专利名称：调控胚胎干细胞及早期胚胎的胚层分化的方法和试剂的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及调控胚胎干细胞分化及早期胚胎的胚层分化的方法和试剂。
背景技术：
胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ES)是由着床前囊胚内细胞团(Inner Cell Mass, I CM)的细胞在体外分离培养所建成的全能性细胞系。它具有自我更新和发育多能性的特点。一方面通过对称分裂而快速增殖，产生未分化的子代群体；另一方面，能够分化为包括体内三胚层细胞以及生殖细胞在内的多种类型的细胞。这两大特性使ES细胞具有极其重要的基础研究价值和巨大的临床应用前景，可应用于早期胚胎发育过程的研究， 药物毒物筛选，细胞移植治疗，基因治疗等领域。目前的研究表明，外源性LIF-STAT3和 BMP-SMAD通路对于ES细胞维持自我更新具有至关重要的作用。在没有其他因子存在的无血清培养基中，仅仅添力口 LIF(leukemia inhibitor factor)禾口 BMP4(bone morphogenetic protein 4)两种因子便可成功的在体外培养ES细胞。在这种条件下生长的ES细胞具有典型的ES细胞的所有特性。在ES细胞的多能性维持方面，除了外源性信号性分子起关键作用外，以转录因子0ct4，Sox2, Nanog为核心的转录因子调控网络对于ES细胞维持自我更新也具有至关重要的作用。这些转录因子的表达仅存在于早期胚胎发育过程中的多能细胞中，如ICM、Epiblast等。随着胚胎的进一步发育，这些多能细胞逐渐分化成成熟的组织细胞类型而丧失了多能性，而此时这些多能性相关的转录因子的表达也就随之消失。然而调控ES细胞胚层分化的分子机制目前研究不是很清楚，研究仅表明激活ERK-1/2通路可以触发ES细胞进行胚层分化，而抑制这条通路可以不依赖LIF部分维持ES细胞自我更新。但除了 ERK-1/2通路以外，是否有其他信号通路参与调控ES细胞胚层分化目前并不清楚。自我更新和分化多能性是胚胎干细胞的重要特性。但是，ES细胞从维持自我更新到胚层分化转变的分子调控机制目前研究并不清楚。综上，本领域非常有必要研究其它相关的信号通路，以对ES细胞的发育和分化作出更深的了解。
发明内容
本发明的目的在于提供调控胚胎干细胞及早期胚胎的胚层分化的方法和试剂。在本发明的第一方面，提供钙调神经磷酸酶(Calcinuerin)-SK T细胞核因子 (NFAT)信号通路的调节剂的用途，用于制备调节胚胎干细胞(EQ分化和胚胎(特别是早期胚胎)发育的组合物。在另一优选例中，所述的调节剂是抑制剂，其用于制备抑制胚胎干细胞分化和胚胎发育的组合物。在另一优选例中，所述的抑制剂选自(但不限于)环孢素A(CyCl0Sp0rine A, CsA) ；FK506 ；VIVIT ；GM6001 ；PP2 ；特异性干扰钙调神经磷酸酶基因表达的干扰分子(如siRNA)；特异性结合钙调神经磷酸酶的抗体或配体。在另一优选例中，所述的干扰分子是SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2所示序列的分子。在另一优选例中，所述的抑制胚胎干细胞分化和胚胎发育包括抑制胚胎干细胞进行胚层分化；维持胚胎干细胞自我更新。在另一优选例中，所述的调节剂是促进剂，其用于制备促进胚胎干细胞分化和胚胎发育的组合物。在另一优选例中，所述的促进剂是一表达载体，其中含有钙调神经磷酸酶编码基因或活化τ细胞核因子编码基因；或者，所述的促进剂是促进Ca2+信号通路的物质。在另一优选例中，所述的促进胚胎干细胞分化和胚胎发育包括促进胚胎干细胞进行胚层分化。在另一优选例中，所述的早期胚胎是指发育0-4. 5天的胚胎。在另一优选例中，所述的钙调神经磷酸酶包括亚基CnA(包括Ppp3Ca、Ppp3cb、 Ppp3cc)、CnB (包括 Ppp3rl，Ppp3r2)；或所述的活化T 细胞核因子包括 AFAI^cl、NFAjTcZ、NFATc3, NFATc40在另一优选例中，所述的组合物还用于与Erkl/2信号通路共同作用，激活下游靶基因Src或促进上皮-间充质细胞转换(EMT)。、在另一优选例中，所述的钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子信号通路与Erkl/2 信号通路共同作用激活下游靶基因Src或促进上皮-间充质细胞转换。在本发明的另一方面，提供一种筛选(体外筛选)调节胚胎干细胞分化和胚胎发育的潜在物质的方法，所述的方法包括(1)将候选物质与含有钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子信号通路的体系接触；(2)检测候选物质对钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子信号通路的影响；若所述候选物质提高钙调神经磷酸酶和/或活化T细胞核因子的表达或活性，则表明该候选物质是促进胚胎干细胞分化和胚胎发育的潜在物质；若所述候选物质抑制钙调神经磷酸酶和/或活化T细胞核因子的表达或活性，则表明该候选物质是抑制胚胎干细胞分化和胚胎发育的潜在物质。在另一优选例中，步骤(1)包括在测试组中，将候选物质加入到含有钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子信号通路的体系中；和/或步骤( 包括检测测试组的体系中钙调神经磷酸酶和/或活化T细胞核因子的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的含有钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子信号通路的体系；如果测试组中钙调神经磷酸酶和/或活化T细胞核因子的表达或活性在统计学上高于(优选显著高于，如高20%以上，较佳的高50%以上；更佳的高80%以上)对照组，就表明该候选物质是促进胚胎干细胞分化和胚胎发育的潜在物质；如果测试组中钙调神经磷酸酶和/或活化T细胞核因子的表达或活性在统计学上低于(优选显著低于，如低20%以上，较佳的低50%以上；更佳的低80%以上)对照组，就表明该候选物质是抑制胚胎干细胞分化和胚胎发育的潜在物质。
在另一优选例中，所述的体系中不包含Erkl/2信号通路，或者参与Erkl/2信号通路的相关蛋白不表达，或者参与Erkl/2信号通路的相关基因被沉默(注此处为了排除候选物质可能作用于Erkl/2信号通路的情况，该情况没有新颖性)。在另一优选例中，步骤(1)中，所述的体系中还包含Src表达盒，步骤( 包括检测候选物质对Src表达的影响；若所述候选物质促进Src表达，则表明该候选物质是促进胚胎干细胞分化和胚胎发育的潜在物质；若所述候选物质抑制Src表达，则表明该候选物质是抑制胚胎干细胞分化和胚胎发育的潜在物质。在另一优选例中，所述的体系选自细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、 器官体系或动物体系。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、Calcinuerin-NFAT信号通路对于小鼠胚胎干细胞的多胚层分化是必需的。(a)图示为CGR8细胞在文中所示培养条件下培养3. 5天的细胞形态。(b)定量RT-PCR检测(a)中所描述的细胞中基因的表达水平。胚胎干细胞在加有白血病抑制因子(LIF)的培养条件下的mRNA水平设为1。数据的表述为平均值士标准差 (n = 3)。*指示ρ < 0. 05，**指示ρ < 0. 01 (应用非配对t检验)。(c)激光共聚焦图片显示在图中所示培养条件下细胞的Nanog染色结果。标尺 50 μ m0(d)使用磷酸化Mat3和Mat3的特异性抗体检测在LIF撤除和CsA (15 μ Μ)处理时Mat3的活化状况。D1、D3分别表示LIF撤除后第1、3天。(e)图示为 CGR8 细胞在有 / 无 LIF，control-oligo (对照 oligo，获自 Invitrogen ；Stealth RNAi siRNA Negative Control Hi GC (Cat.No. 12935400)； Stealth RNAi siRNA Negative Control Med GC(Cat. No. 12935300) ；Stealth RNAi siRNA Negative Control LO GC(Cat. No. 12935200))和 Ppp3rl_oligo(Ppp3rl_oligol 序列为 UUGUGUAUCUUUCAGAUU⑶UGCCC(SEQ ID NO :1) ；Ppp3rl_oligo2 序列为 UAAAGGGUUCUGCUGUAACUCAGGC (SEQ ID NO :2))条件下的细胞形态。(f)定量RT-PCR检测(e)中所描述的细胞中基因的表达水平。胚胎干细胞在加有 LIF和control-oligo处理条件下的mRNA水平设为1。数据的表述为平均值士标准差(η =3)。统计处理同上。(g) RT-PCR检测来源于CsA处理的ES细胞的类胚体(EB，embryo id body)的标记基因表达情况。Gapdh为RT-PCR的内参。DO、D4、D9分别表示处理后0、4、9天。(h)免疫荧光检测EB贴壁后细胞标记基因表达。使用抗体Soxl7(内胚层)， Nestin (外胚层)和Flkl (内胚层)免疫荧光染色。(i)在含有15微摩CsA培养液中培养的ESC，注入小鼠体内获取畸胎瘤。H&E染色检测畸胎瘤内的组织形态。
