专利名称：马耳它布氏杆菌bp26基因缺失M5-90疫苗株的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组细菌疫苗领域。具体地，本发明涉及一种重组马耳它布氏杆菌 (Brucella melitensis)，其中所述重组马耳它布氏杆菌完全缺失bp26基因。本发明还涉 及制备所述重组马耳它布氏杆菌的方法和所述重组马耳它布氏杆菌在制备疫苗和流行病 学监测试剂中的应用。
背景技术：
布氏杆菌(Brucella)为革兰氏阴性细菌，细胞内寄生，可感染人类及多种动物引 起发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损害等，导致世界范围巨大经济损失和严重公共卫 生问题。布氏杆菌病缺乏有效治疗手段，现有抗菌素治疗收效有限[1]。
马耳它布氏杆菌(Brucella melitensis)疫苗株M5-90为我国自行分离并致弱， 并在临床应用中取得了很好的效果，成功地防治了羊布氏杆菌病[2]，但常规血清学检测与 诊断方法不能将其与自然感染相区分，这对我国布鲁氏菌病防治与净化是不利的。解决该 难题的方法一是筛选天然的粗糙型菌株[3]，其不引发抗0抗原抗体，从而避免血清学诊断 时混淆，但这需要大量时间与繁重的工作。另一个方法是寻找具有抗原性的蛋白抗原，然后 敲除相应的基因，建立相应的检测方法。 有 学 者
利用生物学技术从流产布氏杆 菌疫苗株S19 lambda gtll文库中分离到编码26_kDa蛋白BP26的基因。Bp26蛋白在S19 中是一种周质蛋白，在转化的大肠杆菌中以前体形式表达并分泌到周质，含有28个氨基酸 的信号肽，共29KDa。
发明内容
研究表明BP26蛋白具有较好的免疫活性，被用来作为血清学检测的靶蛋白。bp26 的缺失突变不改变疫苗株的生物学特性和免疫保护原性，采用重组表达BP26蛋白为抗原 建立的间接ELISA方法，与布氏杆菌LPS提取物为抗原的常规间接ELISA相比，具有足够的 敏感性和特异性。本研究首次构建了马耳它型M5-90 bp26基因缺失突变株，为结合BP26 相关的诊断方法来区分该疫苗株免疫与自然感染，防控及净化布鲁氏菌病提供新途径。
具体而言，本发明提供以下各项 1.重组马耳它布氏杆菌(Brucella melitensis)，其中所述重组马耳它布氏杆菌 完全缺失bp26基因。 2.根据以上1所述的重组马耳它布氏杆菌，其中在所述重组马耳它布氏杆菌中完 全缺失的bp26基因被外源基因(例如，抗生素基因)替换。 3.根据以上2所述的重组马耳它布氏杆菌，其中所述抗生素基因是卡那霉素抗性
3基因(Kanr)。 4.根据以上1至3任一项所述的重组马耳它布氏杆菌，其中所述重组马耳它布氏 杆菌是重组马耳他布氏杆菌M5_90。 5. —种制备根据以上l至4任一项所述的重组马耳它布氏杆菌的方法，该方法包 括完全缺失马耳它布氏杆菌的bp26基因。缺失(敲除)基因的方法是本领域技术人员公 知的方法，例如可以借助自杀质粒通过同源重组的方法用外源基因(例如，抗生素基因)替 换bp26基因。 6.根据以上5所述的方法，其中用抗生素基因替换马耳它布氏杆菌的bp26基因。
7.根据以上6所述的方法，其中所述抗生素基因是卡那霉素抗性基因(KarO 。
8.根据以上5-7任一项所述的方法，其中所述马耳它布氏杆菌是马耳他布氏杆菌 M5-90。 9.根据以上l-4中任何一项所述的重组马耳它布氏杆菌在制备治疗和/或预防马 耳它布氏杆菌所导致的疾病的疫苗中的应用。马耳它布氏杆菌所导致的疾病例如有在人类 及多种动物中引起的发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损害等。 10.根据以上1-4中任何一项所述的重组马耳它布氏杆菌在制备马耳它布氏杆菌 流行病学监测试剂中的应用，所述试剂用于区分自然感染和疫苗免疫。在一个实施方案中， 所述马耳它布氏杆菌流行病学监测包括利用ELISA法检测目标生物体内BP26蛋白的抗体 的步骤，其中所述目标生物已经被施用了或未施用所述重组马耳它布氏杆菌疫苗。
11. —种灭活疫苗，其包含根据上述1-4中任何一项的重组马耳它布氏杆菌疫苗。
