专利名称：蛭弧菌混合体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及细菌的应用，特别涉及蛭弧菌蛭质体和游泳体混 合菌液在消除蔬菜致病菌中的新应用。
背景技术：
近年来，全球食品安全恶性事件频发，食源性疾病已成为影响 公共健康的重要问 题，往往是致人非正常死亡的主要原因。我国每年向卫生部上报的数千件食物中毒中，大部 分都是致病微生物引起的。蔬菜常污染肠出血性大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄 色葡萄球菌等，而我国食品污染物监测网数据显示，蔬菜中沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌、 单核细胞增生李斯特氏菌3种常见食源性致病菌检测阳性率逐年上升，是三种主要控制致 病菌。蔬菜富含各种维生素和膳食纤维，是人们日常生活必不可少的食品。近几年，市面 上出现一种即食蔬菜，这种蔬菜产品不仅满足了现代人快节奏工作需求，而且更迎合了市 民讲究保健和方便休闲的心理。这种即食蔬菜原料可以采用除叶菜类的各种蔬菜，包括冬 笋、藕、土豆、香芹、胡萝卜等等。其加工生产流程主要是新鲜蔬菜_清洗_加工_真空包装。生产过程中现有的清洗除菌方法主要通过酸液、碱液、加热除菌，即化学除菌和热 杀菌。化学除菌极易导致化学残留而对人体产生极大危害，而热杀菌不仅破坏了蔬菜中的 维生素等营养物质，一些致病菌芽孢的强耐热性还易造成杀菌不彻底，最终导致食物中毒 的发生。而一些生食蔬菜像生菜、葱、番茄、黄瓜等由于人们经过简单清洗后就直接食用，所 以同样容易造成细菌性食物中毒。除此之外，由于一些化学杀菌剂的使用，像二氧化氯、次 氯酸、漂白粉、过氧化物等，使得排放的废水、废渣中含有大量的氯，对环境造成极大危害。噬菌蛭弧菌是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌。其菌体大小比通常细菌还 小，为0. 2 0. 6X0. 8 1. 2微米，有类似细菌噬菌体的作用，但不是病毒，而是真正的细 菌，即具有一般细菌所有的各种特性。寄生和裂解细菌是蛭弧菌独特的特性。也是它维持 自己生命活动最突出的功能。我们的最新研究表明，有的蛭弧菌菌株可以裂解包括大肠杆 菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等一些常见食源性致病菌。蛭弧菌生活史分两个阶段自由生活，能运动，不进行增殖的游泳体阶段和在特定 宿主细菌的周质空间内进行生长繁殖的蛭质体阶段。蛭弧菌在游泳体阶段，识别并与宿主 发生不可逆结合，然后侵入宿主。蛭弧菌进入宿主菌细胞周质空间后，宿主细菌在30分钟 内即停止呼吸作用，死亡；而蛭弧菌则分泌多种酶，通过降解宿主细胞的大分子成为单体， 然后摄入用于其生物大分子的合成。随着细胞增殖和水解酶产生，使宿主细胞壁膜被破坏， 从而裂解释放出蛭弧菌。而游泳体和蛭质体的混合菌液可兼具游泳体起效快，活力强和蛭 质体制备、保存容易，杀菌作用时间更久和环境耐受力更强的优点。已有的研究表明，作为一种有益微生物制剂，无论是在食品工业还是在(海洋) 水产养殖等领域，蛭弧菌的应用均是安全的。例如在国外，Lenz and Hespell (1978)研究发现，蛭弧菌及对动物及人的细胞不具侵染性[Lenz R. W. , Hespell R. B. Attempts to growbedelIovibrios micurgically-injected into animal cells.Archives ofMicrobiology, 1978,119 (3) =245-248] 在国内，林茂等(2006)研究了蛭弧菌对鱼类细 胞的作用，发现它对鱼类细菌没有侵染作用[林茂，杨先乐，薛晖，曹海鹏，邱军强。蛭弧菌 BDH2102对鱼类细胞及病原菌的作用。微生物学通报，2006，33(1) :7_11]。因此，运用蛭弧菌混合菌液作为清洗除菌剂用于消除蔬菜携带菌落总数及致病菌 的这种生物方法就显得既安全又方便。蛭弧菌作为一类具有裂解致病菌的特殊细菌，不仅 可应用即食蔬菜食用、加工前的杀菌处理，同时又避免了即食蔬菜烹调过程中由于菌量基 数过大、加热杀菌不彻底造成的危害。而且不会导致细菌出现抗性，也无噬菌体疗法中宿主 过于专一的缺点，在杀灭致病菌后就会因为饥饿而死亡，绝不会残留，在保证食品安全的同 时也有效降低了耗能，起到保护环境的作用。因此蛭弧菌这种绿色除菌方法具有相当大的 优势。