专利名称：谷氨酸脱羧酶c末端缺失的变体基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种谷氨酸脱羧酶C末端缺失的变体 基因及其用途。
背景技术：
定 点突变(site-directed mutagenesis 或 oligonucleotide-directed mutagenesis或site-specific mutagenesis)是指在目的DNA片段的指定位点引入特定 的碱基对变化的技术。它是研究蛋白质结构与功能之间的复杂关系的有力工具，也是在实 验室中改造基因的常用手段。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可 以改变对应的氨基酸序列和蛋白质的结构和功能特征，有助于了解蛋白质结构和功能的关 系。特别是在酶的理性设计中，或利用随机突变等定向进化技术筛选得到具有潜力的重要 氨基酸位点后，进行定点突变分析，将有利于进一步了解该位点在蛋白质结构和功能的关 系中所发挥的作用。谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase，简称 GAD ；EC4. 1. 1. 15)是一种广泛存 在于植物、动物和微生物中的氨基酸脱羧酶，它可以专一地催化L-谷氨酸的α-羧基脱羧 反应生成Y-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)。GABA是哺乳动物神经系统的 一种关键的神经递质抑制剂，具有抑制中枢神经系统的过度兴奋、解除神经紧张等生理功 能。由于身心紧张会导致人体血压升高、免疫功能失调、代谢紊乱，因此GABA对人体具有镇 静安神、促进睡眠、健脑益智、降低血压，改善免疫功能，延缓衰老等作用，是一种在食品和 医药领域具有广泛应用的天然氨基酸，已被国家卫生部批准为“新资源食品”。目前，利用谷 氨酸脱羧酶或具有该酶活力的细胞进行GABA的生物制备正得到越来越多的重视。作为生 物技术富集生产GABA的关键酶，细菌GAD的活力与pH值关系限制了其在大规模生物反应 器中的应用。细菌GAD的活力对pH值较为敏感，酶的最适pH值一般在4. 0-5. 0之间、在此 范围外酶的活力会出现明显的降低。这对于利用GAD制备GABA有两点不利。首先，这要求 对催化环境的PH值进行严格控制，如此才能使GAD发挥最大酶活；其次，由于L-谷氨酸在 此PH范围内溶解度较低，因此，该pH值范围不利于反应的操作。中国专利200510049189. 4和中国专利200510049187. 5公开了一种生产γ-氨基 丁酸的短乳杆菌(Lactobacillus brevis) CGMCC NO. 1306，对该菌株的GAD基因进行克隆， 构建重组质粒，转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，可实现可溶表达，该基因表达的GAD最适催 化pH为4. 8，在pH 6. 0及以上环境中基本没有催化活性。
发明内容
本发明提供了一种谷氨酸脱羧酶的变体基因，解决了传统谷氨酸脱羧酶在pH6. 0 及以上的环境中催化活性低的问题。一种谷氨酸脱羧酶的变体基因，其碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。本发明通过获得对来自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCCN0. 1306中GAD的基因进行定点突变，并将该基因中的第455位苯丙氨酸(Phe)的密码子TTC突变为终止 密码子TAA，使该变体基因编码的变体谷氨酸脱羧酶比野生型酶缺少了 C-末端的14个氨基 酸，致该基因缺失最后39个碱基，变体基因的长度为1365bp。本发明还提供了一种上述变体基因编码的谷氨酸脱羧酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本发明提供一种包含上述变体基因的谷氨酸脱羧酶表达单元、重组质粒以及转化 子。表达单元的启动子可以为常用的T7启动子、Iac启动子或araBAD启动子。在这 些启动子的作用下，突变酶可以直接在大肠杆菌宿主细胞，如BL21(DE3)，中实现胞内可溶 表达。本发明提供了上述变体基因在催化L-谷氨酸生成Y-氨基丁酸中应用。本发明变体基因通过在编码野生GAD酶基因基础上进行定点突变，提高了 GAD在 中性PH环境下的催化活力，使其表达的变体酶在pH 6. 0条件下催化谷氨酸生成GABA的活 力达到野生型酶的4. 8倍。随着酶的最适pH值范围的拓宽，使得催化反应可以在高于pH 5. 0的条件进行，因此也解除了在pH4. 0-5. 0条件下催化时底物谷氨酸溶解度低的瓶颈，为 利用该酶通过生物转化生产GABA创造了条件。