12. —种用于区分马耳它布氏杆菌疫苗免疫家禽和马耳它布氏杆菌自然感染家禽 的试剂盒，其包含根据上述1-4中任何一项的重组马耳它布氏杆菌疫苗和BP26蛋白的抗 体。 马耳他布氏杆菌M5-90系我国自行分离培养的弱毒疫苗株，具有较好的安全性及 免疫保护力，为我国布病防控发挥了重要作用。本研究以bp26基因作为重组靶位点，以 M5-90为亲本，利用bp26基因0RF外侧序列作为同源臂，将卡那霉素抗性基因(Kan10整合 到细菌基因组中，双交叉重组阳性菌株，经SDS-PAGE和Western blot试验表明迁移率约为 29kd的BP26蛋白在亲本菌中表达并可被鼠抗BP26高免血清识别，而突变株M5-90-26反 应结果为阴性，表明BP26蛋白在突变疫苗株M5-90-26中未表达。小鼠感染模型表明，残留 毒力与亲本株相比较没有发生明显改变，康复时间约为13周。M28强毒攻击保护试验证明， 突变株具有与亲本疫苗株免疫保护性一致，脾脏分离CFU数比空白对照要低3个数量级。 M5-90-26具备从血清学角度区分M5-90-26免疫与野生型布氏杆菌感染，对布氏杆菌病防 治、监测及净化具有重要的意义。
附图简述
图1. M5-90 (A)与M5-90-26 (B) bp26基因表达元件的示意图及转移载体 pSP-bp26-k(C)的示意图。M5-90中bp26大小为753bp。左右同源臂分别为1048bp和 1020bp。 B.在M5-90-26中795bp的Karf基因替换bp26，其使用bp26基因上游的的调控 序列作为表达调控序列； 图2. M5-90bp26同源臂与Karf基因PCR扩增及转移载体pSP-bp26-k酶切鉴定。 A，.M， A-HindIII分子量标准.1，bp26左同源臂；2，bp26右同源臂 B. M，DL2000marker. 1，
4Kanr基因的PCR产物。C. M，DL2000分子量标准。l，Kpn I和Pst双酶切质粒pSP-bp26-k。 2， EcoR I和Kpn I双酶切质粒pSP_bp26_k. D， Pst I和Sph I双酶切pSP_bp26_k ;
图3. M5-90-26的PCR鉴定(A和B)与Western blot检测BP26蛋白在重组 M5-90-26中缺失表达(C) 。 (A) :M，DL2000分子量标准.l，M5-90_26中Kanr基因PCR扩增 产物。(B) :M，入-Hindi11分子量标准 1和2分别是M5-90_26bp26基因左右同源臂PCR扩 增产物。(C) :M，蛋白质预染Marker。 1， M5普26与BP26免疫小鼠血清反应结果为阴性。 2， M5-90与BP26免疫小鼠血清反应结果为阳性； 图4. rBP26蛋白Western blot检测M5-90-26与M5-90免疫小鼠血清中BP26抗 体。l，M5-90免疫的小鼠血清与大肠杆菌表达的rBP26反应为阳性。2，M5-90_26免疫小鼠 血清与rBP26在Western blot中为阴性; 图5. M5-90-26, M5-90和M28在小鼠体内持续时间(A)及脾脏重量(B)。结果为 每组5只小鼠的均值，error bars代表标准偏差。通过t_检验，M5-90-26与M5-90之间， p = 0. 88，大于0. 05，差异不显著。M5-90与M28之间，p = 0. 02， M5-90-26与M28之间，p =0. Ol，均小于O. 05，差异显著。(B)M5-90-26与M28，M5-90 and M28之间p = 0. 01，小于 0. 05，差异不显著。而M5-90-26与M5_90p值=0. 4，差异不显著。 图6. M5-90-26， M5-90免疫小鼠M28攻毒体分离M28计数(A)及脾脏重量 (B)。 (A)Median代表中位数，Dispersion range为每组10只小鼠的分布范围。通过非 参数Kruskal-Wallis检验多重比较分析，星号代表与对照组(PBS免疫)差异显著，但 M5-90-26，M5-90之间差异不显著.(B)表中值为每组10只小鼠的均值，error bars代表标 准偏差，通过t-检验，M5-90-26与M28， M5-90与M28之间的p值均小于0. 05，差异显著。 M5-90-26与M5-90p值大于0. 05，差异不显著。
具体实施例方式