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的弊端，提供蛭弧菌蛭质体和游泳体混合菌液在 消除蔬菜清洗过程、加工设备及加工环境中致病菌的新应用，其特征按照绿色无公害蔬菜 微生物标准，减少设备投资成本，提高即食蔬菜加工前的安全性，降低食源性致病菌食物中 毒的发生率。本发明的目的通过下述方案实现蛭弧菌混合体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用。所述蛭弧菌混合体菌液为蛭弧菌蛭质体菌液和游泳体菌液混合。所述蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp. )BDFM05，于2009年8月7日保藏于中国 典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO =M 209172。所述蛭弧菌混合体菌液为蛭质体菌液与游泳体菌液按细菌数1 1混合。所述蛭弧菌混合体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用方法为将蔬菜在蛭弧菌混 合体菌液中浸泡15-45min或者在蔬菜的加工环境中喷洒蛭弧菌混合体菌液，喷洒用量为 10 100mL/m2。所述蛭弧菌混合体菌液中混合体菌液浓度至少为IO1PfuAiL,优选IO1 106pfu/
mLo所述蛭弧菌混合体菌液的制备方法如下蛭弧菌蛭质体菌液按照以下方法制备得到接种宿主于营养肉汤液体培养基中， 在35°C和200rpm摇床培养12h，培养液经4°C，5000 8000rpm离心10 20min后，沉淀 加入至DNB液体培养基中，接入蛭弧菌BDFM05，在温度25 35°C下，以150 300rpm摇 床培养36 48h，得到含蛭弧菌蛭质体和蛭弧菌游泳体的培养液，培养液在4°C温度下以 6000 8000rpm离心15 20min后，去除含蛭弧菌游泳体的上清，得到的沉淀即为蛭弧菌 蛭质体；将蛭弧菌蛭质体用DNB液体培养基、水、生理盐水或0. 2mol/L pH值为7. 2 7. 6 的磷酸盐缓冲液悬浮，得到浓度为IO6 109pfU/mL的蛭弧菌蛭质体菌液；蛭弧菌游泳体菌液按照以下方法制备得到将蛭弧菌蛭质体制备方法中的含蛭弧 菌游泳体的上清经16000 18000rpm离心15 20min后，沉淀用DNB液体培养基、水、生理盐水或0. 2mol/L pH值为7. 2 7. 6的磷酸盐缓冲液悬浮，得到浓度为IO6 109pfu/mL 的蛭弧菌游泳体菌液。将蛭弧菌蛭质体菌液和游泳体菌液混合得蛭弧菌混合体菌液。蛭弧菌BDFM05是由野生型蛭弧菌BDS02经紫外诱变得到，蛭弧菌BDFM05进行负 染后于电子显微镜下进行形态观察BDFM05呈单细胞，椭圆形，大小为1. 43 X 0.53 μ m，端 生鞭毛，鞭毛长度至少2 μ m ；所述蛭弧菌BDFM05以双层平板法于28°C培养三天可形成直径 2 3mm的透明圆形噬菌斑。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果
1、本发明所述用蛭弧菌混合浓缩液来清洗新鲜蔬菜，对其携带菌落总数及致病菌 的消除效果显著。如图1-3所示，蛭弧菌混合菌液对致病菌的消除率可达99%以上。2、本发明所述蛭弧菌混合菌液在消除新鲜蔬菜中菌落总数及致病菌的应用中安 全性好。蛭弧菌混合菌液消除新鲜蔬菜携带致病菌的方法是生物的方法，蛭弧菌具有可侵 染、裂解宿主细菌的特性，使之适合作为抑止或清除蔬菜表面致病菌的生物净化因子，且其 在裂解完宿主细菌后，会因饥饿而自动消亡，因此对人和动物无毒副作用。有效地减少或消 除化学除菌方法造成的化学残留和加热杀菌不完全造成的致病菌残留，确保蔬菜的优质， 从根本上避免蔬菜类产品食物中毒事件的发生。提高了消费者食用蔬菜的安全系数，保护 了消费者的健康。3、本发明所述蛭弧菌混合菌液对新鲜蔬菜的除菌能够最大程度的保护蔬菜的营 养价值。应用蛭弧菌混合菌液消除新鲜蔬菜携带的常见致病菌，避免了一些蔬菜必须高温 杀菌而对蔬菜中热敏性维生素等营养成分的破坏，对即食蔬菜的营养保值，具有很大优势。4、本发明所述蛭弧菌混合体菌液对新鲜蔬菜的除菌方法能够节约能源，简化即食 蔬菜加工程序，提高经济效益，保护环境。5、本发明还可延伸推广应用于其它蔬菜产品和水果，特别有利于减少或消除化学 药物如农药的使用和残留，确保蔬菜和水果的优质，对提高食用安全性，保障人类健康具 有十分重要的意义；同时为出口贸易保驾护航。6、所用蛭弧菌蛭质体和游泳体的混合菌液作为消除食用、加工前蔬菜携带致病菌 的新方法，同时具备消除效果好，作用持久，耐受力强等优点。