图1为质粒pET28a(+)_GAD的基因图谱；图2为野生型酶与突变酶三级结构图谱(左为野生型酶，右为突变酶)；图3定点突变原理示意图；图4为野生GAD酶基因PCR扩增产物凝胶电泳图谱。
具体实施例方式构建重组质粒将短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO. 1306培养至指数生长中期，取 4. 5ml菌液IOOOOrpm离心一分钟后弃去上清，利用试剂盒(上海生工)按说明书提取基因 组 DNA。设计如下简并引物上游简并弓丨物 1 :5，-cgggatccatgaaYaaRaaYgaYcaRgaRc-3‘；上游简并弓丨物 2 :5，-cggg^￡atggcWatgttRtaYggWaaac-3，；和一个下游简并引物5， -gggaattcttagtgHgtgaaYccgtattt-3‘其中，上游引物中的“ RRRRatcc ”为BamH I酶切位点，下游引物中的“ gaattc ”为 EcoR I酶切位点。分别用上游引物I(Upl)和上游引物2(Up2)与下游引物(Downl)配对，选择和优 化不同的模板/Pfu/引物比例，退火温度，循环次数，以所得基因组DNA为模板进行PCR，以 得到扩展片段大小合适、丰度适度和非特异条带少的PCR结果，最终采用上游简并引物2与 下游简并引物配对，得到了一个长度约为HOObp的DNA条带。
所确定的PCR体系组成为(单位μ 1)纯净水，38. 5 ；Pfu buffer，5 ；上游引物1， 0. 5 ；下游引物，0. 5 ；dNTP,4 ；模板，1 ；Pfu,0. 5 ；反应总体积为50。所用PCR条件为94°C变性5min后进入扩增循环，即94°C变性1. 5min, 57°C退火 lmin，72°C延伸3. 5min，共循环32次，最后在72°C延伸8min。扩增产物经凝胶电泳检验，结 果图4所示，产物条带单一、清晰、明亮，大小在1000-1500bp之间、且接近1500bp。阴性对 照无条带，说明扩增特异性较好。将克隆产物测序，发现谷氨酸脱羧酶基因的保守序列。用BamH I和EcoR I对扩增得到目的基因和pET_28a (+)进行双酶切，酶切条件如 下DNA 20 μ 1、10 XK buffer 4 μ 1、BamH I 4μ 1、EcoR I 4μ 1、ddH20 8 μ 1，酶切温度为 35 °C。质粒酶切lh，PCR产物酶切4h。分别对酶切产物进行电泳纯化和切胶回收，电 泳验证回收产物，然后进行连接，连接条件为10Xbuffer 2 μ 1, gad 1(^1、质粒1口1、 PEG30006y 1、T4连接酶1 μ 1，连接温度为16°C，连接16小时。连接反应结束后60°C保温5min灭活连接酶，再分别取连接产物转化DH5 α感受 态细胞(氯化钙法)。转化产物涂布于含有终浓度为30ug/ml卡那霉素的LB固体培养基， 37°C培养18小时后挑出阳性克隆，分别在含有30μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基中过 夜培养阳性克隆，提取质粒后进行BamH I和EcoR I双酶切、PCR验证，转化子含重组质粒 pET28a(+)-GAD0 经测序，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO. 1306 中 GAD 基因如 SEQ ID NO. 5所示，编码的GAD氨基酸序列如SEQ IDN0. 6所示。取构建的表达谷氨酸脱羧酶的质粒pET-28a(+)-gad转化BL21 ( λ DE3)感受态细 胞，得到表达短乳杆菌谷氨酸脱羧酶的重组工程菌(BL2lUDE3)-pET-28a(+)-gad)。