(j)来源于CsA处理的含有histone 2B-GFP融合蛋白的ES细胞的18. 5天的嵌合胚。以18. 5天未嵌合小鼠为对照。图2、Calcinuerin-NFAT信号通路在ES细胞分化过程中被激活。(a)定量RT-PCR检测ES细胞在LIF撤除条件下calcinuerin各个调节亚基 (Ppp3ca、Ppp3cb、Ppp3cc、Ppp3rl、Ppp3rf)的mRNA水平。胚胎干细胞在加有白血病抑制因子(LIF)的培养条件下的mRNA水平设为1。数据的表述为平均值士标准差(n =幻。统计处理同上。D2、D4分别表示LIF撤除后第2、4天。(b) RA诱导不同天数(D0-D6)的NFATc 1_4的表达水平。(C)ES细胞在LIF撤除后的NFATcl_4的蛋白表达水平。Tubulin作为内参。(d)免疫荧光检测NFATc3在含有LIF和撤除LIF 3. 5天的ES细胞中的亚细胞定位。DAPI标示细胞核。(e)NFAT :AP_1报告基因在撤除LIF条件下的ES细胞中的活化。报告基因在加LIF 培养的ES中的活性水平设为1。数据的表述为平均值士标准差(n =幻。统计处理同上。图3、CalCinuerin-NFAT信号通路的激活可以促进ES细胞从自我更新状态进入分化状态。(a)图示为ES细胞中过表达激活形式的Calcinuerin(ACnA), NFATc 1-4 (CA-NFATc 1-4)改变的细胞形态。CGR8细胞在转染后筛选3天。(b-c)定量RT-PCR检测(a)中所描述的细胞中基因的表达水平。胚胎干细胞转染了对照载体(Vector，空质粒)的mRNA水平设为1。数据的表述为平均值士标准差(n = 3)。(d)图示为来源于对照细胞和CA_NFATc3过表达细胞的畸胎瘤的形态。(e) RT-PCR检测对照畸胎瘤和来源于CA_NFATc3过表达细胞的出血瘤的基因表达情况。图4、NFAT直接地结合在Src启动子区域，激活其表达水平。(a)定量 RT-PCR 检测在 iNFATc3ES 细胞中通过移除 iTc (0. 5 μ M)诱导 CA_NFATc3 过表达的Src表达模式。对照细胞中的mRNA水平设为1。数据的表述为平均值士标准差 (η = 3)。统计处理同上。(b-c)定量RT-PCR检测在瞬时过表达持续激活形式的calcineriun，NFATcl-4(b) 的细胞中，或者在iRasES细胞中通过加入dox(0. 2μΜ)诱导Hras 1Q61L (HRas) (c)过表达3 天时Src的mRNA水平。对照细胞中的mRNA水平设为1。数据的表述为平均值士标准差 (η = 3)。统计处理同上。(d)定量RT-PCR检测在图示条件下培养3. 5天的细胞中Src的mRNA水平。数据的表述为平均值士标准差(n =幻。统计处理同上。(e)图示为使用Src或IL_2探针和过表达CA_NFATc32天的E14T核裂解液所做的 EMSA检测。(f)使用含有野生型Src启动子的报告基因以及不含或含有NFAT或AP-I位点突变(NFATm或AP-Im)的报告基因做荧光素酶检测。与空载(Vector)共转的野生型Src启动子报告基因活性设为1。数据的表述为平均值士标准差(n =幻。统计处理同上。(g)染色质免疫共沉淀结果显示NFATc3在撤除LIF诱导ES细胞分化或者Tc诱导的CA-NFATc3过表达的ES细胞中结合到Src上游区域。图5、Src对于Calcinuerin-NFAT引起的ES细胞分化是必需的。(a)图示为持续激活形式的Src过表达引起的ES细胞形态改变。CGR8细胞在过表达后筛选3天。Vector为空质粒对照。(b)定量RT-PCR检测过表达Src引起的细胞如(a)所示的标记基因改变。细胞转染了空白载体的基因水平设为1。数据的表述为平均值士标准差(n = 3)。(c) Src抑制剂ΡΡ2能够抑制NFATc3引起的ES细胞分化。图示为iNFATc3ES细胞在所示条件下培养3天的细胞形态。CA-NFATc3的表达水平是由在iNFATc3细胞中撤除Tc 引起的。对照为加iTc,不加抑制剂PP2培养的iNFATc3细胞。(d)定量RT-PCR检测在(c)图中细胞的基因表达水平。对照细胞中未添加PP2的 mRNA水平设为1。数据的表述为平均值士标准差(n =幻。统计处理同上。(e)通过Src特异性的oligo (两段不同序列的oligo)降低Src的水平能够阻断由NFATc3引起的细胞分化。定量RT-PCR检测在含有或不含Src-oligo处理的细胞中的标记基因表达水平。通过在iNFATc3ES细胞中撤除Tc (0. 5 μ M)诱导CA_NFATc3的表达。转有control-oligo的mRNA水平设为1。数据的表述为平均值士标准差(n =幻。统计处理同上。对照组(Control)为加Tc培养，转染对照oligo序列的iNFATc3ES细胞。(f)PP2能够消除ES由LIF撤除所引起的分化。CGR8在图示条件下培养三天的细胞形态。(g)定量RT-PCR检测在(f)图中细胞的基因表达水平。对照细胞中加入LIF培养的ES细胞的mRNA水平设为1。数据的表述为平均值士标准差(n = 3)。统计处理同上。图6、NFAT-Src介导的EMT对于胚层分化是必需的过程。(a)定量RT-PCR检测过表达Src F的CGR8细胞中EMT相关标记基因的表达水平。 转染了对照载体(空质粒，vector)的细胞中的基因水平设为1。数据的表述为平均值士标准差(n = 3)。(b)细胞中过表达Src F引起细胞中E-cadherin的重分布，从细胞膜转移到细胞浆中。iSrcES细胞通过撤除Tc培养三天后检测E-cadherin的表达。对照为加Tc培养的 iSrcES 细胞。(c)通过不同天数诱导ES细胞中NFATc3的表达来监测标记基因的表达的时序性。 定量RT-PCR检测标记基因的表达，对照细胞中的基因表达水平设为1。数据的表述为平均值士标准差(n = 3)。统计处理同上。(d)MMP广谱的抑制剂GM6001能够抑制NFATc3引起的ES细胞的分化。iNFATc3ES 在图中所示条件下培养3天的细胞形态图。标尺100微米。(e)定量RT-PCR检测在(d)图中细胞的基因表达水平。对照细胞中的基因表达水平设为1。数据的表述为平均值士标准差(n =幻。统计处理同上。(f-g) Calcinuerin的抑制剂CsA (f)和Src的抑制剂PP2能够消除LIF撤除所引起的EMT.定量RT-PCR检测EMT相关基因的表达。加LIF培养条件下ES细胞的mRNA水平设为1。数据的表述为平均值士标准差(n =幻。统计处理同上。图7、Calcinuerin-NFAT信号通路对于早期小鼠胚胎的胚层分化是必需的。(a)应用NFATc3和0ct4的抗体对小鼠胚胎进行免疫荧光染色。NFATc3在滋养层(E 3.5)和原始内胚层(E 4.0)出现时定位从细胞浆转入细胞核。0ct4阳性的细胞位于内细胞团中。(b)PP2对于滋养层发育的作用。胚胎从8细胞期开始在不含/含有PP2的条件下培养两天，用0ct4 (绿色)和Cdx2 (红色)的抗体免疫荧光染色。(c)柱状图显示在(b)所示条件下的胚胎内细胞团(ICM)和滋养层(TE)的细胞数目。数据的表述为平均值士标准差(n =幻。统计处理同上。(d)参与ES细胞分化的信号通路的模型。Lineage commitment指胚层分化。图8、LIF刺激对Mat3的动态激活。CGR8细胞在撤除LIF培养12小时。使用磷酸化Mat3和Mat3的抗体检测LIF 刺激和CsA处理后Mat3的动态激活。图^Calcinuerin-NFAT信号通路的其他抑制剂可以保持ES细胞在撤除LIF的条件下的未分化状态。(a) Calcinuerin抑制剂Π(506可以保持ES细胞在撤除LIF的条件下的未分化状态。图示为CGR8细胞在所示培养条件下培养3. 5天的细胞形态。标尺100微米。(b)定量RT-PCR检测(a)中所描述的细胞中基因的表达水平。胚胎干细胞在加有白血病抑制因子(LIF)的培养条件下的mRNA水平设为1。数据的表述为平均值士标准差 (n = 3)。*指示ρ < 0. 05，**指示ρ < 0. 01 (应用非配对t检验)。(c) Calcinuerin-NFAT通路的抑制剂VIVIT可以保持ES细胞在撤除LIF的条件下的未分化状态。图示为CGR8细胞在所示培养条件下培养3天的细胞形态。标尺100微米。(d)定量RT-PCR检测(c)中所描述的细胞中基因的表达水平。胚胎干细胞在加有白血病抑制因子(LIF)的培养条件下的mRNA水平设为1。数据的表述为平均值士标准差 (η = 3)。统计处理同上。图10、Calcinuerin抑制剂CsA可以保持ES细胞在维甲酸(RA)存在的条件下的未分化状态。(aKalcinuerin抑制剂CsA可以保持ES细胞在撤除LIF的条件下的未分化状态。 图示为CGR8细胞在有/无RA(0. ΙμΜ)和CsA (15 μ Μ)存在条件下的细胞形态。