于本发明的目的，有效剂量为在给药个体中约0.01μg/kg至50mg/kg，优选0.5μg/kg至约10mg/kg的肽、肽模拟物、肽轭合物或肽模拟物轭合物。本发明的肽、肽模拟物、多聚体或肽轭合物、肽_模拟物轭合物的起始剂量之后任选地重复给药。给药频率取决于上文所列因素，并优选为每天1至6剂量持续时间约3天至最大约1周。在另一备选实施方案中，本发明的肽或肽模拟物或肽轭合物或肽模拟物轭合物或组合物从植入个体体内的控释或缓释基质给药。在一个实施方案中，以透粘膜剂型给予本发明的化合物。该给药途径是非侵入性的并为患者友好型；同时与口服给药相比，该给药途径可能导致化合物的生物利用度改善，特别是如果化合物在消化系统的流体中不稳定，或者如果化合物太大而不能被肠有效地吸收。透粘膜给药可以例如为经由鼻、颊、舌下、齿龈或阴道的剂型。这些剂型能够通过已知技术制备；它们能够被配制成代表滴鼻剂或喷雾剂、植入剂、膜剂、贴剂、凝胶剂、软膏或片齐U。优选地，用于透粘膜剂型的赋形剂包括提供用于粘膜粘附的一种或多种物质，因此延长了所述剂型与吸收部位的接触时间，并由此潜在地增强了吸收程度。在另一实施方案中，使用定量吸入器、喷雾器、气溶胶喷射或干粉吸入器经由肺部途径给予化合物。能够通过已知的方法和技术制备适当制剂。透皮、直肠或眼部给药在某些情况下也是可行的。使用先进的药物递送或靶向方法来更有效地递送本发明的化合物是有利的。例如，如果选择非胃肠外给药途径，则适当的剂型可以包含生物利用度增强剂，其是增加化合物可利用性的任何物质或物质的混合物。例如，这通过保护化合物不受降解来实现，例如通过酶抑制剂或抗氧化剂来实现。更优选地，增强剂通过增加吸收屏障的渗透性而增加化合物的生物利用度，所述吸收屏障通常是粘膜。渗透促进剂能够经由多种机理发挥作用；有些增加粘膜膜的流动性，而有些开放或加宽粘膜细胞间的间隙连接。还有一些降低覆盖粘膜细胞层的粘液的粘度。其中优选的生物利用度促进剂为两亲性物质，例如胆酸衍生物、磷脂、乙醇、脂肪酸、油酸、脂肪酸衍生物、EDTA、卡波姆、聚卡波非(polycarbophil)和壳聚糖。能够使用本发明的肽、肽衍生物、轭合物或多聚体的指征是由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起的细菌感染，例如大肠杆菌(Escherichiacoli)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、梨火疫病菌(Erwiniaamylovora)、月市炎克雷伯氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)、摩氏摩根菌(Morganellamorganii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)、痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、土拉热弗朗西其J氏菌(Francisellatularensis)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、丁香假单胞杆菌(Pseudomonassyringae)、苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)。本发明的另一目的是本发明的肽或肽衍生物或多聚体在生物技术或药物研究或筛选测定中的用途，特别是用于鉴定具有潜在的杀菌或抗真菌效果的化合物。在这一方面，本发明提供了用于鉴定具有潜在的抗细菌或抗真菌作用的化合物的方法，其包括(i)通过将以下(a)暴露于(b)和(C)进行竞争性测定(a)对本发明的肽或肽衍生物或多聚体敏感的微生物，(b)本发明的肽或肽衍生物或多聚体，(c)至少一种受试化合物；以及(ii)选择竞争性取代肽或肽衍生物或者多聚体与微生物的结合的测试化合物。这一筛选方法鉴定与本发明的肽、肽衍生物或多聚体组合物竞争结合病原体上未知受体的测试化合物。因此，在高通量筛选中能够有效鉴定与肽靶向的相同位点特异性结合的小分子。因此，测试化合物很可能具有与初始肽序列相同的作用模式，并因此也对被本发明所述的apidaecin或其类似物之一杀死的多耐药微生物有活性。这一筛选方法通过已知的方法实施，但使用至少一种本发明的肽或肽衍生物或多聚体。在一个实施方案中，用荧光的、放射性的或其它标志物标记肽或肽衍生物或多聚体，并在受试物质存在或不存在下检测并比较被标记的肽或肽衍生物或多聚体与微生物的结合。优选地，此后，基于抗细菌或抗真菌的用途，鉴定和筛选与本发明的肽或多聚体构建体竞争结合受体的测试化合物。在一个实施方案中，在竞争性测定中使用双分子荧光互补(BIFC)方法。该方法使细胞内蛋白相互作用能够直接可视化，这通过来自c-Abl酪氨酸激酶的SH3结构域与大肠杆菌中的天然和设计的靶标的相互作用来示例[38]。测定足够灵敏以能够检测在细菌中弱表达的蛋白之间的相互作用。该测定基于SH3结构域与其配偶体(partner)结合后功能性黄色荧光蛋白(YFP)的两个片段的联合。