下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不
是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。 实施例l重组马耳他布氏杆菌M5-90-26突变株的构建、筛选及卡那霉素基因表
达稳定性的检测 1.材料和方法 1. 1材料 质粒pBluescript-I I (Strategene公 司)，pSP72 (Promega公 司)，pIRES2-eGFP(此质粒含有kana基因，为质粒上Tn5转座子中的序列) (B. D(Bioscience-Clonetech)公司)。马耳它布氏杆菌(Brucella Melitensis)强毒株 M28(为M5-90驯化前的亲本)和弱毒株M5-90(参考文献宏武，赫崇礼，陈乃昌等.布 氏杆菌羊种M5-90菌苗对山西土种黄牛二年免疫期试验。中国畜禽传染病，1988年第2 期.432-433 ;卢景良，李节堂，王振生等。羊型布氏杆菌单克隆抗体的研究I. M281D2C-1杂 交瘤株的建立。家畜传染病1984年第4期。134-37)均商购自哈尔滨兽医研究所。
液体TSB-YE培养基为TSB (Bioscience-Clonetech公司)添加0. 1 %酵母浸出物 (Bioscience-Clonetech公司)，pH为7. 2。平板培养基为液体TSB-YE中添加1%琼脂粉。 卡那霉素(Sigma)和氨苄青霉素(Sigma)的浓度为50 y g/ml和lOOy g/ml。
1. 2自杀质粒同源臂bp26基因外侧序列及Tn5转座子卡那霉素抗性基因扩增及序 列测定 取安瓿保存的疫苗株M5-90加入2ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)，完全溶解后划线培养 于TSB-YE平板。取单个克隆扩增后用试剂盒(Qiagen公司)提取细菌基因组，_20"保存 备用。利用高保真Pfu(Takara公司)taq酶，引物对bp26-l-f和bp26-l-r以及bp26-r-f 和bp26-r-r(表l)分别PCR扩增bp26的左臂和右臂同源基因。以质粒pIRES2-eGFP中的 转座子Tn5所含Ka^基因为模板，Karf-f和Karf-r(表l)扩增Karf基因。PCR程序，95。C 预热5min，30个循环为94。C 30s，55。C 30s，72。C 30，72。C终止反应10min。将各个PCR产 物分别克隆于pBluescript-II的EcoRV位点，分别命名为pBlue-bp26-l，pBlue-bp26-r和 pBlue-kana，对这三个基因进行序列测定。 表1构建自杀质粒pSP-bp26-k和鉴定M5-90-26所用引物
Primers Sequence Inserted Enzyme
5' cccgaattcggactgctcgatttcgaa3' ￡coR I
5' cccggtaccattgctagcacgagtgttcat3' 尺P" I
5' gggggtacccattcaaatatgtatccgctc3' 《戸I
5' ggactgcagtcagaagaactcgtcaagaag3' 尸w I
5'aaactgcagatagctggggtatgacgccct 3' TV I
5' ttggcatgcgaagaccgttcccgattgcat3' ^p力I 5 'ccgctcaaggttgatagacag3' 5'gcgtgcaatccatcttgttc3' 5 'gaaacctgccagtgccgcgattat3' 5 'ccttctatcgccttcttgac3' 1. 3含有外源基因自杀质粒pSP-bp26-k的构建 用EcoR I和Kpn I从pBlue-bp26-1上切下bp26-1基因，连接到同样用EcoR I 和Kpn I酶切的pSP72上，命名为pSP-bp26-l。将pSP_bp26_l利用Kpn I和Pst I切开， 将pBlue-Kanr(含有Kan10用Kpnl和Pst I同样处理，回收Kan1基因，插入pSP-bp26_l，命 名为pSP-bp26-l-k。然后用Pst I和Sph I切下pBlue-bp26-r上的bp26-r，插入同样用 Pst I和Sphl处理的pSP-bp26-l-k，命名为pSP-bp26-k(质粒图谱见图l(C))。 bp26同源 臂之间表达元件见图1。其中Kan1基因定向插入到pSP-bp26-l-k，其使用的转录翻译的调 控元件和阅读框架均来自bp26基因，而且bp26基因完全被替换掉，这样可以保证BP26蛋 白将完全不会表达。中量制备质粒pSP-bp26-k将浓度调整为1 ii g/y L(Qiangen试剂盒)。