标尺100 微米。(b)定量RT-PCR检测(a)中所描述的细胞中基因的表达水平。胚胎干细胞在无 RA处理的培养条件下的mRNA水平设为1。数据的表述为平均值士标准差(n = ；3)。统计处理同上。图11、抑制Calcinuerin-NFAT信号通路可以保持ESC长期的自我更新和全能型。(a)图示为在撤除LIF和添加CsA的培养条件下，40天后ES细胞仍保持典型的未分化形态。标尺100微米。(b)图示为来源于LIF培养和撤除LIF，添加CsA的培养ES细胞的EB形态。标尺 100微米。图12、HRas的过表达能够促进ESC的分化。定量RT-PCR检测过表达HRas 3天的iRasES细胞中标记基因的表达水平。通过在iRasES细胞中加入doxycycline(dox，0. 2μΜ)诱导HRas的表达。对照细胞中的基因表达水平设为1。数据的表述为平均值士标准差(n = 3)。图13、基因芯片分析NFAT相关的基因。(a)受NFAT调控基因的聚类分析。基因在如下过程中存在变化撤除LIFl天和3 天在加入CsA处理条件下撤除LIFl天和3天；通过撤除Tc诱导Δ CnA的过表达1天和4 天。基因的表达水平用颜色来显示，绿色(较低的表达水平)，红色(较高的表达水平)。(b)用DAVID 2008分析富集出来的NFAT下游潜在靶基因可能参与的信号通路。图14、降低Src的水平可以阻断NFATc3引起的ES细胞的分化。(a)通过Src特异性的oligo降低Src的表达可以阻断由CA_NFATc3过表达引起的 ES细胞的分化。图示为iNFATc3ES细胞在所示培养条件下培养的细胞形态。在iNFATc3ES 细胞中撤除iTc (0. 5 μ Μ)诱导CA-NFATc3表达2天。对照组为加Tc培养，转染对照oligo 序列的iNFATc3ES细胞。(b)定量RT-PCR检测(a)中所描述的细胞中全能性标记基因的表达水平。对照细胞中的mRNA水平设为1。数据的表述为平均值士标准差(n =幻。统计处理同上。图15、Src的抑制剂ΡΡ2可以抑制HRas引起的ES细胞分化。(a) ΡΡ2可以保持过表达HRas细胞的未分化状态。图示为iRasES细胞在所示培养条件下培养的细胞形态。(b)定量RT-PCR检测(a)中所描述的细胞中基因的表达水平。对照细胞(非过表达HRas)中的mRNA水平设为1。数据的表述为平均值士标准差(n =幻。统计处理同上。图16、EMT能够诱导ES细胞发生分化。(a)过表达CA-NFAiTc 1-4的CGR8中EMT相关基因上升。定量RT-PCR检测mRNA水平，细胞中转染了空载(Vector)的mRNA设定为1。数据的表述为平均值士标准差(n = 3)。(b)过表达HRas所引起的EMT相关标记基因的表达水平。在iRasES细胞中加入 dox (0. 2 μ Μ)诱导Hras 1Q61L (HRas)的表达3天。对照细胞(非过表达HRas)中mRNA设定为1。数据的表述为平均值士标准差(n = 3)。(c)诱导CA-NFAI~C3的过表达引起的ES细胞分化时E-cadherin的重新分布。 E-cadherin的免疫荧光染色为红色。蓝色的DAPI标示核。(d)撤除LIF引起的ES细胞分化E-cadherin的重新分布。E-cadherin的免疫荧光染色如(c)所示。图17、EMT对于撤除LIF引起的ES细胞分化是必需的。(a)MMP广谱的抑制剂GM6001能够部分的阻断ES细胞由撤除LIF引起的细胞分化。CGR8细胞在所示条件下培养的细胞形态。(b)定量RT-PCR检测过表达Src引起的细胞如(b)所示的标记基因改变。对照细胞的基因水平设为1。数据的表述为平均值士标准差(n =幻。统计处理同上。
具体实施例方式本发明人经过广泛的研究，首次揭示激活Calcinuerin-NFAT信号通路与胚胎干细胞(EQ的分化或自我更新密切相关，激活该通路可以促发ES细胞进行胚层分化，而抑制这条信号通路可以长期维持ES细胞自我更新。在ES细胞中，Calcinuerin-NFAT信号通路参与激活下游靶基因Src，促进上皮-间充质细胞转换(印ithelial-mesenchymal transition, EMT)。而EMT潜在地是ES细胞早期胚层分化必经的过程。本发明人还发现， Calcinuerin-NFAT信号通路在胚胎早期胚层分化过程中也被激活，并且抑制它可以影响胚胎的正常发育。如本文所用，所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构
成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上
由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。Calcinuerin-NFAT 信号通路钙调神经磷酸酶(Calcinuerin)属丝/苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员(又称蛋白磷酸酶2b，pp2b)，是迄今发现的唯一受Ca2+/钙调素(cam)调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶。Calcinuerin广泛分布于包括心脏在内的全身组织中，是一种广泛分布的、参与多种细胞功能调节的多功能信号酶，在细胞因子介导的T细胞活化中起到调节枢纽的作用；在神经递质的释放、突触可塑性方面亦具有重要的调节作用；特别是新近研究表明， Calcinuerin介导的信号通路Calcinuerin-NFAT在心肌肥大的发生发展中可能起到中心作用。Calcinuerin包括包括两个亚基CnA (催化亚基)、CnB (调节亚基)；其中亚基CnA 包括Ppp3ca (氨基酸序列参GenBank登录号NP_032939. 1)、Ppp3cb (氨基酸序列参GenBank 登录号NP_032940. 1)、Ppp3cc三种(氨基酸序列参GenBank登录号NP_032941. 1)；亚基 CnB包括Ppp3rl (氨基酸序列参GenBank登录号NP_077779. 2),Ppp3r2两种(氨基酸序列参GenBank登录号NP_001004025. 1)。Ppp3rl可以使下游基因NFAT去磷酸化、被激活进入细胞核。活化T细胞核因子(NFAT)是一种Ca2+调节性转录因子，位于静息细胞的胞浆内。 NFAT在免疫反应中对诱导基因转录起重要作用。除T细胞外，这类蛋白质还可以在许多免疫细胞上进行表达。其活性受到Calcinuerin的调节。所述的活化T细胞核因子包括NFAT cl (氨基酸序列参GenBank登录号NP_001157581. 1) ,NFAT c2 (氨基酸序列参GenBank登录号 ΝΡ_001032254· 1)、NFAT c3 (氨基酸序列参 GenBank 登录号 ΝΡ_0!35031· 2)、NFAT c4 (氨基酸序列参GenBank登录号NP_001161818. 1)。由于NFAT的DNA结合能力比较弱，它通常和其他转录因子共同激活靶基因，其中最重要的共同因子是AP-I (R)s/Jun，Erkl/2的底物)。在体内，胞浆的Ca2+浓度上升到一定水平激活Calcinuerin，继而活化 Calcinuerin-NFAT信号通路。根据现有技术的报导，所述的Calcinuerin-NFAT信号通路参与多种体内机制且与多种疾病相关，例如其参与调节苯肾上腺素诱导的VSMCs增生肥大， 其在心肌肥大中的作用。然而，其是否与胚胎干细胞或胚胎发育相关还没有在先揭示。为了寻找调控ES细胞胚层分化的未知通路，本发明人应用了 PB转座子这一突变筛选工具。发现当PB转座子突变ES细胞内源基因Ppp3rl后，在撤去LIF诱导ES细胞分化条件下，ES细胞不能进行正常的胚层分化，而能维持自我更新状态。这提示基因Ppp3rl 在调控ES细胞胚层分化方面有重要作用。在发明中，利用Calcinuerin-NFAT信号通路抑制剂和RNA干涉(RNA interference, RNAi)等方法表明，Calcinuerin-NFAT信号通路的激活对促发ES细胞和早期胚胎进行而胚层分化是充分而且必需的，机制上，它和Erkl/2通路共同激活下游靶基因Src，进一步促进上皮-间充质细胞转换(epithelial-mesenchymaltransition, EMT)。而EMT潜在地是ES细胞早期胚层分化必经的过程。Calcinuerin-NFAT信号通路的调节剂及其用途如本文所用，所述的Calcinuerin-NFAT信号通路的调节剂包括任何可调节 Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白(包括Calcinuerin或其亚基或类似物，NFAT蛋白或其亚基或类似物)的活性或表达的试剂。例如，所述的Calcinuerin-NFAT信号通路的调节剂包括了 调节Calcinuerin (或其亚基)和/或NFAT (或其亚基)的调节剂。所述的调节剂包括了促进剂和抑制剂。如本文所用，所述的Calcinuerin-NFAT信号通路的促进剂包括了上调剂、激活剂、激动剂等。