一旦这两个蛋白彼此结合，则YFP的两个片段形成非常类似于天然蛋白结构的复合物。这能够通过所得的YFP复合物荧光来监测，因为单独片段不显示任何荧光活性。可以设计类似构建体以筛选与本发明所述肽和肽衍生物竞争的化合物。本领域技术人员能够使高通量筛选容易地适合于386孔微量滴定板。在另一实施方案中，在合适的竞争性测定方法中采用肽与测试化合物来评估测试化合物竞争性取代与病原体上目前未知受体结合的肽的能力。需要时，取决于所选测定法，已知与所选肽结合的微生物(例如细菌、病毒或真菌)，例如大肠杆菌或肺炎克雷伯氏杆菌菌株，可以例如在ELISA形式中在合适表面上被直接或间接固定。这样的固定化表面是公知的。例如，可以使用惰性珠。此外，配体可以结合到96孔板。其后将选定量的测试化合物和本发明的肽暴露于固定的微生物和那些能够与肽竞争结合固定的微生物的选定测试化合物。一旦鉴定出那些与肽竞争结合细菌或真菌上的受体的测试化合物，则可以进一步按以下实施例中所述方法筛选它们的抗细菌或抗真菌活性。在另一方面中，本发明提供了包含编码本发明的肽或多聚体的核苷酸序列的分离的核酸分子。所述核酸编码本发明的抗细菌或抗真菌肽或多聚体组合物，与在宿主细胞中指导其表达的调控序列可操作联合。在另一方面中，本发明提供了用上述核酸分子转染或转化的宿主细胞。本发明通过以下实施例举例说明，但并不限于这些实施例实施例1固相肽合成使用Fmoc/tBu策略通过常规固相肽合成法合成所有肽和肽衍生物[39]。氨基酸衍生物来自MultiSynTechGmbH(Witten，Germany)。具有自由C-末端(C00H-基团)的肽和肽衍生物在来自MerckBiosciences(Schwalbach,Germany)的基于聚苯乙烯的王氏树脂(负载容量为1.33mm0l/g)上合成。具有C-末端酰胺(-CONH2-基团)的肽和肽衍生物在来自MerckBiosciences的基于聚苯乙烯的4_甲基二苯甲胺(MBHA)树脂(负载容量为0.64mmoL/g)上合成。在Syro2000多肽合成仪(MultiSynTechGmbH)上使用4当量氨基酸衍生物来合成肽和肽衍生物，所述氨基酸衍生物用二甲基甲酰胺(DMF;Bi0S0lveV.B.，Valkenswaard,Netherlands)中的2-(1_H_苯并三唑-1-基)-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU；MultiSynTechGmbH)和N，N，-二异丙基乙基胺(DIPEA；(Fluka,Buchs,Switzerland)活化。侧链保护基团对于AsruHis和Gin为三苯甲基(triphenylmethyl)(三苯甲基(trityl))，对于Tyr、Ser和Thr为叔丁基醚，对于Asp和Glu为叔丁基酯，对于Arg和βHar为N-ω-2，2，4，6，8-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基，以及对于Lys和Orn为叔丁氧基羰基。临时性Fmoc保护基用DMF中的40%哌啶(ν/ν)切割3min，并用DMF中的新鲜的40%哌啶(ν/ν)再切割lOmin。如上文对于Fmoc氨基酸衍生物所描述的，用DMF中的HBTU和DIPEA活化的10当量乙酸来使肽或肽衍生物的N-末端乙酰化。如Gaus印ohl等人所述，用DMF中的10当量HBTU和DIPEA进行肽或肽衍生物的N-末端的胍基化[40]。合成完成后，用DMF和DCM彻底洗涤肽或肽衍生物树脂，并在真空下干燥。将树脂结合的肽从固体载体切割并同时在室温下用三氟乙酸(TFA)中的5%水、4%间甲酚、5%茴香硫醚和2%(以体积计)乙二硫醇的混合物使侧链去保护4h。用冷二乙醚沉淀肽或肽衍生物，并于3000G下离心。用冷的醚洗涤沉淀物两次，干燥并溶于0.1%TFA水溶液中(UV-光谱级，Fluka)。在_20°C下储存样品。C-末端甲基化的肽和肽衍生物，即包含甲基(CO-OMe)或丙基(CO-OPr)酯的肽和肽衍生物在4-羟基甲基苯甲酸AM树脂(HMBA-AM树脂，负载容量为1.lmmol/g,Novabiochem,Merck-Biosciences,Darmstadt,Germany)上合成。使用DCM中的10当量Fmoc-氨基酸衍生物、5当量二异丙基碳二亚胺(DIC)和0.1当量N，N-二甲基-4-氨基吡啶将第一个氨基酸人工偶联到树脂上作为对称酸酐。在哌啶富烯测定法中通过DMF中的50%哌啶切割Fmoc-基团lh，基于在301nm下记录的吸光度确定负载容量[41]。典型的负载容量为约0.8mmol/g。如上所述进行自动合成。肽合成完成后，用DMF和DCM彻底洗涤肽HMBA-AM树脂并在真空下干燥。在室温下用三氟乙酸(TFA)中的5%水、4%间甲酚、5%茴香硫醚和2%(以体积计)乙二硫醇切割树脂结合的肽的保护基4h。用TFA和DMF洗涤树脂。在DMF中使树脂溶胀并用DIPEA/MeOH/DMF(体积比为155;每g树脂50mL溶液)将肽或肽衍生物从树脂上切割下来以获得C-末端甲酯。