1. 4M5-90-26突变株构建、筛选及卡那霉素基因表达稳定性的检测
M5-90疫苗株感受态细胞制备方法，100ml培养基37。C培养6h， 0D6。。约为0. 4 0. 6时，收获细菌5000g离心10min， 10%甘油水溶液洗3次，重悬于2. 5ml冰冷10%甘油 水溶液，200iU分装，置于-80。C保存备用。电转化(Bio-rad)质粒pSP-bp26-K到M5-90 细菌[4]。取10iig pSP-bp26-k加入置于冰上的M5-90感受态细胞，电转化条件为0. 2cm 的转化杯(Bio-rad) ， 25 y F， 2. 5KV， 400 Q ， 6ms，然后迅速将其转移至800 y 1的SOC培养基 (Invotrogen)中，37"C预热后转移250rpm摇床培养活化2h，全部涂布于含有卡那霉素TSB 的平板上，72h后观察菌落。将含有卡那霉素抗性的菌落一分为二分别划线到卡那霉素和氨 苄青霉素的平板上，进一步确认阳性克隆的抗性。单交叉和双交叉重组的菌落应显示不同 的抗性特性，单交叉重组的菌落有卡那霉素和氨苄青霉素双重抗性，双交叉只有卡那霉素
6抗性。将获得的阳性克隆在卡那霉素和氨苄青霉素的平板上传代20代(命名为M5-90-26)， 检验外源Kan1基因能否在M5-90-26中稳定表达。
1.5突变株M5-90-26的PCR鉴定 取lml新鲜培养的M5-90-26菌液12000g离心后弃掉上清。重悬于67%甲醇 PBS(pH 7. 2)溶液中，7(TC孵育2h，试剂盒提取细菌基因组。利用引物Kanr-f和Kanr-r PCR 鉴定Kanr基因是否存在于M5-90-26。其次利用jd-26+q-f和jd-kana-l-r (表1)鉴 定左同源臂的存在。利用jd-26-r-h-r和jd-kana-r-f鉴定右同源臂的存在。最后利用 jd-26-l-q-f和jd-26-r-h-r。进行序列测定。
1. 6突变株M5-90-26的Western blot鉴定 SDS-PAGE和Western blot鉴定，培养M5-90和M5-90-26，当0D6。。 = 0. 4-0. 6时取 lml菌液，12000g离心后弃掉上清。重悬于67X甲醇PBS(pH 7.2)溶液中，7(TC孵育灭活 2h。离心去上清，重悬于lOOiil PBS中，加入80ii1 2XSDS加样缓冲液和20iU DTT(二 硫苏糖醇)，沸水裂解30min，将细胞裂解物在10 %的分离胶进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝 R250 (Amresco)染色。同时，细胞裂解物经SDS-PAGE、电转移至硝酸纤维素膜(Amresco)， 10X脱脂乳4。C封闭过夜后，PBST(含0.05X Tween 20的PBS溶液)洗涤3次，每次3min。 加入l : 50倍稀释的鼠抗BP26蛋白高免血清(鼠抗BP26蛋白高免血清的制备方法的参 考文献胡森，王清华，王喜军等，重组痘病毒表达SARS冠状病毒纤突蛋白及其免疫原性分 析.病毒学报.2007(4) :287-291.)，将bp26基因0RF克隆到pET30a(Novagen)上进行原核 表达，所得蛋白以100 ii g/只剂量免疫小鼠3次，每次间隔3周，三免后3周分离所得血清)。 37t:作用lh后，PBST洗涤同上。加入释辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG(Sigma， 10% 脱脂乳l : 2000倍稀)，37。C作用lh后，PBST洗涤，DAB(3，3-二氨基联苯胺)显色3-5min，
去离子水终止。