任何可提高Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白的活性、维持 Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白的稳定性、促进Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白的表达、 延长Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白有效作用时间、或促进Calcinuerin-NFAT信号通路基因的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于促进Calcinuerin-NFAT信号通路的激活的有效物质。如本文所用，所述的Calcinuerin-NFAT信号通路的抑制剂包括了下调剂、阻滞剂、阻断剂、拮抗剂等。任何可降低Cal c inuer in-NFAT信号通路蛋白的活性、降低 Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白的稳定性、抑制Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白的表达、 减少Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白有效作用时间、或抑制Calcinuerin-NFAT信号通路基因的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于抑制Calcinuerin-NFAT信号通路的激活的有效物质。作为本发明的优选方式，所述的Calcinuerin-NFAT信号通路的促进剂例如是一表达载体，所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白的编码基因及与之操作性相连的表达调控序列。所述表达载体在转入细胞后表达 (或过表达)Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白。作为本发明的另一优选方式，所述的Calcinuerin-NFAT信号通路的促进剂为该通路的上游效应物质，例如，所述的促进剂是Ca2+或在体内可形成Ca2+的物质。当Ca2+浓度上升到一定水平后，可激活Calcinuerin，继而活化Calcinuerin-NFAT信号通路。作为本发明的优选方式，所述的Calcinuerin-NFAT信号通路的抑制剂是(但不限于)特异性抗Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白的抗体，所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，只要其对于Calcinuerin-NFAT信号通路中任一种蛋白具有特异性结合能力， 且能够通过与Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白的结合而抑制Calcinuerin-NFAT信号通路的激活；或特异性抑制Calcinuerin-NFAT信号通路中任一种蛋白的编码基因的转录或翻译的干扰分子或反义核苷酸。针对已知蛋白或已知基因的干扰分子或反义核苷酸的制备方法是本领域人员熟知的。本发明还提供了 Cal c inuer in-NFAT信号通路蛋白的促进剂的用途。所述的 Calcinuerin-NFAT信号通路的促进剂用于制备调节Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白的组合物。例如，所述的Calcinuerin-NFAT信号通路的促进剂通过促进Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白的表达或活性，促进Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白的激活，进而发挥调节ES 细胞或胚胎(特别是早期胚胎)的发育、分化。本发明还提供了 Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白的抑制剂的用途。所述的Calcinuerin-NFAT信号通路的抑制剂用于制备抑制Calcinuerin-NFAT信号通路的激活的组合物。例如，所述的Calcinuerin-NFAT信号通路的抑制剂通过抑制Calcinuerin-NFAT 信号通路蛋白的表达或活性，抑制Calcinuerin-NFAT信号通路的激活，进而抑制胚胎干细胞进行胚层分化；维持胚胎干细胞自我更新。筛选调节Calcinuerin-NFAT信号通路的潜在物质在得知了所述的Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白对于调节胚胎干细胞或胚胎发育的用途后，可以基于该特征来筛选通过调节Calcinuerin-NFAT信号通路的活性或表达调节胚胎干细胞或胚胎发育的物质。因此，本发明提供一种筛选可用于调节胚胎干细胞或胚胎发育的潜在物质的方法，所述的方法包括将候选物质与表达Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白的体系接触；和检测候选物质对Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白的影响；若所述候选物质可提高Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是可用于促进 Calcinuerin-NFAT信号通路的潜在物质；若所述候选物质可降低Calcinuerin-NFAT信号通路的表达或活性，则表明该候选物质是可用于抑制Calcinuerin-NFAT信号通路的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达Calcinuerin-NFAT信号通路的体系。较佳地，为了排除其它相关信号通路对于药物筛选的潜在干扰，所述的体系中不包含Erkl/2信号通路，或者参与Erkl/2信号通路的相关蛋白不表达，或者参与Erkl/2信号通路的相关基因被沉默。作为本发明的优选方式，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细胞试验或动物试验，以进一步选择和确定对于调节Calcinuerin-NFAT信号通路有用的物质。本发明所述的体系包括但不限于细胞(包括原核细胞，真核细胞)或细胞培养物体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于调节 Calcinuerin-NFAT信号通路的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库。组合物本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0. 00000 l-50Wt% ；较佳的 0. 00001-20wt % ；更佳的，0. OOOl-IOwt % )的所述的 Calcinuerin-NFAT 信号通路蛋白，或其促进剂或抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可直接用于调节 Calcinuerin-NFAT信号通路。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。本发明的组合物含有安全有效量的Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白或其促进剂或抑制剂，以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。本发明所述的Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白或其促进剂或抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于所述的Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白或其促进剂或抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白或其生物活性片段每天以约 0. 00001-50mg/kg动物体重(较佳的0. OOOl-lOmg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。本发明的主要优点在于首次证明Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白是调控胚胎干细胞或胚胎发育的重要分子，能够影响胚胎干细胞的分化和自我更新。可通过Calcinuerin-NFAT信号通路蛋白或其促进剂或抑制剂来调控胚胎干细胞或胚胎发育。本发明人研究表明NFAT和Erkl/2信号通路形成控制ES细胞进行胚层分化信号开关，对研究ES细胞从维持自我更新到胚层分化转变的分子调控机制提供了途径。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。材料和方法哺乳动物细胞CGR8，E14T 小鼠胚胎干细胞系，获自由剑桥大学。iRasES cells 小鼠胚胎干细胞系，获自美国波士顿儿童医院。i Δ CnAES, iNFATc3ES和iSrcES cell小鼠胚胎干细胞系根据发育生物学RIKEN中心提供的Rosa-Tet四环素诱导系统建立，发育生物学RIKEN中心提供了 Rosa-Tet四环素诱导系统相关质粒和母细胞系。Rosa-Tet四环素诱导系统构建如下1、质粒构建分别从包含相应基因片段的质粒Δ CnA/pPyCAGIP (对应i Δ CnAES细胞)， CA-NFAI^cS/pPyCAGIP (对应 iNFATc3ES)和 Src F/pPyCAGIP (对应 iSrcES)中获得目的基因片段，然后通过》ιο I和Not I插入交换载体PPthC-0ct3/4(获自发育生物学RIKEN中心)。2、Lipo2000 转染