为了获得C-末端丙酯，在4_氨磺酰基丁酰基(Sulfamylbutyryl)AM树脂(负载容量为1.lmmol/g,Novabiochem,Merck-Biosciences,Darmstadt,Germany)上合成肽或肽衍生物，并在用THF中的三甲基硅烷化重氮甲烷活化后用DMF中的50当量丙基胺切割。在真空下除去溶剂，用冷二乙醚沉淀肽(或肽衍生物)并在3000G下离心。用冷醚洗涤沉淀物两次，干燥并溶于0.1%TFA水溶液(UV-光谱级，Fluka)中。在-20°c储存样品。为了获得二聚体肽衍生物，将FmoC2-Dab偶联到树脂。Fmoc-保护基切割后，获得两个自由N-末端并如上所述合成肽衍生物。如上文对于Fmoc氨基酸衍生物所描述的那样，通过用DMF中的HBTU和DIPEA活化PEG3000-0H来合成PEG3000肽衍生物并将其与肽或肽衍生物的N-末端偶联。使用JupiterC18-柱(20mmX250mm，PhenomenexInc.，Torrance,USA)在AktaHPLC系统(AmershamBioscienceGmbH,Freiburg,Germany)上纯化粗肽和肽衍生物。在作为离子对试剂的0.TFA的存在下，通过线性乙腈梯度进行洗脱，通常由5%乙腈水溶液开始，每分钟增加的乙腈。流速为lOmL/min，并通过220nm下的吸光度检测肽。通过使用JupiterC18-柱(4.6mmX150mm,PhenomenexInc.，Torrance,USA)的分析RP-HPLC和基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS；4700proteomicanalyzer,AppliedBiosystemsGmbH,Darmstadt,Germany)Jfei贝Ij胃月太白勺t屯貞。合成以下在表2中所示的肽表2<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>DR:D-精氨酸、MeR=甲基精氨酸，优选α-N-甲基精氨酸(5_(二氨基亚甲基氨基(diaminomethylideneamino))-2-甲基氨基戊酸)，N02R=硝基精氨酸，优选N(G)-硝基精氨酸(2-氨基_5-[(氨基-硝酰氨亚甲基(nitramidomethylidene))氨基]戊酸)，Cit瓜氨酸；Ac=乙酰基，For=甲酰基，Guan=胍基为改性N-末端的实例(N-末端氨基酸的改性α_氨基，Sub1=乙酰基-ΝΗ，甲酰基-NH或胍基)。Agpα-氨基-β-胍基丙酸，精氨醛精氨酸中的-C00H被-CHO取代，Cha环己基丙氨酸，Chex1-氨基-环己基碳酸，Cit瓜氨酸，OMe表示在c_末端处的甲酯(Sub2=0R3=OMe)，OPr表示在C-末端处的丙酯(Sub2=OR3=O-Pr)；MeLeu=N-甲基亮氨酸_具有肽键甲基化的亮氨酸；Ac=乙酰基，For=甲酰基，Guan=胍基为改性N-末端的实例(N-末端氨基酸的改性α-氨基，Sub1=乙酰基-ΝΗ，甲酰基-NH或胍基)；βAla和βHar为β-氨基酸的实例。实施例2血清稳定件如Hoffmann等人所述，进行一式两份的血清稳定性研究[42]。简而言之，将28μL肽或肽模拟物水溶液(0.5mg/mL)添加至水中的0.2mL新鲜混合的25%小鼠血清(Sigma-AldrichGmbH,Taufkirchen,Germany)中。将混合物于37°C下在温和搅拌下孵育。在4°C下离心(13500XG)5min之前，在0、0·5、1、2、4和6h孵育时间后于0°C下用40μL15%TCA水溶液沉淀蛋白20分钟。所有样品(240μL)的上清液用lmol/LNaOH水溶液中和，并立即于-20°C下储存。使用如上所述的以0.TFA作为离子对试剂的线性乙腈梯度通过RP-HPLC分析上清液。通过串联质谱(MALDI-T0F/T0F-MS,4700ProteomicsAnalyzer,AppliedBiosystemsGmbH,ffeiterstadt,Germany)在阳离子反射模式下使用α-氰基轻基肉桂酸(0.1%TFA水溶液中的50%CH3CN)作为基质进一步分析主峰的所收集部分，以鉴定肽和肽模拟物在不同时间点的降解产物，即代谢物。由200μL水中混合的25%小鼠血清组成的血清对照样品也如上所述用40μL15%TCA水溶液沉淀。由28μL肽储备溶液组成的肽参照样品在0.211^水和4(^1^15%的三氯乙酸(TCA)水溶液中稀释。一些肽的血清稳定性示于表3中表3<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>天然(野生型)apidaecin序列SEQIDNO.1和2从两末端降解，即N-末端和C-末端残基或肽被切割下来。因此，优选地，肽序列在两末端处对外肽酶或外蛋白酶以及内切蛋白酶是稳定的。对内切蛋白酶敏感的键特别是位置17中的精氨酸与位置18中的异亮氨酸或亮氨酸之间的键。通过由MALDI-MS测定肽代谢物的分子质量和对应肽的串联质谱来监测降解。N-末端降解导致序列缩短1至3个残基。