挑取 菌体在含有终浓度为30ug/ml卡那霉素的LB固体培养基平板上于37°C活化10小时，然 后挑取单菌落接种20ml含有30ug/ml卡那霉素的LB，在37°C、200rpm摇床培养过夜后按 2%的接种量接种置于250ml锥形瓶的50ml含有30ug/ml卡那霉素的LB，在，37°C、转速为 200rpm的恒温振荡器进行培养2-3小时。当发酵液中菌体浓度(OD6J达到0. 6-0. 8时，向 培养液中加入异丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG) 1. Ommol/L,改变培养温度到30°C左右， 继续培养5-8小时。培养结束后，在4°C，SOOOg的条件下离心IOmin收集菌体。然后采用破胞缓冲液重悬细胞，然后用Ni-NTA(QIAGEN)进行金属螯合层析，得到 纯野生型GAD，其操作步骤和所用试剂如突变酶的纯化。定点突变PCR产物的获得向200 μ L的Eppendorf管中加入200 μ mol的dNTPs,上、下游引物各1 μ mol，约 IOng pET28a (+) -GAD 重组质粒作为模板 DNA, 5 μ L 的 10 X Pfu Buffer, 2. 5U 的 Pfu DNA 聚 合酶，然后加无菌蒸馏水至总体积为50 μ L。反应参数是在95°C预变性5min后，95°C变性 lmin，53°C退火2min，72°C延伸14min，经过18个循环，最后72°C延伸IOmin0上游引物CACATCGTTTaaCATAGTGATCCGCAACC下游引物CTATGttAAACGATGTGTGCTTGGTCG其中，小写字母代表发生替换的碱基。定点突变PCR产物的转化与验证将上述获得的定点突变PCR产物用DpnI酶进行消化，以降解野生型质粒，消除转 化子中野生型个体出现的可能。消化的体系为PCR产物10 μ L，IOXbuffer 2 μ L，Dpn I1 μ L，加ClH2O至总体积为20 μ Lo将消化以后的产物用CaCl2法转化大肠杆菌BL21 (DE3)，具体操作如下(1)从_70°C冰箱中取100 μ L的感受态细胞悬液，冰上融化；(2)加入定点突变PCR消化产物5 μ L，轻轻混勻，冰上放置30min ；(3)于42°C水浴热激110s，然后立即冰上放置2min ；(4)向管中加入900 μ L SOC培养基，混勻，37°C振荡培养lh，使细胞复苏；(5)将上述菌液摇勻，取适量涂布在含有30μ g/mL卡那霉素的LB平板上，正面向 上放置半小时，待菌液被培养基吸收后倒置平板，37°C培养过夜。(6)转化子长出后，随机挑选若干个克隆，提取质粒，进行全自动DNA测序，证实预 期突变位点455位的TTC — TAA。突变酶的表达与纯化将转化子接种到20mL含有30 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C，180rpm 振荡过夜培养，然后以的接种量接种到含有30μ g/mL卡那霉素的IOOmL LB液体培养基 中，37°C，180rpm 培养至 OD600 为 0. 6 0. 8 时，加入 IPTG (终浓度为 0. 5mM), 30°C, 150rpm 继续诱导8h。诱导结束后，4°C下5000Xg离心lOmin，收集菌体沉淀。用pH8. O磷酸缓冲 液洗涤两次，除尽培养基后再用原发酵液体积1/10的破胞缓冲液(50mM磷酸钾缓冲液，ImM PMSF, 300mM NaCl，IOmM咪唑，pH 8.0)重悬细胞，在冰浴中超声破胞90次(300W，工作3s， 间隙6s)，15000Xg离心IOmin收集上清，即得到含有GAD的粗酶液。采用Ni-NTA亲和层析对上步所得的粗酶液进行分离纯化。经上样(loading)、清 洗(washing)和洗脱(eluting)，收集洗脱液，透析除去小分子即得到纯酶。适当稀释后，以 考马斯亮蓝法测定纯酶的浓度。所用缓冲液配制如下裂解缓冲液(disruption buffer) :50mM磷酸二氢钠，ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)， 300mM NaCl，IOmM 咪唑，pH 8. 