(I)Rosa-Tet四环素诱导系统母细胞系在-Tc，+hygromycin B 150μ g/ml条件下培养2 3天后，以1 X IO6密度铺入6孔板，+Tc 1 μ g/ml, -hygromycin B培养。(2)24h 后，5μ g 目的基因质粒 pPthC+2y g pCAGGS-Cre+15y 1 Lipo2000 转染。
(3) 24h 后，传入 IOcm 皿。3、24h 后，力口入 1. 5μ g/ml Puromycin, +Tc 1 μ g/ml 蹄选。4、约一周后，空白对照组细胞完全死亡，从转染组挑选约10个克隆。5、挑选克隆时，分出部分细胞进入M孔板进行检验。(1)分出的克隆在M孔板内-Tc，+Puromycin培养。(2) 36h 后，力口 150 μ g/ml hygromycin B。(3) 2 4天后，如克隆细胞死亡，则为正确重组子。6、将步骤5鉴定出的正确重组子进行连续扩增培养，培养条件为1.5yg/ mlPuromycin,1 μ g/ml Tc。7、筛选扩增的克隆细胞在-Tc，+Puromycin 1. 5 μ g/ml条件下诱导3 4天，即可 Western检测(可提高Puromycin量至7. 5 μ g/ml以提高诱导表达量)。质粒PB转座子系统获自复旦大学。pPyCAGIP载体真核细胞表达载体，获自剑桥大学。NFAT =AP-I 荧光素酶报告基因，pBJ5_CnA，pENTRll CA NFATl，pENTRll CANFAT2 获自哈佛大学医学院。pRL-TK :Promega。Src-P(1. 9K)/pGL3-Enhancer，Src-P(1. 9K)AP-lm/pGL3-Enhancer 获自 Nara Institute of Science and Technology。pMEmX-Δ (CRI_SP12)获自东京大学。ρ⑶NA3_NFATc4获自新加坡国立大学。pRc/CMV_SrcF5^获自范德毕尔特大学医学院。ACnA/pPyCAGIP 将质粒pBJ5_CnA通过Bgl II和Β ο I酶切，获取酶切片段亚克隆至pPyCAGIP载体的相应位点中。CA-NFATcΙ/pPyCAGIP 由质粒 pENTRllCA NFATl 通过 Xho I 和 EcoR I 酶切位点亚克隆至pPyCAGIP载体。CA-NFATc2/pPyCAGIP 由质粒 pENTRllCA NFAT2 通过I 和 Xba I 酶切位点亚克隆至pPyCAGIP载体。CA-NFATc3/pPyCAGIP 由质粒 pMEmX- Δ (CRI_SP12)通过 EcoR I 和 BanH I 酶切位点亚克隆至pPyCAGIP载体。CA-NFATc4/pPyCAGIP 由质粒 pCDNA3_NFATc4 通过 Mlu I 和 EcoR I 酶切位点亚克隆至pPyCAGIP载体。Src F/pPyCAGIP 由质粒 pRc/CMV_SrcF5^ 通过 EcoR I 和 Xho I 酶切位点亚克隆至pPyCAGIP载体。Src-P (1. 9K) NFATm/pGL3_Enhancer :以质粒 Src-P (1. 9K) /pGL3_Enhancer 为模板，通过引物 src NFATm F :CACTATGCTGCCCACGTAT GGTCTCCTGGGAGACAT(SEQ ID NO 3)和src NFATm R :CATACGTGG GCAGCATAGTGAGTCAGACTGATCTGA (SEQ ID NO 4) PCR 突变 NFAT 蛋白结合位点。
0186
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主要抗体
NFATcl 抗体ab2796，Abcam ；
NFATc2 抗体ab2722，Abcam ；
NFATc3 抗体:sc-8321, SantaCruz ；
NFATc4 抗体=#2183, Cell Signaling ；
Cdx2 iKW :MU392A-UC, BioGenex Laboratories ；
α -tubulin 抗体T5168, Sigma,
Flk 抗体:sc-6251, SantaCruz,
Soxl7 抗体AF1924，R&D,
Nestin 抗体:MAB353, Chemicon,
Stat3 抗体#4904, Cell Signaling,
Phospho-Stat3 抗体#9131, Cell Signaling ；
0ct4抗体为多克隆抗体，常规方法将0ct4蛋白免疫兔获得。
辣根过氧化酶标记的二抗Jackson Immuno Research ；
免疫染色用焚光二抗:Jackson Immuno Research。
主要抑制剂
Calcinuerin 抑制剂 CsA :#C-900, Alomone ；
Calcinuerin 抑制剂 FK506 :ALX-380-008-M025, Alexis ；
NFAT 抑制剂 VIVIT :480401, Calbiochem ；
Src 抑制剂 PP2 :EI-297, BIOMOL ；
各种蛋白酶抑制剂及PMSF均为Sigma产品。
主要细胞培养相关试剂
细胞培养基及各种添加成分=Gibco ；
月台牛血清 FBS (fetal bovine serum) :Hyclone ；
白血病 Φ制因子 LIF(Leukemia inhibitory factor) :ESGR0，Chemicon 胰酶-EDTA Jnvitrogen ； 明胶 gelatin :Sigma ；
细胞转染试剂 LipofectAMINE 2000 =Invitrogen ；
puromycin Amresco ；
G418 Promega ；
Tetracyclin(Tc) :Sigma ；
retinoid acid (RA) Sigma.
主要生化试剂、酶及试剂盒
各种限制性内切酶=Takara ；
T4DNA 连接酶Takara ；
RNA 逆转录酶ReverTra Ace reverse transcriptase ； RNA 酶抑制剂 Rnase inhibitor =Toyobo ；
Taq DNA聚合酶及反应缓冲液=NuoHua ；高保真 DNA 聚合酶 pfu :Promega ；SYBR Green PCR Mast Mix :ABI ；TRIzol Jnvitrogen ；质粒大量抽提纯化试剂盒=QIAGEN ；荧光封片剂DAK0 ；质粒DNA分离纯化试剂盒及DNA胶回收试剂盒博大泰克；蛋白定量试剂盒BCA Protein Assay Kit =Pierce ；ECL 反应 i式齐[J 盒:SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce ；电泳迁移率实验(EMSA)试剂盒Pierce。感受态细菌的制备和质粒DNA的制备感受态细菌的制备(氯化铷法)用接种环挑取少许冻存的菌种接种在固体LB琼脂平板上，37°C培养12 15小时。挑取单克隆，接种到30ml SOB液体培养基中，在摇床上37°C培养过夜(12 15小时)。 次日取菌液8ml接种到200ml SOB中，在摇床上37°C振荡培养至OD59tl = 0. 3 0. 5。将菌液置于盐冰浴中15分钟，然后4°C离心，4000g，5分钟。用6細1预冷的缓冲液I重悬细菌， 盐冰浴15分钟后，4°C离心，4000g，5分钟。用16ml预冷的缓冲液II在冰上重悬细菌，然后立即分装到预冷的Ep管中，每支lOOul，用液氮速冻后，存于-80°C备用。制备感受态细菌所用的溶液SOB(IL)蛋白胨20g，酵母抽提物5g，NaCl 0. 6g，KC10. 5g。高压蒸汽灭菌后，加入过滤灭菌的MgCl2至终浓度10mM，MgSO2至终浓度10mM。缓冲液I (IL) =RbCl 12g, MnCl2 · 4H20 9. 9g, CaCl2 · 2H20 1. 5g,甘油 150g, KAc30mM。用0. 2M HAc调pH值至5. 8，滤器过滤除菌后储存于4°C备用。缓冲液II(IL) :M0PS 20ml of 0. 5M stock (pH 6· 8)，RbCl 1. 2g，CaCl2 · 2Η20 llg，甘油150g。滤器过滤除菌后储存于4°C备用。质粒的大量制备按质粒纯化试剂盒OiIAGEN plasmid maxi kit)要求进行，简述如下取2.5ml已鉴定正确的菌液接种入250ml LB中，37°C，200_250rpm，振荡培养16h。 收集菌液，7000rpm，4°C，离心，lOmin。弃上清，在细菌沉淀中加入IOml溶液Pl (含foiase A)，打勻沉淀。加入IOml溶液P2，轻缓倒置离心管4-5次，静止％iin。加入预冷的溶液P3 轻缓倒置离心管4-5次。12000rpm, 4°C，离心，20min,取上清，并重复一次。将上清移至预先用10ml QBT缓冲液平衡过的柱子上。QC缓冲液洗柱，每次30ml，共2次。用15ml缓冲液QF 洗脱质粒。加入10. 5ml异丙醇混勻后，15000g，4°C，离心30min，沉淀DNA。70% (ν/ν)乙醇洗涤，离心，去净乙醇。干燥DNA，待其变透明，用适量无菌去离子水溶解。测定沈0歷/^80歷 OD值，鉴定质粒浓度和纯度。最后用适当的限制性内切酶酶切质粒，电泳鉴定结果。细胞基因组DNA的提取稳定转染有PB转座子的ES细胞撤除LIF培养而仍然不分化的克隆挑取出来，单克隆至M孔板，依次扩增至12孔板和6孔板。用0. 25% (ν/ν)胰酶消化成单细胞，PBS洗CN 102382796 A