N-末端乙酰化(SEQIDNo.7、13、24和32)例如显著减少该降解途径而并对影响C-末端降解无主要影响。例如，肽Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPRL-NH2(SEQIDNO.7)和Ac-ONNRPVYIPRPRPPHPRL"NH2(SEQIDNo.13)不是N-末端降解，而是仅从C-末端切割C-末端亮氨酸酰胺或者两个C-末端残基(图1)。N-末端胍基化在减少N-末端降解方面甚至优于乙酰化(SEQIDNo.134，137和155)。图1示出通过使用UV检测器由RP-HPLC获得的峰面积来定量在30、60、120、240和360min后存在于25%血清水溶液中的肽Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPRL-NH2(SEQIDNo.7)以及两种检测到的代谢物Ac-0NNRPVYIPQPRPPHPR_0H(SEQIDNO.164-C-末端亮氨酸酰胺的切割)和Ac-0NNRPVYIPQPRPPHP_0H(SEQIDNO.165-两个C-末端残基的切割)的量。类似地，通过例如不影响N-末端降解的C-末端酰胺化来减少C-末端的降解。因此，N-和C-末端修饰的组合显著降低了外肽酶或外蛋白酶的降解(SEQIDNo.7、13和32)。C-末端切割为Arg-17，即Arg-Leu或Arg-Ile通过该肽键的N-甲基化被有效地减少。优选地，如Ac-ONNRPVYIPQPRPPHPRMeLeu-NH2(SEQIDNo.32)所例示的，肽对所有三种可能的降解途径是稳定的，其显示出超过6小时的半衰期(25%血清水溶液，37°C)。对于序列Ac-0NNRPVYIPRPRPPHP0L-NH2(SEQIDNo.82)，通过用鸟氨酸取代Arg-17获得了相同的稳定性，因为鸟氨酸不是胰蛋白酶的切割位点。实施例3抗细菌测定1.抑菌圈测定(琼脂平板测定)在水中将已纯化的apidaecin-衍生的肽和肽衍生物稀释至终浓度为500μg/mL。将10μL等分试样和对照(10μL水或抗生素溶液)加到接种有对数中期的细菌培养物的悬浮液的琼脂平板。在37°C下将平板在黑暗中孵育。20h后测量抑菌圈(inhibitionzones)的直径。通常使细菌在胰酶大豆肉汤(TSB，Fluka，Neu-Ulm，Germany)和1.2%琼脂(Fluka)中生长。所有测试在需氧条件下进行。天然apidaecin序列的丙氨酸扫描鉴定出负责针对三种不同大肠杆菌菌株(图2)和肺炎克雷伯氏杆菌(图3)的抗微生物活性的若干残基。图2示出使用琼脂平板测定的apidaecinIa类似物(丙氨酸扫描)针对不同大肠杆菌菌株的抗细菌活性。图3示出使用琼脂平板测定的apidaecinIa类似物(丙氨酸扫描)针对肺炎克雷伯氏杆菌菌株ATCC10031的抗细菌活性。在图2和图3中示出的图中，在X轴中显示天然肽apidaecinlaGNNRPVYIPQPRPPHPRI(SEQIDNO.1)的序列。每一残基表示相应的肽，其中用丙氨酸取代所述残基，例如，位置1处的G代表ANNRPVYIPQPRPPHPRI(SEQIDNO.166)，位置2处的N代表GANRPVYIPQPRPPHPRI(SEQIDNO.167)，等等。竖条表示抑菌圈的直径。因此，竖条越高，丙氨酸修饰肽的抗细菌活性越高。采用丙氨酸扫描可以确定apidaecinl中与抗细菌活性相关的所有位置。如果位置Proll至Ilel8、Arg4、Tyr7和Pro9被丙氨酸取代，则抗细菌活性显著降低。在另一实验中，特定氨基酸位置被其它类似氨基酸取代以增加活性和蛋白酶抗性。在大多数情况下得到的是显著下降的活性。来自两种细菌的所有测试菌株对多种单位点突变显示出非常类似的应答，天然序列的位置11中的Pr0和位置17中的Arg是恢复至少部分活性所必需的。2.生长抑制测定在具有每孔100μL最终体积的灭菌圆底96孔板(聚苯乙烯，U形底，GreinerBio-OneGmbH)中使用连续肽稀释通过生长抑制测定来确定apidaecin-衍生肽和肽-衍生物的最低抑制浓度(MIC)。使诸如大肠杆菌BL21AI的细菌于37°C下在营养肉汤(NB，CarlRothGmbH+Co.KG,Karlsruhe,Germany)中生长过夜。将调整为1%TSB中的5X106CFU/mL的50μL过夜培养物添加至96孔板的各孔中。将冻干的肽和肽模拟物溶解于1%TSB(胰酶大豆肉汤)或水中以获得250μg/mL的终浓度。将50μL肽或肽模拟物溶液添加至板上行的第一孔中并混合。将50μL包含肽的第一孔溶液转移至第二孔，混合并再次将50μL转移至下一孔，等等。由此获得，从行的第一孔的250μg/mL开始降至第12孔的120ng/mL的两倍稀释系列，提供了从125μg/mL(孔1)至60ng/mL(孔12)的最终肽或肽模拟物浓度。将板于37°C下孵育20小时。使用TECAN微孔板分光光度计(Tecan，Germany)在595nm下测量吸光度。所有肽和肽模拟物以一式三份进行测量。将无菌水用作阴性对照。MIC值表示在37°C下孵育至少20小时后未观察到细菌生长的最低浓度。