2结果 2. lpSP-bp26-k转移载体构建及鉴定 bp26基因同源臂的扩增产物(图2A箭头所示)，左右同源臂大小与理论值1048bp 和1020bp相符。Kan1基因的扩增产物大小与795bp理论值相符(图2B箭头所示)。序列 测定结果表明bp26基因同源臂基因来自M5-90， Kanr基因来自Tn5转座子，与预期相符。 pSP-bp26-k上bp26基因左右同源臂用EcoR 1、Kpnl和Pst 1、Sphl酶切鉴定，Kar/基因用 Kpnl和Pst I酶切。与理论值相符(图2C和2D)。证明pSP-bp26-k转移载体构建成功。
2. 2突变株M5-90-26 PCR及Western blot鉴定 取新鲜培养的M5-90-26菌液，试剂盒提取细菌基因组后利用相应引物PCR鉴定 M5-90-26的基因组。结果Kan1基因正确重组到bp26位置，并完全替换其序列，如图3 (A)。 氨苄青霉素基因扩增为阴性。自杀载体框架因第二次交叉重组消失，扩增左右同源臂大小 与理论值相符，如图3 (B)。证明重组M5-90-26构建成功。 分别扩增M5-90和M5-90-26细胞裂解物，经SDS-PAGE后，电转移至硝酸纤维素 膜，一抗为l : 50倍稀释(10%脱脂乳)鼠抗BP26蛋白高免血清，结果表明在M5-90中 BP26蛋白表达且可以被鼠抗BP26蛋白血清识别，而在突变株M5-90-26中相应位置未出现 该条带，与预期结果一致(图3C)，进一步证明了 BP26蛋白缺失表达。 本研究中我国弱毒疫苗株M5-90的bp26基因成功被外源基因完全替换，从而保证
7了其产物完全不表达，在理论上排除了因0RF没有被完全替换而产生部分其因表达产物的
可能性。为建立以BP26为诊断抗原ELISA方法打下了良好的基础。 实施例2突变株M5-90-26的生物学活性检测 1.材料和方法 1. 1材料 材料同上。 1. 2突变株M5-90-26和M5-90免疫小鼠产生抗_bp26抗体情况的Westernblot检 将M5-90和M5-90-26以105CFU/只小鼠的剂量分别免疫3只4-5周龄的雌性BALB/ c小鼠(北京维通利华实验动物有限公司)，免疫途径为腹腔注射。4周后分离血清。以在 大肠杆菌中表达的rBP26(制备方法:陈伟业等，重组布氏杆菌BP26蛋白和0MP31蛋白作 为间接ELISA诊断抗原的研究.中国人兽共患病学报.2006, (6) :518-521))为抗原，利用 Westernblot检测M5-90和M5-90-26免疫小鼠后产生的抗-BP26抗体情况。将纯化的rBP26 在10%的分离胶进行电泳，转印后41:封闭过夜。 一抗为M5-90和M5-90-26布氏杆菌免疫 血清(1 : 50倍稀释)。第二抗体为释辣根过氧化物酶(HRP)标记绵羊抗鼠IgG(Sigma)， 10%脱脂乳1 : 2000倍稀，DAB显色3-5min，终止。
1. 3小鼠体内康复(Recover Time, RT)时间的测定 150只4-5周龄雌性BALB/c小鼠，分3组，每组50只。分别腹腔免疫M28、M5-90、 M5-90-26，免疫剂量为1 X 108CFU (菌落形成单位)。分别在免疫后第1， 3， 5， 7， 9， 12， 13周时 颈部拉断处死小鼠5只。无菌取脾脏称重，然后加入lml的pH 7. 2PBS匀桨(Qiagen Tissue lyser)。 10倍系列稀释匀浆液，取100 iU涂TA培养基(B. D公司)平板，菌落可以在37°C 培养4d后出现。计算RT时间
1. 4小鼠免疫保护试验45只4-5周龄雌性BALB/c小鼠，分3组，每组15只。分别免疫M5_90、 M5-90-26 和PBS (阴性对照)，免疫剂量为1 X 105CFU。免疫25周后全部用M28强度株攻毒(攻毒剂 量为5X 104CFU，途径为腹腔内注射)，攻毒15天后处死鼠脾脏称重，分离细菌。取100 涂TA培养基平板，37 °C培养4天后，菌落计数。
2.结果 2. lWestern blot检测突变株M5-90-26与M5-90在小鼠体内对BP26免疫应答