0。洗柱缓冲液(wash buffer) :50mM磷酸二氢钠，ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)，300mM NaCl，20mM 咪唑，pH 8. 0。洗脱缓冲液(eIution buffer) :50mM磷酸二氢钠，ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)， 300mM NaCl，250mM 咪唑，pH 8.0。突变酶在ρΗ6· 0处活力测定配制底物溶液(ρΗ6. 0,0. IM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，含0. OlmMPLP, IOmM底物 L-MSG)，取200 μ L底物溶液于40°C预热后加入10 μ L酶液(GAD浓度为280 μ g/mL)，迅速混 勻后在40°C反应2h，反应结束后迅速放入沸水浴中IOmin以终止反应，离心，收集上清液， 采用高效液相色谱法测定反应生成的GABA的量。在同样条件下，以野生型GAD的反应作为 对照。HPLC操作条件如下色谱分离柱为Hypersil 0DS2 C18(250mmX4. 6mm)(大连依利 特公司)，紫外检测波长为254nm，进样量为10 μ L，控制柱温25°C，流动相A为甲醇，流动相 B为四氢呋喃甲醇0.05M醋酸钠(pH 6. 2) (5 75 420，V/V)。梯度洗脱程序见下表表1催化产物HPLC检测的梯度洗脱程序 结果每mg突变酶的GABA产量为26. 8mM,而在同样条件下每mg野生型GAD的产量 仅为5. 6mM,因而在pH 6. 0处突变酶H468A的活力是野生型酶的4. 8倍。以表达变体谷氨酸脱羧酶的工程菌转化谷氨酸盐制备Y-氨基丁酸用无菌生理盐水重悬上述得到的表达谷氨酸脱羧酶的工程菌细胞，然后再次离心 收集菌体。取0.5g湿菌体，悬浮于25mL的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲体系中，L-谷氨酸钠 含量为60mM，控制反应体系温度在35 40°C，体系pH值在4 6之间。反应3小时，反应 液离心经高效液相色谱分析得Y-氨基丁酸含量约为6g/L。 以变体谷氨酸脱羧酶Gad H468A转化谷氨酸盐制备Y -氨基丁酸
用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲体系稀释实施例4中制备的谷氨酸脱羧酶纯酶制备反 应体系，体系pH值在4 6之间。向体系中加入一定量谷氨酸或其盐进行催化即可得到 Y-氨基丁酸。在本实施例中，选择的催化底物为L-谷氨酸钠，底物浓度为30mM，控制反应 体系温度在35 40°C，反应2小时，反应液离心经高效液相色谱分析得Y-氨基丁酸含量 约 1. 73g/L。
权利要求
一种谷氨酸脱羧酶的变体基因，其特征在于碱基序列如SEQ IDNO.1所示。
2.如权利要求1所述的变体基因编码的谷氨酸脱羧酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
3.一种包含权利要求1所述的变体基因的谷氨酸脱羧酶表达单元。
4.一种包含权利要求1所述的变体基因的重组质粒。
5.一种包含权利要求1所述的变体基因的转化子。
6.如权利要求1所述的变体基因在催化L-谷氨酸或其盐生成Y-氨基丁酸中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶的变体基因，其碱基序列如SEQ IDNO.1所示。本发明变体基因通过在编码野生GAD酶基因基础上进行定点突变，提高了GAD在中性pH值环境的催化活力，使对应变体酶在pH 6.0条件下催化谷氨酸生成GABA的达到野生型酶的4.8倍，拓宽了酶的最适pH值范围，为利用该酶通过生物转化生产GABA创造了条件。
文档编号C12N5/10GK101921791SQ201010268769
公开日2010年12月22日 申请日期2010年9月1日 优先权日2010年9月1日
发明者姚善泾, 梅乐和, 胡升, 郁凯, 黄 俊 申请人:浙江大学