测试的肽和肽衍生物对若干多药耐药细菌的细菌的MIC值在表4中概括。测试以下多药耐药细菌菌株-大肠杆菌45849和D31，-肺炎克雷伯氏杆菌123132和K6，-伤寒沙门氏菌S5和肠沙门氏菌亚种肠道伤寒沙门菌(entericaserovarTyphimurium)(ATCC700408)，-放射型根瘤菌(ATCC15955，保藏为根癌农杆菌)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>Tb|A21ASI8I168|64|3280.65<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>SEQIDNo.Nr.1、2是作为比较实例的野生型序列，SEQIDNo.4、19、26、32、33、41、43、44、50、121和133是本发明次优选的实例(在位置10中具有Q作为X4)。其它所示SEQIDNo.是本发明的优选肽或肽衍生物。最优选的实例为SEQIDNo.6、7_8、11_13、20_22、25、39、40、45、65、67、84、85、88、137、155和159。C-末端酰胺化不仅产生更佳的抗微生物活性，即更低的MIC值，而且减少了C-末端受外蛋白酶的降解。如上所述，N-末端氨基的类似修饰，优选乙酰化或胍基化，减少了N-末端的降解。然而，N-末端乙酰化降低了某些测试细菌菌株(例如与SEQIDNo.22对比的SEQIDNo.21和与SEQIDNo.39对比的SEQIDNo.38)的MIC值，这表明N-末端残基应该携带正电荷。因此，X1位置中的甘氨酸被携带正电荷的侧链取代，如赖氨酸(例如SEQIDNo.21)、精氨酸和鸟氨酸(例如SEQIDNo.12)。在N-末端引入正电荷的另一可能性是N-末端胍基化，这同时稳定N-末端不受降解(例如SEQIDNo.133和137)。这些在位置X1中携带具有带正电荷侧链残基的N-末端修饰肽与乙酰化野生型apidaecin序列相比显示出更佳的MIC值。提高抗微生物活性的另一重要残基是位置10中的谷氨酰胺被携带正电荷侧链的残基取代，所述携带正电荷侧链的残基诸如鸟氨酸(例如SEQIDNo.12和13)、赖氨酸(例如SEQIDNo.21和22)或精氨酸(例如SEQIDNo.38和39)。由携带正电荷侧链的残基取代的位置10中的这种取代未降低蛋白酶抗性，因为以下位置包含脯氨酸，其有效地降低N-末端肽键被内切蛋白酶的蛋白水解切害I]。在位置11(残基X5)中脯氨酸被羟脯氨酸取代既没有影响测定误差范围内的MIC值，也没有降低其N-末端肽键的蛋白酶抗性。而在位置11(残基X5)中被羟脯氨酸取代既没有影响MIC值也没有影响血清稳定性，较高极性进一步降低细胞毒性和溶血活性，因为更大极性肽较少与细胞膜结合。因此，非常优选的肽在位置1(残基X1)中包含鸟氨酸，在位置10(残基X4)中包含精氨酸以及在位置11(残基X5,乙酰化N-末端和C-末端酰胺，例如SEQIDNo.40)中包含羟脯氨酸。此夕卜，位置17与18即原始序列的Arg和Leu/Ile之间的肽键被修饰以增加其蛋白酶或肽酶抗性，例如N-甲基化(例如SEQIDNo.33,34)。可选择地，位置17(残基X6)中的精氨酸被不易于蛋白酶解的碱性残基取代，例如鸟氨酸(例如SEQIDNo.38、131-133、146-155)。测试的肽和肽衍生物对几个菌种的细菌的MIC值概括于表5中。测试的细菌菌株为-大肠杆菌1103、10233、BL21Al,DC2，-肺炎克雷伯氏杆菌681，-藤黄微球菌(Micrococcusluteus)ATCC10240，-母牛分枝杆菌(Mycobacteriumvaccae)-枯草杆菌(Bactillussubtillis)347。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>SEQIDNo.Nr.1、2是作为比较实例的野生型序列。SEQIDNo.32、33和70-80，以及SEQIDNo.132、133、135、136、139、140、143、144和148是本发明的次优选实例(在位置10中具有Q作为X4)。反转apidaecin(SEQIDNo.141)和缩短的apidaecin肽(SEQIDNo.92和142)也是次优选的。其它所示SEQIDNo.也是本发明的优选肽或肽衍生物。最优选的实例是SEQIDNo.7、8、9、11-17、20-23、25、38-40、45、65-67、84、85、88、134和137。一般来说，在微量稀释测定法中测量的受试肽序列的抗细菌活性非常类似于表4中示出的数据，这些数据会在下文讨论。简而言之，期望C-末端酰胺化，因为其显著降低测试细菌的MIC值。如上所述，N末端乙酰化降低N-末端被肽酶或蛋白酶降解。在肽的N-末端携带正电荷基团的肽和肽模拟物获得最佳MIC值，因此在位置1中用均携带正电荷侧链的赖氨酸(例如SEQIDNo.21和22)、精氨酸或鸟氨酸(例如SEQIDNo.7和8)取代甘氨酸是有利的。鸟氨酸是优选的，因为其不引入胰蛋白酶切割位点。