说明书
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一遍后，重悬细胞于100 μ 1 PBS或TE缓冲液中。用细胞基因组DNA小量提取试剂盒(博大泰克)抽提细胞基因组DNA。具体操作过程如下(1)在细胞悬液中加入试剂盒中的100 μ 1裂解液和10 μ 1蛋白酶K/RNase A ；(2)振荡混勻；(3) 55 °C水浴锅中裂解Ih ；(4)加入 10 μ 1 3Μ NaAc 和 1250 μ 1 结合缓冲液；(5)振荡混勻(必须非常充分直至出现大量絮状物)；(6) 15000g,离心 5min ；(7)取上清，分两次过柱；(8)漂洗三次，每次用600 μ 1漂洗液；(9) 15000g，离心!3min，去除残留乙醇；(10)加30-40 μ 1灭菌水或洗脱缓冲液进行洗脱。所得基因组DNA，取2μ1经1 40稀释后，用紫外分光光度计进行定量，_20°C保存备用。PB转座子突变ES细胞内源基因Ppp3rl为了寻找调控ES细胞胚层分化的未知信号通路，本发明人应用了 PB转座子突变筛选系统。将PB转座子和转座酶通过电转整合入ES细胞，随机突变内源基因。由于LIF 对于维持小鼠ES细胞的自我更新具有重要的作用，将ES细胞撤除LIF培养，诱导其发生分化。本发明人推测如果PB转座子突变了分化必须的基因将导致一些ES细胞不能分化而会生长形成克隆。将这些未分化的克隆挑选出来，通过iverse PCR鉴定出被突变的基因。反向PCR鉴定PB(PiggyBac)转座子插入的基因由于PB转座子属于非复制转座，它转座时能携带一段基因组DNA，在PB转基因载体上设计一对引物(RFl和RRl)，利用基因组DNA上普遍存在的Msp I或Hae III酶识别位点将基因组DNA切成很多片段，这些DNA片段经过自连成环后，就能作为模板进行反向PCR 鉴定出PB转座子所插入的基因。此过程包括基因组DNA酶切、自连环化、反向PCR和测序鉴定4个主要步骤。(1)酶切Msp I 或 Hae III (Takara)，37°C，酶切过夜；(2)Msp I或Hae III酶切过夜的产物，各取5 μ 1进行0. 7% (w/v)的琼脂糖凝胶电泳以确定是否酶切完全。完全酶切的产物跑胶，其条带总体呈弥散状，其中可见一条或两条明显的条带；(3)80°C,20min灭活限制性内切酶；(4)酶切产物自连成环4°C，过夜。(5)力卩40 μ 1 3Μ NaAc和Iml无水乙醇至自连产物中，混勻，_20°C，过夜(沉淀 DNA)；(6) 4"C，18000g,离心 15min ；(7)去上清，用200 μ 1 70% (ν/ν)乙醇洗DNA沉淀；(8)去上清，空气中干燥IOmin ；(9)用50无菌水溶解DNA样品，55°C，lh，使其充分溶解；(该样品可保存于-20°C 备用)
(10)以酶切后的基因组DNA为模板进行反向PCR (11)1% (w/v)琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，切下大于484bp (经Hae III酶切) 或588bp (经Msp I酶切)的条带，并根据博大泰克胶回收试剂盒说明书回收DNA片段，直接送公司测序或将其构建至PGEM-T easy载体中(ftOmega)，再经PCR鉴定，送测序；(12)PCR鉴定是以Ιμ 菌液为模板，用RFl和RRl引物进行PCR扩增，体系同步骤(10)的反向PCR，程序为55°C变性，72°C延伸45sec，35个循环，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离；(13)利用NCBI网站将测序结果与小鼠基因组进行比对，以确定PB在基因组上插入的具体位置。细胞培养CGR8、E14T ES 细胞系培养于 GMEM(Glasgow Minimum Essential Medium)中，含 10% (w/v)FBS，100U/ml青霉素，100μ g/ml链霉素，2mM L-谷氨酰胺，0. ImM非必需氨基酸， ImM丙酮酸钠，1，000U/ml LIF和0. ImMβ -巯基乙醇(Sigma)。培养ES细胞的培养皿需用 0. 1% (w/v)lXPBS明胶溶液预先包被。i Δ CnAESdNFAI^^ES 和 iSrcES 细胞系培养于 GMEM (Glasgow Minimum Essential Medium)中，含 10% FBS, lOOU/ml 青霉素，100 μ g/ml 链霉素，2mM L-glutamine, 0. ImM 非必需氨基酸，ImM丙酮酸钠，l，000U/ml LIF、0. ImMβ -巯基乙醇(Sigma)、0· 5 μ g/ml四环素 (Tc)。培养ES细胞的培养皿需用0. 1% IXPBS明胶溶液预先包被。撤除四环素(Tc)培养可以诱导激活的Calcinuerin、NFATc3和Src表达。小鼠胚胎成纤维细胞MEF原代细胞取自ICR小鼠13. 5天胚胎，传代培养2-4代，经 Co60射线照射或丝裂霉素C处理，将细胞计数后冻存或铺盘。MEF细胞均培养于含10% (w/ ν) FBS (fetal bovine serum, HyClone)、lOOU/ml 青霉素和 100 μ g/ml 链霉素(Invitrogen) 白勺 DMEM(Dulbecco’ s Modified Eagle' s Medium, Invitrogen)巾。
照一定密度铺至明胶预处理的培养皿或孔板备用。iRasES 细胞系培养于 DMEM(high glucose, Hyclone)中，含 10% FBS(HyClone)， 100U/ml # M S,100 μ g/ml ^MM (Invitrogen),2mM L-glutamine(Invitrogen), 0. ImM 非必需氨基酸 anvitrogen)，1，OOOU/ml LIF (Chemicon)和 0. ImM β -巯基乙醇 (Invitrogen)，并置于铺有MEF饲养层的培养皿中生长。细胞冻存与复苏细胞冻存细胞消化后计数，离心收集后按适当比例加入预冷的细胞冻存液，以每管1-1. 5ml加入细胞冻存管，细胞冻存管转入冻存盒并置于-70°C冰箱过夜，次日转入液氮罐进行长期冻存。冻存液配置将DMSO(按10%体积)加入相应细胞的培养液中，并混勻静置片刻。细胞复苏从液氮中取出冻存管，迅速投入37°C水浴中化解，溶解90%时将管内细胞移至含有培养液(37°C预热)的离心管中，离心收集细胞，去除上清后，加入适量相应培养液重悬后铺板。细胞转染采用ES细胞电转方法或脂质体转染(Lipof ectAMINE 2000转染试剂盒， Invitrogen)。
RT-PCR 及实时定量 PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)RT-PCR用TRIZOL (Invitrogen)抽提细胞总RNA，紫外分光光度计定量后取4 μ g总RNA以 oligo (dT) 15为第一链引物，用ReverTra-Ace (Τ0Υ0Β0，Japan)逆转录酶逆转录得到cDNA。
