专利名称：一种提高种子抗氧化能力及种质改良的方法
技术领域：
本发明涉及拟南芥种子储藏蛋白基因2S albumin isoform 3 (At2S3)的启动子与三个抗氧化基因重组提高种子抗氧化能力等种质改良中的应用，属于分子生物学和生物技术领域。
背景技术：
作物种子是最基本的农业生产资料，是农业增产的内因，是各项技术措施的载体。 禾谷类如玉米种子，种胚大、呼吸旺盛、易发热。胚部含脂肪多，易氧化酸败。而且胚部带菌量大，容易霉变。油料作物大豆种子吸湿性强，易丧失生活力，破损粒易生霉变质，导热性差，大量蛋白质在高温高湿条件下很容易老化变性。因此，种子贮藏是种子生产经营活动的重要环节，同时也是救灾备荒的重要措施。如果管理不善，会使害虫危害严重，导致种子的生活力降低，严重的会使种子霉烂，使农业生产受到很大损失。种子特异启动子可以控制下游基因在植物种子中表达，避免外源基因在转基因植株中非特异表达所造成的能量和物质浪费，从而减少对其他重要农艺性状的不良影响。因此，利用种子特异启动子控制外源基因在种子中特异表达具有重要的理论和经济价值。本发明人从拟南芥中分离到种子贮藏蛋白2S albumin isoform 3的基因At2S3 的启动子序列。进一步构建启动子驱动的GUS报告基因、锰-超氧化物歧化酶基因MSD1， 过氧化氢酶基因CATl和维生素E生物合成中的关键酶尿黑酸植基转移酶基因HPTl三个抗氧化基因的植物表达载体，转化拟南芥。转基因拟南芥在种子相关器官(包括成熟种子、果夹和幼苗子叶)中高效表达GUS基因和三个抗氧化酶基因。筛选抗氧化酶基因表达均最高的株系，分别进行杂交，筛选、获得三价转基因种子。三价转基因种子内Y-维生素E(生育酚)含量比野生型提高45% ；在含10 μ M百草枯(MV)的培养基上萌发率比野生型提高 47%。该启动子可用于植物的种子基因工程，改良种子的抗氧化胁迫能力和品质。
发明内容
本发明分离拟南芥种子特异基因At2S3的启动子，连接到植物表达载体上，利用脓杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥，获得的转基因种子VE含量和抗氧化胁迫能力大大提尚。从拟南芥中通过PCR方法克隆得到At2S3启动子，插入到表达载体pBI121中⑶S 基因的上游，转化拟南芥。对转基因植株进行GUS染色和荧光活性测定，证明该启动子在种子相关器官中高效特异表达。从拟南芥叶片中提取总RNA，反转录成cDNA，通过PCR方法克隆得到编码锰-超氧化物歧化酶基因MSDl，过氧化氢酶基因CATl和VE生物合成途径中的尿黑酸植基转移酶基因HPTl三个抗氧化酶基因。分别将三段基因序列插入到At2S3启动子下游，转化拟南芥。 对转基因株系分别测定SOD和CAT酶活、Ve含量。选择SOD和CAT活性最高的株系进行杂交，得到双价转基因植株，再Ve含量含量最高的At2S3 HPTl转基因植物进行异花授粉，获得三价转基因植株。将单价、双价和三价转基因植株的种子进行氧化胁迫(MV)处理。与野生型相比，单价MSD转基因植株、双价和三价转基因植株的抗氧化胁迫能力明显增强。根据上述技术，从拟南芥中分离的At2S3启动子驱动抗氧化基因单独和整合过量表达能提高种子的抗氧化胁迫能力，有望延长种子的贮藏期。如果连接耐盐或者抗旱基因可以提高种子出苗时的耐盐和抗旱能力；如果连接种子品质相关基因则可以提高种子的品质改良，具有重要的经济效益和社会效益。
图1是野生型和转基因种子内的生育酚含量。(a)野生型和转基因株系(H3为例)的种子内生育酚组成及含量的高效液相色谱图。(b)野生型和相应转基因株系的种子内的生育酚含量。α、β、γ和δ是四种同分异构体。柱状图上方的不同字母表示在P <0.05时差异显著。图2是百草枯(MV)处理时野生型和转基因拟南芥的种子萌发状况(a)、(b)分别是在含10 μ M MV的MS培养基上所有基因型的种子萌发5天后的照片和每天的萌发率统计结果。胚根伸长> Imm时定义为种子萌发。标尺=1mm。图中所示的At2S3: :MSD、At2S3: :CAT利At2S3: :HPT的值均是各基因型五个株系的平均值。图3是百草枯(MV)处理时野生型和转基因拟南芥的幼苗发育状况(a)、(b)分别是在含1 μ M MV的MS培养基上所有基因型的种子萌发5天后的照片和幼苗成活率统计结果。幼苗成活率定义为长出绿色子叶的幼苗占所有萌发的种子的比例。标尺=1mm。图中所示的At2S3: :MSD、At2S3: :CAT和At2S3: :HPT的值均是各基因型五个株系的平均值。图4是NBT染色法检测幼苗体内O2 ‘_含量(a)对正常生长5天的幼苗进行NBT染色。(b)用0. 5 μ M MV处理5日龄幼苗后进行NBT染色。CK是没有进行NBT染色的对照。标尺=1mm。(五)具体发明实施方式实施例1 :At2S3启动子的种子特异表达分析1.