这些N-末端乙酰化肽与乙酰化野生型序列相比显示出更佳的MIC值。提高抗微生物活性的另一重要残基是在位置10(残基X4)中用携带正电荷侧链的残基取代谷氨酰胺，例如用鸟氨酸(例如SEQIDNo.12和13)、赖氨酸(例如SEQIDNo.21和22)或精氨酸(例如SEQIDNo.38和39)进行取代。这种取代没有降低蛋白酶抗性，因为以下位置包含有效降低N-末端肽键的蛋白水解切割的脯氨酸。作为N-末端乙酰化的替代，胍基化(例如SEQIDNo.88,134^P137)也非常有效，并额外扩大抗枯草杆菌的活性，即对野生型apidaecin序列以及大多数类似物具有抗性。在位置11(残基X5)中以羟脯氨酸取代脯氨酸既不降低MIC值也不降低蛋白酶抗性，而且作为更大极性的氨基酸，它还进一步降低细胞毒性和溶血活性。因此，优选的肽包含在位置1(残基XI)处的鸟氨酸、在位置10(残基X4)处的精氨酸或鸟氨酸以及在位置11(残基X5)处的羟脯氨酸、乙酰化或胍基化的N-末端和C-末端酰胺，例如SEQIDNo.40、103。有趣的是，某些修饰引入了抗枯草杆菌活性，这未在天然野生型apidaecin肽中观察到。这些具有抗枯草杆菌活性序列的共同特征是带正电荷的N-末端，即自由氨基或胍基化N-末端，apidaecinlb序列(位置18为亮氨酸-例如SEQIDNo.12、38、45、66、131-134和155)的位置10(残基X4)的精氨酸或鸟氨酸并优选位置1(残基X1)为鸟氨酸。相应的同源apidaecinIa肽(位置18为异亮氨酸)没有抗枯草杆菌活性。apidaecinIa序列的相同序列修饰(带电荷的N-末端、位置10的精氨酸或鸟氨酸以及位置1的鸟氨酸)扩展了抗母牛分枝杆菌(SEQIDNo.65)的活性。实施例4对哺乳动物细胞的毒性的测定1.溶血测定为了确定本发明的肽和肽衍生物对哺乳动物细胞是否有毒性，检测来自以上实施例1的一些肽和肽模拟物、阳性对照和阴性对照的溶血活性。用人红细胞测定溶血活性[43]。由莱比锡大学医院(Leipzig，Germany)提供氯化钠腺嘌呤-葡萄糖-甘露糖醇缓冲液中的人红细胞浓缩物。将红细胞以1000G离心并用10体积冷磷酸缓冲盐(PBS，pH7.4)洗涤3次。在PBS中将红细胞稀释至1%的终浓度。将PBS中的100微升该人红细胞悬浮液添加至V形96孔聚丙烯微量滴定板(GreinerBio-OneGmbH)的各孔中。以七个稀释步骤将溶于PBS中的100μL肽添加至各孔中以获得从600μg/mL开始至4.8μg/mL的稀释系列。将微量滴定板于37°C下孵育lh，随后以1000G离心lOmin。将100微升上清液转移至96孔平底聚苯乙烯微量滴定板(GreinerBio-OneGmbH)中，并在微孔板分光光度计(Tecan)上记录405nm下的吸收度以评价血红素释放。将PBS和0.1%曲拉通X-100用作阴性和阳性对照。溶血百分数按照以下方程计算[44](E肽-Epbs)/(E曲拉通-Epbs)X100%其中E=405歷下的消光度所有溶血测定以一式两份进行。图4和表6显示三次独立实验的平均值。图4显示月太A30Clguan.(SEQIDNo.88)和Al8G6ac.(SEQIDNo.39)禾口A17A6(SEQIDNO.6)的溶血测定结果，肽浓度为600μg/mL，PBS和曲拉通X-100(对叔辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇，0.1%)作为对照。其它肽和肽衍生物的结果在表6中概括表6<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>检测的肽中没有一种在高达600μg/mL肽浓度(即甚至在比获得的MIC值高100-1200倍的浓度)下显示出任何溶血活性。所有肽的溶血率相对于曲拉通仅为约1%，这在该测定的本底内。非离子表面活性剂曲拉通X-100被用作阳性对照，因为它在一小时内完全破坏实验装置中的血红细胞。该细胞测定表明，肽和肽衍生物能够以高浓度应用于血液中而不对血红细胞有任何副作用。总之，所有测试肽和肽衍生物均满足以下要求理想的抗微生物化合物在比MIC值高100倍的浓度下不应该显示出任何溶血活性。2.对COS细胞的毒性的测定使C0S-7细胞在10%CO2气体环境中于37°C下在含有10%胎牛血清的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco，smodifiedEaglemedium)(Cellgro,MeidatechInc.，Herndon,VA,U.S.Α.)中生长。将细胞(5XIO3细胞/孔)铺于24孔组织培养皿中并在添加肽之前孵育24h。将肽溶于0.5mL水中并将其一式两份接种于ImL培养基中至60μg/mL、200μg/mL和600μg/mL的终浓度。在10%CO2气体环境中于37°C下将板孵育24h以上。吸出培养基并通过添加100μL胰蛋白酶乙二胺四乙酸盐(EDTA)(在Hank’s平衡盐溶液中的0.25%胰蛋白酶/0.1%EDTA；Cellgro)终止测定。