反应体系及过程如下oligo (dT) 15 2μ 1RNA 4 μ gDEPC H2O 补至 20 μ 170°C 5min (立即取出置冰上)5 X RT 缓冲液10 μ 1dNTP(IOmM) 3μ 1ReverTra-Ace 2 μ 1RNase 抑制剂1 μ 1DEPC H2O 14 μ 1总体积50 μ 142 °CIhPCR反应在20 μ 1体系中进行，含2 μ 1 cDNA模板，正反向引物各250nM， 200 μ MdNTP混合物，1单位Taq酶(华诺)。PCR程序为95 V首轮变性!Bmin ；95 V变性 30sec，在序列特异性的温度下(一般通用60°C )复性30sec，72°C延伸30sec，适当循环后， 72°C延伸5min。PCR产物经含有溴化乙锭(ethidium bromide,EB)的2%琼脂糖凝胶电泳分离后，紫外凝胶成像分析仪(Syngene)分析并拍照。实时定量PCR制备反应混合物(10 μ 1反应体系按照一定比例稀释过的cDNA模板2 μ 1，正反向引物3yl，2XSTOR Green I master mix 5 μ 1)，在实时定量PCR仪上扩增40个循环数。 为了排除不同样品上样量的差异造成的影响，每个基因的Ct值都用看家基因GAPDH的Ct 值进行校正° 数据用 Sequence Detection System 2. 0 software (ABI, Foster City, CA, USA)进行分析。基因芯片(micro-array)收取如下样品CRR8ES细胞撤除LIF培养0、1、3天；撤除LIF加抑制剂CsA培养 0、1、3天；i ACnAESES细胞系撤除四环素Tc)诱导表达Acan 0、1、4天。样品裂解于Iml TRIZOL中，保存于-80°C。共收集两批样品用于基因芯片(联合基因公司的Illumina芯片， Mouse-6V3)检测分析。yk^J^^^Mli^ (Chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)小鼠ES细胞培液中加入37% (ν/ν)甲醛至终浓度(ν/ν)，室温轻晃10分钟促进交联反应。加入甘氨酸至终浓度125mM，室温处理5分钟以终止交联反应。然后收集细胞，加入细胞裂解缓冲液(5mM PIPS pH 8. l,85mM KC1,0. 5% (w/v)NP-40，ImMPMSF)，置于冰上10分钟。以5，OOOrpm离心4分钟，得到细胞核沉淀，然后加入细胞核裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8. 1, IOmM EDTA, 1% (v/v) SDS, ImM PMSF)，置于冰上 10 分钟(可取少量于显微镜下观察裂解程度)。将核裂解液稀释后用超声仪超声处理，使染色质DNA打断至平均长度为0. 5 21Λ，14，OOOXg离心20分钟，取上清。将上清用稀释缓冲液10倍稀释，然后用 protein A s印harose (预先经lmg/ml BSA和0. lmg/ml ssDNA处理过)预清除后，加入对照IgG或识别目的蛋白的特异性抗体，混勻后在4°C旋转孵育过夜。次日，加入蛋白A琼脂糖(经lmg/ml BSA和0. lmg/ml ssDNA处理过)结合并沉淀反应中的抗体_目的蛋白-染色质复合物，然后依次用透析缓冲液OmM EDTA, 50mM Tris-Cl pH 8. 0,0. 2% Sarkosyl (w/ ν))洗涤两次，免疫沉淀洗涤缓冲液(IOOmM Tris-HCl pH 7. 5,25mM EDTA, 1. 25% SDS)洗涤4次。最后，染色质DNA用免疫沉淀洗脱缓冲液(50mM NaHCO3,1 % SDS)于65°C洗脱10 分钟，加入RNase A和NaCl于67°C解交联4 5小时，蛋白酶K于45°C消化2小时，乙醇沉淀获得DNA，用于PCR分析。荧光素酶报告基因实验(Luciferase Reporter Assay)CGR8ES细胞(1. 2 X IO5)培养于M孔板中。24小时后，利用脂质体LipofectAMINE 2000 (Invitrogen)转染报告基因质粒QOOng)，并转染pRL-TK (IOng) (Promega)作为内参照。转染48小时后，裂解细胞，按照双荧光素酶活性分析试剂盒的操作说明检查报告基因的活性(Promega)。将所得到的目的报告基因活性值除以内参的数值以校正转染效率，得到荧光素酶活性值。细胞总蛋白的制备与定量蛋白样品的准备收集细胞，用预冷的PBS洗2次，根据细胞量加入适当体积的裂解缓冲液 (50mMTris-Cl, pH 7. 5,150mM NaCl，2mM EDTA, 10% (ν/ν)甘油，0· 5% Nonidet Ρ-40, ImM NaF, ImM phenylmethylsulfonyl fluoride)裂解，12，000rpm，4°C离心 10 分钟，吸取上清
液，进行总蛋白定量。细胞总蛋白定量利用BCA(bicinchoninic acid)法蛋白浓度定量试剂盒(BCA，Protein Assay Kit)对细胞总蛋白进行定量。反应原理为碱性条件下，蛋白可将Cu2+还原为Cu+，Cu+与 BCA试剂与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定样品在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度，并且不受样品中离子型和非离子型去污剂影响。在酶标板中加入标准蛋白(如BSA 0μ g,4y g,8y g,12y g,16y g,20y g)及待测样品。每孔加入 BCA反应液(Reagent A与Reagent B按50 1比例混合)200 μ 1，混勻样品与反应液，将酶标板置于56°C孵育15分钟；冰上冷却，利用酶标仪测562nm光吸收值，做出标准曲线，并读出待测样品的浓度。免疫印迹分析(Western blotting)BCA定量后，每个样品取一定的总蛋白量并补加裂解缓冲液至相同体积，加4X 上样缓冲液 QOOmM Tris-Cl, pH7. 4,8% SDS,20% (ν/ν) β-巯基乙醇、40% (ν/ν)甘油、 0. 04% (ν/ν)溴酚蓝)，煮沸lOmin，上样，进行SDS-PAGE电泳分离或保存于_20°C备用。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)的配制根据第二版《分子克隆实验指南》(科学出版社)第883页表18. 3制备所需浓度(8%或10% (w/v))的下层分离胶，根据第二版《分子克隆实验指南》(科学出版社)第883页表18. 4制备浓度为4% (w/ ν)的上层压缩胶。电泳样品在浓缩胶时电泳电压为80V，当样品在两层胶的交界处压缩成一条直线后将电压升至120V。根据样品的溴酚蓝前沿位置确定所需要的电泳时间。转膜用电转移方法O60mA转池或者400mA转2h)将凝胶内的蛋白转移到硝酸纤维膜上，丽春红染色检查转膜效率。封闭用含有5% (ff/v)脱脂牛奶/TBS-T缓冲液室温封闭lh。一抗以适当稀释度稀释于含5%脱脂牛奶的TBS-T缓冲液中，室温孵育池或4°C 过夜。TBS-T缓冲液清洗3次，每次5min。二抗将相应的抗兔或抗鼠的二抗以适当稀释度稀释于含5%脱脂牛奶的TBS-T 缓冲液中，室温孵育1 1.证。TBS-T缓冲液清洗3次，每次5min。压片根据信号强弱在膜上滴加Pierce或Millipore公司的ECL化学发光底物， 然后用X光片曝光，经冲片机自动显影定影。Western Blot 所用试剂蛋白胶30% (ν/ν)丙烯酰胺、10 % (ν/ν)过硫酸铵、10 % (w/v) SDSUM Tris-Cl (pH6. 8)、1. 5M Tris-Cl (pH8. 8)。IOXRunning Buffer =Tris 0. 25M、Glycine 1. 92M、SDS 1 %，加水定容至 1000ml。10XTBS-T :Tris-Cl(pH7. 6)0. 2M、NaCl 1. 37M, Tween-201% (v/v)，加水定容至 1000ml。IXTransfer Buffer =Tris 0. 025M、Glycine 0. 129M、甲醇(v/v) 20%，加水定容至 IOOOml0IX 上样缓冲液Tris-Cl 50mM(pH7. 4)、2 % SDS、5 % β -巯基乙醇、10 % 甘油、
0.01%溴酚蓝。Stripping Buffer β -巯基乙醇(v/v)0. 8%,SDS 2%,Tris 0· 06Μ，HCl 调 ρΗ 至 6. 7，加水定容至100ml。电泳迁移率变动实验(EMSA)合成Src启动子区域寡核苷酸探针序列，并于5’末端标记生物素(biotin)。合成反向互补寡核苷酸序列并与标记的正向序列混合发生退火反应，形成双链DNA。反应条件为在退火缓冲液(IOmM HEPES，pH7. 8，10mM MgCl2O. ImM EDTA)中 100°C反应 5 分钟，并缓慢降至室温以利于双链DNA的形成。形成的双链DNA可于3%琼脂糖凝胶电泳鉴定。将CA_NFATc3/pPyCAGIP电转入的E14T ES细胞系，48小时后收集细胞，提取核蛋白。与标记的寡核苷酸探针在室温如下条件(IOmM Tris-HCl, pH 7. 5,50mM KCl,50mM NaCl, ImM MgCl2, ImM EDTA, 5mM DTT和5%甘油)结合15分钟。根据Pierce试剂盒操作手册进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，通过化学发光核酸检测试剂盒(Pierce)检测核酸蛋白结合条带。类胚体(EmbryoidBody, EB)形成实验小鼠ES细胞消化计数。取0. 5-1 X IO6细胞置于IOcm不贴壁的培养皿中悬浮培养，所用培养基为不含LIF的ES细胞培养基。悬浮的ES细胞可于2天后形成多个EB球体， 并随着时间增加，体积和形态有所变化。在不同的时间点，观察EB形态、拍照或收集EB用于PCR、Wfestern blotting以及免疫染色分析。