大肠杆菌中表达的rBP26作为抗原在Western blot中分别与突变株、亲本菌免疫 小鼠的血清反应，结果M5-90血清中出现与该蛋白反应的条带如图3A中箭头所示，约37KD。 因为天然BP26蛋白为29KD左右，在表达载体pET30中融合了 一段8KD左右的多肽，大小为 38KD。而突变株免疫的血清不与该重组蛋白反应，进一步证明了突变株未能产生抗BP26蛋 白抗体。 Western blot (图3C)显示M5-90-26未与抗BP26的多克隆抗体反应，但野生型 M5-90却出现了特异性反应的条带，从理论与实际证明BP26在突变株中表达缺失。Western blot(图4)表明免疫M5-90小鼠体内的抗体与E. coli中表达的rBP26发生反应，而 M5-90-26免疫小鼠血清未与rBP26发生反应。从另外一个角度证明M5-90-26在小鼠体内 不能引发抗BP26的抗体，这一结果为基于BP26的诊断方法奠定理论与实际的可行性。需
8要指出图3C和图4中条带的位置大小不一样，因为BP26蛋白在菌体中通常以前体形式出 现大小为29KD，裂解后为26KD。本研究中的rBP26在原核表达载体pET30a中融合了一段 8KD左右蛋白，所以小为约38KD。 2. 2突变株M5-90-26小鼠体内残留毒力的测定 为了评估M5-90-26的残留毒力，体内存活时间及增殖情况。将M5-90-26与亲本疫 苗株M5-90和M28比较脾脏分离细菌情况。研究表明Bp26基因缺失突变不会改变菌株的 生长特性。图5显示突变株M5-90-26与亲本疫苗株M5-90在第一周时低0. 71og，似乎残留 毒力略低，在7-12周毒力又略强于前者，但总的来看增值及康复时间方面无明显变化。到 第13周时基本分离不到细菌，整个脾脏分离的细菌数为0-4个。强毒M28始终高出二者约 21og。毒力明显很强，进一步证明其作为强毒株攻毒可行性。 在上述毒残留实验(也称康复时间实验RT)的结果中，M5-90和M5-90-26整体的 趋势大致一致，在13周中呈现逐渐递减的趋势，第1周CFU数在4.5和5之间，在第13周 几乎全部清除。与S19(波峰出现在第l-15天，且CFU维持在8Log10)和S2(持续时间很 短，在6周左右下降至0)不一样[6]。与Revl非常相似。S2持续时间很短毒力较弱但其保 护力也相对较弱。总之M5-90-26虽BP26缺失但是其复制特性及在体内的持续时间也就是 残留毒力与亲本相比无明显改变。同时与M28(强毒株，为M50-90驯化前的亲本)相比低 31ogl0左右。脾重M5-90和M5-90-26相比较也无明显差别，但比M28明显低，炎症反应最 严重发生在第21天，但始终肿胀。平均脾脏的重量在70-80mg左右，但即使体内分离不到 细菌，脾脏依然肿胀，证明炎症反应依然存在。
2. 3小鼠免疫保护试验 世界卫生组织(WH0)Wl997年确定了评估突变株免疫保护能力的标准，是在强 毒攻击后特定的时间内从小鼠脾脏或/和肝脏分离布氏杆菌数量的减少来衡量。为测定 M5-90-26与M5-90免疫保护能力是否一致，3组15只小鼠腹腔注射0. 2ml的PBS溶解的105 个CFU M5-90-26和M5_90。攻毒15天后，脾脏分离细菌。表2显示M5-90-26和M5-90免 疫的小鼠分离M28细菌数非常明显低于未免疫的阴性对照。M5-90-26与M5-90相比未见明 显差别。结果指出与M5-90相比，M5-90-26的抗菌活性即免疫保护性没有变化。
在攻毒保护试验中，免疫M5-90-26，M5-90后第150天进行攻毒试验，分离M28CFU 数保持一致，从体内分离M28的CFU数在31ogl0左右。而对照PBS免疫组中M28CFU为 61ogl0。差异极显著。证明M5-90-26， M5-90保持了相同的免疫保护水平。脾脏平均重量 也显著低于空白PBS免疫鼠，约为其重量的1/3。 本研究成功构建了马耳他疫苗突变株M5-90-26，并系统地阐述其在以小鼠为动物 模型的体内毒力残留及免疫保护情况，证明该突变株无论是安全性还是有效性都保持了与 亲本的高度一致性。同时也是首次在小鼠体内评价M5-90毒力残留及免疫保护情况。该突
变株为我国的布鲁氏菌病防控开辟新途径。