收集经处理的样品和对照样品，在PBS中洗涤并用冷70%乙醇水溶液固定2小时。然后，将细胞重悬浮于包含10μg/mL碘化丙啶(PI)和250μg/mLRNAse的PBS中，并在37°C下孵育30min。通过在GuavaEasyCyte微系统(GuavaTechnologies，Hayward,CA,USA)上进行的流式细胞术分析来评估坏死/凋亡率。上述测定研究不同浓度的双份的受试肽和肽衍生物对C0S-7细胞培养物的细胞周期的影响，即G1，S，G2/M期中的细胞以及坏死和凋亡细胞的百分比。相对于空白(未添加肽和肽衍生物)和完全破坏细胞的10%DMSO溶液来评价数据。结果概括于表7中。如前面所述的表中所示，没有肽和肽衍生物对细胞周期分布产生任何可检测的影响，因为它们都在两个空白的误差范围内，即使在600μg/mL最高浓度下。最重要的坏死和凋亡与空白相比没有升高。这一数据与溶血活性(表6)结合证明了研究的肽和肽衍生物在细胞水平没有细胞毒性，甚至在超过MIC值100倍的高达600μg/mL的浓度下。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>实施例5抗性的诱导在NCCLS条件下(国家临床实验室标准委员会_现为临床和实验室标准化研究会，Wayne,PA,USA,NCCLS-指导原则，M7-A5，Vol.20，Nr.2；2000)根据大量稀释法测定抗性菌株的诱导作用。首先，如实施例3.2中所述，测定待检测肽的最低抑菌浓度(MIC)。为了测定抗性的诱导，选择肽的连续稀释液，浓度从超过MIC3倍-4倍直至低于MIC。测试在圆底无菌96孔微量滴定板(聚苯乙烯，U形底，GreinerBio-OneGmbH,Germany)中进行，每孔200μL终体积。将冻干的肽或肽衍生物溶于水中并相对于MIC稀释于TSB(胰酶大豆肉汤)中以获得100μL体积。以2μg/mLMIC值为例，选择从32μg/mL至0.25μg/mL的稀释系列。系列中的稀释液为两倍稀释液。使细菌大肠杆菌BL21AI在37°C下在营养肉汤(NB，CarlRothGmbH+Co.KG,Karlsruhe,Germany)中生长过夜并在TSB中稀释至5XIO6菌落形成单位(CFU)/mL。将100μL细菌稀释液添加至负载肽的微量滴定板的每孔中以开始测定。将板于37°C下孵育24h后，使用TECAN微量滴定板读出器(Tecan，Germany)在595nm下测定吸光度。如实施例3.2中所述计算MIC值。使用适合于新确定的MIC值的肽浓度的新稀释系列以及使用在抑制肽存在下仍然生长细菌培养物进行重复测试。将该细菌培养物(第一代)在1%TSB中稀释至5X106CFU/mL。在37°C下与新的肽稀释系列孵育24h后，在595nm下测定吸光度并再次计算MIC值。使用适合于新确定的MIC值的肽浓度的新稀释系列并使用在抑制肽存在下仍然生长的细菌培养物(第二代)再次重复测试。对大约另外的8代进行相同的操作过程。选择未处理的大肠杆菌BL21AI培养物作为对照并于不存在抑制肽的情况下传代。所有肽和肽衍生物以一式三份进行测量。代数的选择依赖于诱导抗性的速度并通常为经连续10天的10代。图5示出野生型apidaecinlb(SEQIDNo.2)与本发明的两个优化序列(SEQIDNo.88和137)的抗性诱导的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>对于野生型apidaecin序列，第2代后已经获得了第一抗性菌株。在第10代中抗性增加至高达128μg/mLMIC值。然而，对于本发明的两个序列(SEQIDNo.88和137)，根本未观察到抗性诱导。因此，抗性诱导不依赖于C-末端。一起传代的未处理的大肠杆菌BL21AI对照的MIC值在测试期间没有变化。这些结果说明了本发明的化合物作为新型抗生素能够长期有利地使用，而不会在大肠杆菌中诱导抗性。实施例6体内分布的测量在小鼠中使用荧光_标记的肽衍生物测量体内分布。在固相肽合成(见实施例1)完成后将近红外吸收荧光染料Dy675(DyomicsGmbH,Jena,Germany)用DIC活化并将其与肽衍生物的N-末端偶联。然后用TFA切割肽并通过RP-HPLC纯化(见实施例1)。将40μg标记的肽衍生物经皮下(sc)或腹膜内(ip)注入被剃毛并用异氟烷麻醉的雌性Balb/c小鼠中。在连续暴露于异氟烷下将动物放入荧光显微镜室中。在添加肽后的第一个IOmin中每分钟以及此后的每5min直至65min，用发射波长设置为695nm的IVIS显微镜采集荧光曝光图像。图6示出荧光标记的肽Dy675-0NNRPVYIPRPRPPHPRL-NH2(SEQIDNO.160)在腹腔内注射后60分钟和65分钟的体内成像及生物分布。图中所示为60min后(图6A，腹部，低强度)、65min(图6B，腹部，高强度)和65min后(图6C，背部，高灵敏度)的图像。颜色条指示荧光强度。通过i.P.注射标记的荧光肽衍生物并通过几个时间点的体内成像研究它的分布(图6)。从背部采集的图6C清楚地显示出肽在脑、肝和两肾中富集。