图1为蛭弧菌混合体液在蔬菜清洗中消除菌落总数时的消除率-蛭弧菌浓度图。图2为蛭弧菌混合体菌液在蔬菜清洗中消除其携带致病菌时的消除率-时间图。图3为加工设备及环境喷洒蛭弧菌混合体菌液时菌落总数残留率_喷洒量图。图4为各常规杀菌剂在蔬菜清洗中消除其携带致病菌时各致病菌浓度平均值的 对数值-时间图。图5为蛭弧菌混合体菌液在蔬菜清洗中消除其携带大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、单增李斯特菌(Listeriamonocytohenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)时的致病菌浓度对数值-时间图。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但实施方式并不仅限于此。实施例1蛭弧菌蛭质体和游泳体混合体菌液在番茄清洗时，对其携带菌落总数的消除。应用方法包括以下具体步骤及其条件步骤一蛭弧菌混合体菌液的制备蛭弧菌蛭质体的制备在装有IOOmL N B(营养肉汤)液体培养基(蛋白胨10g，酵 母膏5g，蒸馏水lOOOmL，pH 7.2)的锥形瓶中接种嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila, 购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号GIM1. 172)，200rpm、28°C摇床培养18小时，培养 液分别于4°C、5000rpm离心15min，弃上清。分别将沉淀加入到装有IOOmL DNB液体培养 基(营养肉汤0. 8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. lg，溶于IOOOmL蒸馏水中，pH值 为7. 4)的锥形瓶中，再加入从双层平板上挑取的蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05的噬 菌斑。恒温摇床250rpm、28°C培养36h。培养液分别于4°C 6000rpm离心20min，去除含蛭 弧菌游泳体的上清，保留沉淀(即蛭弧菌蛭质体)，加入生理盐水悬浮蛭弧菌蛭质体。制成 浓度为1012pfU/mL的蛭弧菌蛭质体浓缩液，待用；蛭弧菌游泳体的制备将蛭弧菌蛭质体制备方法中的含蛭弧菌游泳体的上清经 16000rpm离心20min后，得到的沉淀即是蛭弧菌游泳体，加入DNB液体培养基(营养肉汤 0.8g，酪蛋白酸水解物0. 5g，酵母精提物0. lg，溶于IOOOmL蒸馏水中，pH值为7.4)悬浮蛭 弧菌游泳体。制成浓度为1012pfU/mL的蛭弧菌游泳体浓缩液，待用；蛭弧菌游泳体菌液和蛭弧菌蛭质体菌液按细菌数1 1混合。步骤二 蛭弧菌混合体菌液在消除蔬菜加工清洗时其携带菌落总数的应用实验(1)致病菌的制备用普通营养肉汤培养基摇床培养，160rpm 28 °C培养12_16h增殖大肠杆 菌(Escherichia coli，购于广东省微生物研究所，编号GIM1. 137)、鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium,购于广东省微生物研究所，编号GIM1. 237)、单增李斯特菌 (Listeriamonocytohenes，购于广东省微生物研究所，编号GIM1. 228)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus,购于广东省微生物研究所，编号GIM1. 142)，培养液经6000rpm、 4°C离心20min，弃上清液，沉淀菌体用无菌pH7. 2的PBS(磷酸盐缓冲溶液)悬浮，得到浓度 为109CfU/ml的原液，最后制备上述四种菌的混合液，每种菌的终浓度为105CfU/ml。(2)致病菌的消除取新鲜番茄，试验设对照组和试验组。对照组三个番茄，为三个平行样，剩下番茄 为试验组，每小组三个，为三个平行样。所有对照组和试验组的番茄先经75%酒精杀菌，后 浸泡到(1)中制备好的500mL混合体菌液中lmin，取出浙干后，将试验组的番茄直接浸渍 于lOipfu/mLUifpfu/mLUOSpfu/mLUifpfu/mL的500mL蛭弧菌混合体菌液中，每浓度均有 三个平行样，对照组的番茄用清水(常规方法)浸泡，浸泡时间为30min。