参考文献 [l]Alton GG， Jones LM， Angus RD. Techniques for the brucellosis laboratory. INRA(Institut National de la Recherche Agronomique)， Paris, France, 1988. [2]尚德秋.中国布鲁氏菌病防治科研50年.中华流行病学杂志(Chinesejournal of Epidemiology)，2000，21(1) :55-57. [3]Gerhardt GS，Nammalwar S，Michael JC. Brucelosis vaccines :past，present and future. Vet Microbiol,1990，20(20) :479-496. [4]E. Susan Drazek， Huo-shu H. Houng， Robert M. Crawford. Deletion ofpurE Attenuates Bruce1la melitensis 16M for Growth in HumanMonocyte—Derived Macrophages. Infection and Immunity,1995，63 :3297—3301. [5]World Health Organization (WHO). 1997. R印ort of the WHO WorkingG丽p Meeting on Brucellosis Control and Research :The development ofNew/Improved Brucellosis Vaccine, http://www, who, int/emc. [6]Nicole Bosseray， M Plommet. Brucella suis S2， Brucella melitensis Rev. land Brucella abortus S19 living vaccines :residual virulence and immunityinduced against three Brucella species challenge strains in mice. Vaccine,1990(8) :462-468。
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权利要求
重组马耳它布氏杆菌(Brucella melitensis)，其中所述重组马耳它布氏杆菌完全缺失bp26基因。
2. 根据权利要求1所述的重组马耳它布氏杆菌，其中在所述重组马耳它布氏杆菌中完全缺失的bp26基因被抗生素基因替换。
3. 根据权利要求2所述的重组马耳它布氏杆菌，其中所述抗生素基因是卡那霉素抗性基因(Kanr)。
4. 根据权利要求1至3任一项所述的重组马耳它布氏杆菌，其中所述重组马耳它布氏杆菌是重组马耳他布氏杆菌M5-90。
5. —种制备根据权利要求1至4任一项所述的重组马耳它布氏杆菌的方法，该方法包括完全缺失马耳它布氏杆菌的bp26基因。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中用抗生素基因替换马耳它布氏杆菌的bp26基因。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述抗生素基因是卡那霉素抗性基因(KanO。
8. 根据权利要求5-7任一项所述的方法，其中所述马耳它布氏杆菌是马耳他布氏杆菌M5-90。
9. 根据权利要求1-4中任何一项所述的重组马耳它布氏杆菌在制备治疗和/或预防马耳它布氏杆菌所导致的疾病的疫苗中的应用。
10. 根据权利要求1-4中任何一项所述的重组马耳它布氏杆菌在制备马耳它布氏杆菌流行病学监测试剂中的应用，所述试剂用于区分自然感染和疫苗免疫。
全文摘要
本发明涉及一种重组马耳它布氏杆菌(Brucella melilitensis)，其中所述重组马耳它布氏杆菌完全缺失bp26基因。安全性试验表明其与亲本疫苗株一致。强毒攻击保护试验证明，突变株具有与亲本疫苗株免疫保护性一致。本发明的突变株具备从血清学角度区分疫苗免疫与野生型布氏杆菌感染，对布氏杆菌病防治、监测及净化具有重要的意义。
文档编号C12N1/21GK101781632SQ20091000359
公开日2010年7月21日 申请日期2009年1月20日 优先权日2009年1月20日
发明者步志高, 胡森 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所