在图6B中脑也被染色，而由于在注射部位的高肽浓度未观察到肾和肝。大部分接种的肽在60min后保留在给药部位。少量肽遍及全身分布。新的肽衍生物的药物前景是它们在60min内到达动物包括脑、肝和肾在内的不同器官，这清楚地表明肽通过血液分布至体内所有器官。缩写本文中使用以下缩写表示氨基酸<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>其它缩写包括以下内容Ac:乙酰基，Api:apidaecin,AMP抗微生物肽，BSA:牛血清白蛋白，CFU菌落形成单位，DCM:二氯甲烷，DMF:二甲基甲酰胺，EDTA乙二胺四乙酸盐，ESI:电喷雾离子化，DIPEA=N,N，-二异丙基乙基胺，For甲酰基(甲酰氧基)，Fmoc9-芴基甲氧羰基，Guan胍基，HBTU:2-(1-H-苯并三唑-1-基)_四甲基脲六氟磷酸盐，HPLC高效液相色谱法，HMBA:4_羟基甲基苯甲酸，MALDI基质辅助激光解吸/电离，Me:甲基，MeCN:乙腈，MeOH:甲醇，MIC最低抑制浓度，MS质谱法，NB营养肉汤，OMe:甲酉旨，PBS磷酸缓冲盐，PI碘化丙啶，RP反相，RT室温，tBu叔丁基，TCA:三氯乙酸，TFA:三氟乙酸，T0F:飞行时间，TSB:胰酶大豆肉汤，UV:紫外线。文献在本申请中引用了以下非专利文献1.Thomasz,A.(1994)Multiple-antibiotic-resistantbacteria(^irL^^ififi细菌)·NewEngl.J.Med.330:1247-1251.2.Wenzel,R.P.(1988)Themortalityofhospital-acquiredbloodstrearninfections；needforavitalstatistic？(医院获得性血流感染的死亡率需要人口统计？)Int.J.Epidemiol.17225~227.3.Moellering,R.C,Jr.(1998)ProblemswithantimicrobialresistanceinGram-positivecocci(关于革兰氏阳性球菌中的抗微生物抗性的问题).Clin.Infect.Dis.26:1177-1178.4.Hand,W.L.(2000)Currentchallengesinantibioticresistance(抗生素抗性的当前挑战).Adolesc.Med.11=427-438.5.Hooper,D.C.(2001)Emergingmechanismsoffluoroquinoloneresistance(氟喹诺酮抗性的形成机理)·Emerg.Infect.Dis.7337-341.6.Jones,R.N.(2001)Resistancepatternsamongnosocomialpathogens:trendsoverthepastfewyears(医院病原体中的抗性模式过去几年的趋势).Chest119397S-404S.7.Prachayasittikul,V.,Lawung,R.,andBulow,L.(2000)EpisomeprofilesandmobilizablebetalactamaseplasmidinHaemophilusducreyi(杜克雷嗜血杆菌中附加体外形和可移动β内酰胺酶质粒).SoutheastAsianJ.Trop.Med.PublicHealth31:80-84.8.Teuber,Μ.(1999)Spreadofantibioticresistancewithfood-born印athogens(抗生素抗性随食源性病原体的传播).Cell.Mol.LifeSci.30755-763.9.Boman,H.G.(1995)Peptideantibioticsandtheirroleininnateimmunity(肽类抗生素及其在先天免疫中的作用).Annu.Rev.Immunol.13=61-92.10.Barra,D.,Simmaco,Μ.,andBoman,H.G.(1998)Geneencodedpeptideantibioticsandinnateimmunity(基因编码的月太抗生素禾口先天免疫).Do'animacules‘havedefensebudgets？FEBSLett.430130-134.11.Ludtke,S.,He,K.,andHuang,H.(1995)Membranethinningcausedbymagainin2(由蛙皮素2引起的膜变薄).Biochemistry3416764-1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其它微生物感染的抗微生物活性增强，(iii)显示扩大的抗微生物活性谱，(iv)在微生物中诱导较低抗性以及(v)对包括红细胞在内的人细胞无毒。文档编号C07K7/08GK101801995SQ200880107152公开日2010年8月11日申请日期2008年7月21日优先权日2007年7月23日发明者帕特丽夏·斯哈尔,拉尔夫·霍夫曼申请人:Amp医疗有限两合公司