具体检测方法是 从每组试样中取出番茄放入无菌搅碎机中同时加入50mL的无菌蒸馏水搅碎，震荡均勻后 取原液依次用无菌蒸馏水进行10倍体积稀释后，取0. ImL涂布检测。根据GB4789. 2-2010菌落总数用营养琼脂培养基检测。结果如图1所示，单纯的清洗是无法除菌的，只能依靠外加除菌剂的作用。而 30min后各种浓度蛭弧菌混合体菌液对菌落总数的消除率分别为94%、99. 99%,99. 99%, 99. 99%。因此，蛭弧菌浓度越高，消除效果越好。实施例2蛭弧菌混合体菌液应用于芹菜加工过程应用设备、加工环境的消毒杀菌。试验包括以下具体步骤及其条件步骤一同实施例1的步骤一步骤二致病菌混合浓缩液消毒的应用实验。(此例是什么蔬菜？？加工什么蔬 菜？？)对芹菜加工车间地面和墙体、运输芹菜的传送带及芹菜清洗设备的表面，均勻喷 洒浓度为lOpfu/mL的蛭弧菌游泳体与蛭质体按1 1混合的混合液，喷洒使用量则按试验 组的不同分别为10mL/m2、30mL/m2、50mL/m2、70mL/m2、或100mL/m2，每天喷洒一次，连续喷洒 两天，对照喷洒清水。具体检测方法是用湿的无菌棉签在加工设备表面或地面等上面擦涂 取样，再用平板培养计数。检测方法同例1。结果如图2所示，在随后的环境病菌检测中，喷洒清水的对照组有各种致病菌检 出，菌落总数的残留率仍达78%。而在喷洒蛭弧菌混合体菌液的试验组中，仅在喷洒量为 10mL/m2组中检测到2 3cfu/mL的沙门氏菌，其他喷洒量的试验组没有检测到常见致病 菌。本试验研究的结果表明蛭弧菌混合体菌液在消除芹菜加工过程中致病菌方面的效果显 著，可确保芹菜产品品质及安全。由此可见，蛭弧菌作为杀菌剂可以广泛地推广应用于芹菜 的清洗加工过程中。实施例3蛭弧菌混合体菌液在香芹清洗中的应用。蛭弧菌混合体菌液制备方法同例1。致病菌混合体菌液制备同例1，浓度为105cfu/mL。取新鲜芹菜，实验分对照组和实验组两大系列，每组三个平行，每个平行一棵芹 菜。所有对照组和试验组的鲜藕先经75%酒精杀菌，后浸泡到制备好的500mL混合菌液 中lmin，取出浙干后，实验组喷洒20mL10pfu/mL蛭弧菌液(混合体菌液？？)，对照组喷等 量清水，室温放置40min，每隔IOmin取样检测一次，具体方法是取经无菌生理盐水湿润的 灭菌拭子(棉花签)在香芹表面上均勻的涂抹4次后，置含无菌生理盐水的无菌离心管 中振荡、混勻，然后采用平板涂布方法检测。具体是根据国标4789. 38-2008大肠杆菌用 VRB-MUG(中性红-胆盐培养基)培养基检测、根据国标4789. 4-2010沙门氏菌用BS (亚硫 酸铋琼脂)培养基检测、根据国标4789. 30-2010单增李斯特菌用李斯特氏菌显色培养基检 测、根据国标4789. 10-2010金黄色葡萄球菌用Baird-Parker琼脂平板检测。对照组菌数 为各致病菌总数平均值。检测结果如图3所示，喷洒清水的对照组，各种致病菌数基本不变，而喷洒BD的实 验组中致病菌数均呈下降趋势，各种致病菌的消除率均达99. 99%。实施例4 蛭弧菌混合体菌液与常规蔬菜杀菌剂杀菌效果比较
常规蔬菜杀菌剂有氯系杀菌剂(次氯酸钠、漂白粉、漂粉精等)、电解酸性离子水、 二氧化氯、臭氧、过氧化物与氯氧化物混合。本例以新鲜小白菜为例，蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)采用BDFM05，蔬菜用75%酒 精杀菌后，先将新鲜蔬菜浸泡到制备好的500mL致病菌混合液中lmin，取出浙干，将新鲜蔬 菜浸泡到各种杀菌剂及蛭弧菌混合体菌液中，40min。初始每隔Imin检测一次，IOmin后， 每隔IOmin检测一次。具体检测方法同例3，蛭弧菌混合体菌液制备同例1，浓度为IOpfu/ mL。致病菌混合液制备方法同例1。浓度为105cfu/mL。常规杀菌剂杀菌图中致病菌取各 致病菌数平均值。
结果如图4-5所示。从图4中可以看出常规杀菌剂起效快，一般2min内可基本 上杀灭病原菌。从图5中可以看出单株蛭弧菌混合体菌液30min内可杀灭99%的致病菌， 40min时致病菌已检测不到。蛭弧菌混合体菌液通过菌裂解消除致病菌需要一个过程，所 以起效慢，但是20min内可杀灭大70%的病原菌。蛭弧菌通过裂解消除致病菌属于生物防 治，使用安全不会对环境造成污染，也不会对蔬菜品质造成影响。相比常见杀菌剂更适合蔬 菜杀菌使用。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.蛭弧菌混合体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用，其特征在于所述蛭弧菌混合体菌 液为蛭弧菌蛭质体菌液和游泳体菌液混合。