提取拟南芥叶片基因组DNA，利用特异引物通过PCR克隆获得At2S3启动子全长序列，1760bp。2.将At2S3启动子插入到表达载体pBI121的⑶S基因上游，转化农杆菌GV3101。3.农杆菌侵染液的配制将生长到静止生长期(0D600 = 0. 8)的农杆菌，5000rpm 离心5min，上清保留做菌种，沉淀用5 %蔗糖溶液悬浮，侵染前再加0. 3-0. 5%。Silwet L-77。4.拟南芥的侵染将拟南芥花序整体浸入侵染液中，轻微振荡6-Ssec，随后迅速取出；全部拟南芥花序侵染完毕后，用塑料薄膜封闭保湿；将拟南芥转至黑暗中保持12小时，转至长日照条件下生长；对侵染过的拟南芥进行日常管理直至拟南芥种子成熟。5.转基因拟南芥种子的筛选首先用70%乙醇+吐温20消毒5min，然后用2. 6% 次氯酸钠浸泡lOmin，随后用无菌水冲洗5次，将消毒后的种子播撒到MS培养基上(含卡那霉素50mg/L)，于4°C放置3天，然后转移到长日照条件下培养，从中可筛选到转基因拟南芥植株。
6.转基因拟南芥的⑶S组织化学染色分析将材料置于⑶S染色液(0. IM磷酸钠缓冲液；IOmMEDTA ；0. 5mM 铁氰化钾；0. 5mM 亚铁氰化钾；ImM X-gluc ；0. 1% Triton X-100) 中，37°C染色，时间不超过12h ；用70%乙醇脱色，直至绿色褪去；镜检照相。7.转基因拟南芥GUS表达的定量分析用GUS提取缓冲液提取材料中的蛋白质， 与⑶S反应液反应15min，然后加入终止液终止反应，在激发光365nm、发射光455nm条件下测各样品的荧光。8.⑶S组织化学染色和荧光测定结果证明，At2S3启动子能在种子相关器官中特异、高效表达。实施例2 :At2S3启动子驱动抗氧化基因表达载体的构建1.提取拟南芥叶片总RNA，反转录成cDNA，用特异引物通过PCR分别扩增获得 MSDl (700bp)、CATl (1504bp)和 HPTl (1197bp)片段。2.将得到的片段分别插入到At2S3启动子下游，构建表达载体。3.构建好的表达载体转化农杆菌GV3101。实施例3 转基因拟南芥的获得及抗氧化胁迫能力分析1.含不同载体的农杆菌分别侵染野生型拟南芥花序。2.对收获的转有不同载体的拟南芥种子分别进行筛选。3.得到的转基因植株种子继续在含卡那霉素的培养基上筛选，直到获得纯合体。4. RT-PCR和酶活性测定分别分析抗氧化基因在转录水平和酶活性水平的表达情况，然后从转化At2S3: :MSD1和At2S3: :CAT1的植株中选择表达水平最高的两株 At2S3: :MSD1 (M7)和At2S3: :CAT1 (C9)，对其进行异花授粉，获得双价转基因株系M7/C9。5.通过高效液相色谱测定转化At2S3: :HPT1的各株系种子内VE含量，选择其中含量最高的一株H3，与双价转基因株系M7/C9杂交，获得三价转基因株系M7/C9/H3。6.对转基因植株的种子进行抗氧化胁迫能力测定在培养基中加入不同浓度的 MV,统计种子萌发率或幼苗成花率；通过NBT染色法分析正常条件下以及经MV处理后的幼苗体内02一含量。
权利要求
1.一种提高种子抗氧化能力及种质改良的方法，其特征在于At2S3启动子能启动GUS 报告基因在种子相关器官中高效特异表达，包括成熟种子、果夹和幼苗子叶。
2.一种提高种子抗氧化能力及种质改良的方法，其特征在于At2S3启动子能驱动抗氧化基因锰-超氧化物歧化酶基因MSDl，过氧化氢酶基因CATl和维生素E生物合成中的关键酶尿黑酸植基转移酶基因HPTl基因在种子中高效表达，显著提高种子的维生素E含量和抗氧化胁迫能力。
3.一种提高种子抗氧化能力及种质改良的方法，其特征在于At2S3启动子能驱动品质和抗逆基因在种子中表达，改良种子品质及种子萌发时的抗逆性。
全文摘要
本发明涉及一种提高种子抗氧化能力及种质改良的方法。应用种子特异启动子At2S3与三个抗氧化基因的重组，提高种子抗氧化能力。At2S3基因的上游1760bp的启动子序列分别融合GUS报告基因、锰-超氧化物歧化酶基因MSD1、过氧化氢酶基因CAT1和维生素E生物合成中的关键酶尿黑酸植基转移酶基因HPT1，转化拟南芥并进行株系杂交。结果表明GUS报告基因在种子中特异、高效表达；单价MSD1(M7)、双价MSD1/CAT1(M7/C9)和三价MSD1/CAT1/HPT1(M7/C9/H3)转基因拟南芥株系在10μM百草枯氧化胁迫处理时的种子萌发率及1μM百草枯氧化胁迫处理时的幼苗成活率均明显高于野生型。因此，该启动子是一个种子特异高效启动子，与三个抗氧化基因的重组，对于种子贮藏期延长、种子品质和抗逆性状改良，具有重要的经济效益和社会效益。
文档编号C12N15/113GK102250896SQ201010268450
公开日2011年11月23日 申请日期2010年8月30日 优先权日2010年8月30日
发明者吴长艾, 杨国栋, 郑成超, 郗冬梅, 黄金光 申请人:山东农业大学