2.根据权利要求1所述蛭弧菌混合体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用，其特征在于 所述蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDFM05，于2009年8月7日保藏于中国典型培养 物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO =M 209172。
3.根据权利要求1所述蛭弧菌混合体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用，其特征在于 所述蛭弧菌混合体菌液为蛭质体菌液与游泳体菌液按细菌数11混合。
4.根据权利要求1所述蛭弧菌混合体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用，其特征在于 所述蛭弧菌混合体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用是将蔬菜在蛭弧菌混合体菌液中浸泡 15-45min。
5.根据权利要求1所述蛭弧菌混合体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用，其特征在于 所述蛭弧菌混合体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用是在蔬菜的加工环境中喷洒蛭弧菌混 合体菌液，喷洒用量为10 100mL/m2。
6.根据权利要求4或5所述蛭弧菌混合体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用，其特征在 于所述蛭弧菌混合体菌液中菌液浓度至少为lObfu/mL。
7.根据权利要求6所述蛭弧菌混合体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用，其特征在于 所述蛭弧菌菌液浓度为IO1 106pfu/mL。
8.根据权利要求1所述蛭弧菌混合体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用，其特征在于 所述蛭弧菌混合体菌液的制备方法如下所述蛭弧菌蛭质体菌液按照以下方法制备得到接种宿主于营养肉汤液体培养基中， 在35°C和200rpm摇床培养12h，培养液经4°C，5000 8000rpm离心10 20min后，沉淀 加入至DNB液体培养基中，接入蛭弧菌BDFM05，在温度25 35°C下，以150 300rpm摇 床培养36 48h，得到含蛭弧菌蛭质体和蛭弧菌游泳体的培养液，培养液在4°C温度下以 6000 8000rpm离心15 20min后，去除含蛭弧菌游泳体的上清，得到的沉淀即为蛭弧菌 蛭质体；将蛭弧菌蛭质体用DNB液体培养基、水、生理盐水或0. 2mol/L pH值为7. 2 7. 6 的磷酸盐缓冲液悬浮，得到浓度为IO6 109pfU/mL的蛭弧菌蛭质体菌液；所述蛭弧菌游泳体菌液按照以下方法制备得到将蛭弧菌蛭质体制备方法中的含蛭弧 菌游泳体的上清经16000 18000rpm离心15 20min后，沉淀用DNB液体培养基、水、生 理盐水或0. 2mol/L pH值为7. 2 7. 6的磷酸盐缓冲液悬浮，得到浓度为IO6 109pfu/mL 的蛭弧菌游泳体菌液。将蛭弧菌蛭质体菌液和游泳体菌液混合得蛭弧菌混合体菌液。
全文摘要
本发明公开了蛭弧菌混合体菌液在消除蔬菜致病菌中的应用，应用方法为将蔬菜在蛭弧菌混合体菌液中浸泡或清洗沥干后向蔬菜喷洒蛭弧菌混合体菌液，在蔬菜的加工环境内喷洒蛭弧菌混合体菌液，喷洒用量为10～100mL/m2，蛭弧菌混合体菌液中混合体的浓度至少为101pfu/mL，优选101～106pfu/mL，应用中致病菌清除率均在99％以上，本发明适合推广应用于所有蔬菜和水果。不仅可提高消费者食用即食蔬菜、水果的安全系数，保护消费者的健康，也为蔬菜的绿色加工生产提供保障。
文档编号C12R1/01GK102038121SQ20101026852
公开日2011年5月4日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者李娜, 蔡俊鹏 申请人:华南理工大学