^iia^Tt^fe^iiT (Immunoflourescence staining)将细胞传代并生长于铺有玻片(Fisher Scientific)的培养皿中，染色时取出玻片，PBS洗后以4%多聚甲醛/PBS室温固定15分钟，PBS洗三遍，0. 2% (v/v) TritonX-IOO/ PBS于室温10分钟通透细胞膜；用3% BSA(w/v)/PBS室温封闭30分钟后，加入3% BSA/ PBS稀释至适当浓度的一抗，4°C孵育过夜。次日，PBS 3X5分钟洗去一抗，加针对一抗的荧光二抗(Jackson Immuno Research)，室温孵育1小时，PBS 3X5分钟洗去二抗，以IOOng/ ml DAPI处理5分钟标记细胞核，PBS洗后用荧光封片剂(DAKO)封片，以倒置荧光显微镜观察并拍照，或置于4°C保存。小鼠胚胎组织化学染色小鼠胚胎在4% (w/v) PFA (PBS配制)中固定10分钟。用1 X PBS漂洗3_5次后置于0.25% Triton X-IOO室温通透处理8分钟。1 XPBS漂洗3-5次，2% BSA封闭处理30 分钟。然后加入0. 1% Tween-20与特异性抗体，4°C孵育过夜。IXPBS漂洗3_5次，加入荧光标记二抗室温孵育1小时后用DAPI复染细胞核。1 XPBS漂洗3-5次后封片，激光共聚焦显微镜观察胚胎染色情况。嵌合胚胎实验(chimeric embryo Assay)将无添加LIF用抑制剂长期培养绿色荧光标记的ES细胞系CGR8通过显微操作仪注射入E3. 5小鼠的囊胚中，并移植入假孕2. 5天的ICR雌鼠子宫内。经过体内发育，E18. 5 时期的移植胚胎从母体取出，检测绿色荧光的表达。H&E ^cfe (hematoxylin and eosin staining)切片于自来水中冲洗片刻，ddH20泡1分钟。滴加苏木精染色液染5分钟(可于光镜下观察染色强度，时间可有所增减)，自来水冲洗片刻。(v/v)HCl/100% (ν/ν)乙醇分化3-5秒，镜下见细胞质兰色变浅即可，自来水冲洗片刻。95%乙醇，2分钟0次)；100% 乙醇，2分钟0次)。伊红染液处理1分钟，自来水冲洗片刻。二甲苯乙醇(1 1)，2分钟；二甲苯，2分钟0次)；树胶(配于二甲苯中)封闭，保存。数据统计图中数据为平均值士标准差(mean士S. D.)。统计学比较采用student's t检验， P < 0. 05认为具有统计学的差异，ρ <0.01认为具有显著的统计学差异。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1、Calcinuerin-NFAT信号通路对ES细胞胚层分化是必需的PB转座子突变ES细胞内源基因Ppp3rl后，在撤去LIF诱导ES细胞分化条件下， ES细胞不能进行正常的胚层分化，提示Calcinuerin-NFAT信号通路在调控ES细胞胚层分化方面潜在地有重要作用。为验证这个假设，本发明人用Calcinuerin抑制剂CsA处理ES细胞，并在添加 LIF (+LIF)或撤除LIF(-LIF)的情况下检测细胞形态和基因表达。ES细胞撤除LIF培养后细胞形态发生明显分化，胚层分化标志基因Fgf5、Cdx2、Dab2、NestiruT和Mixll都有显著升高而多能性标志基因0ct4、Nanog和Rexl都有下降(图la、b)。染色实验也表明基因 Nanog的蛋白水平在撤除LIF培养后也显著下降(图Ic)。而抑制剂CsA的处理可以有效地阻断由撤除LIF引起的ES细胞分化表型(图la-c)。相反，CsA并不影响撤除LIF引起的的去磷酸化，只是阻断ES细胞分化引起的Mat3蛋白总量的下降(图Id ；图8)。 Calcinuerin其他两个抑制剂Π(506和VIVIT同样都可以阻断去LIF引起ES细胞分化(图 9)。为了排除抑制剂的非特异性，通过RNA干涉下调基因Ppp3rl同样可以抑制去LIF引起的ES细胞分化(图le、f)。除此之外，抑制剂CsA还可以阻断维甲酸(retinoic acid,RA) 引起的ES细胞分化(图10)。因此Calcinuerin-NFAT信号通路对各种外在刺激引起的ES 细胞胚层分化都是必需的。本发明人进一步研究在撤除LIF情况下，CsA能够长期维持ES细胞的自我更新。 ES细胞在无LIF加CsA情况培养40天后，仍然可以维持未分化形态(图1 la)。这些细胞撤除CsA后悬浮培养仍可形成具有三胚层分化能力的类胚体(embryoid bodies, EB)(图lg、 h ；图lib)。将CsA长期培养ES细胞注射入裸鼠体内也可以形成具有三胚层分化能力的畸胎瘤(图Ii)。最后，将这些细胞用绿色荧光标记，注射入小鼠囊胚，可以观察到有绿色荧光的嵌合胚胎(图Ij)。因此，抑制Calcinuerin-NFAT信号通路可以不依赖LIF，长期维持ES细胞自我更新。实施例2、Calcinuerin-NFAT信号通路在ES细胞分化过程中被激活本发明人进一步检测了 Calcinuerin-NFAT信号通路在ES细胞分化过程的的表达情况。Calcinuerin各亚基转录水平在ES细胞去LIF引起的分化过程中均有上升(图加)。蛋白质印迹(western blot)和芯片数据表明在小鼠ES细胞中NFAT家族成员中的NFATc3和NFATc4处于高表达水平。NFATc4蛋白水平在ES细胞分化过程中显著上升，而 NFATc3蛋白水平一直处于高表达(图2b、c)。值得注意的是，NFATc3在未分化的ES细胞中定位于细胞浆，而撤除LIF后定位于细胞核(图2d)，表明在ES细胞分化过程中NFATc3被激活。本发明人进一步检测了含有NFAT AP-I结合位点的鼠源112启动子荧光素酶报告基因活性，发现撤除LIF显著提高报告基因活性(图加)，表明NFAT信号通路在ES细胞分化过程中被激活。由于NFATc3在ES细胞中处于高表达，且分化后很快被激活，在后续实验中在NFAT家族成员中将重点研究这个基因。实施例3、Calcinuerin-NFAT信号通路促发ES细胞发生胚层分化为研究Calcinuerin-NFAT信号通路的激活能否促发ES细胞发生分化，本发明人在ES细胞中过表达激活形式的Calcinuerin(ACnA)和NFATcl-4 (CA_NFATcl_4)。引人注意的是，在添加LIF的情况下，在转染后ES细胞发生明显分化(图3a)。CA-NFATc 1-4过表达显著降低多能性标志基因(0ct4、Nanog和Rexl)，而提高分化标志基因，特别是滋养层(CdX2，Handl)和原始内胚层(Gata6，Ihh)。相对的Δ CnA过表达引起的分化要弱于CA-NFATc 1-4(图北、c)。有趣的是激活Calcinuerin-NFAT信号通路引起的ES分化表型和激活Ras通路引起的十分相似(图12)。进一步将过表达激活形式NFATc3的ES细胞注射入裸鼠体内，形成出血的畸胎瘤(图3d)。 逆转录聚合酶链式反应实验(RT-PCR)表明过表达CA_NFATc3细胞形成的畸胎瘤跟对照相比滋养层和原始内胚层相关标志基因上升最为显著，而其他胚层标志基因变化不大(图!Be)。因此，激活Calcinuerin-NFAT信号通路可以充分的诱导ES细胞发生早期分化。 实施例4、NFAT直接激活基因Src的表达为了寻找Calcinuerin-NFAT信号通路调节的下游基因，本发明人进行了 NFAT信号通路抑制和激活情况下的生物芯片研究，发现168个基因受NFAT通路上调控，138个基因受NFAT通路下调控。本发明人将这些基因进行信号通路分析，发现焦点粘附和细胞骨架调节通路受NFAT调节最为显著(图13a、b)。寻找NFAT直接下游基因，本发明人将上述两个信号通路中的基因的启动子进行NFAT和其常见共同因子AP-I的结合位点预测。发现基因Src启动子区域含有保守的NFAT和AP-I结合位点，而且AP-I结合位点已有文献证实。 基因Src是一个非受体络氨酸激酶，抑制剂PP2可以抑制它的活性。文献报道Src在调节细胞迁移和延伸方面起重要作用，但它在ES细胞中研究却很少。为研究Src是否是NFAT 的下游基因，本发明人在CA-NFATc3的诱导表达细胞系(iNFATc3ES细胞系)中研究了两者的关系。本发明人发现，诱导CA-NFATc3表达后，可以迅速激活Src的表达(图如)。过表达激活形式的Calcinuerin、NFATc 1-4和Ras也均可以提高Src表达(图4b、c)。而且 Calcinuerin抑制剂CsA在去LIF分化过程中可以抑制Src表达的升高(图4d)。因此Src 的表达是受NFAT信号通路调节的。为研究NFAT是否直接调节Src的表达，本发明人用包含NFAT结合位点的Src启动子探针，和过表达CA-NFATc3的ES细胞核裂解液进行了电泳迁移率实验(EMSA)。实验表明蛋白NFATc3可以和Src探针形成DNA-蛋白复合物，当加入NFATc3抗体时还可以形成抗体胶移动(supershift)(图如)，这和阳性对照探针112的结果是一致的，表明蛋白NFATc3 在体外可以直接结合到Src启动子区域。荧光素酶报告基因实验进一步表明NFAT和AP-I结合位点对NFATc3激活Src的表达是必需的(图4f)。染色质免疫共沉淀(ChIP)实验表明，NFATc3在撤除LIF或过表达CA_NFATc3引起的ES细胞分化过程中，均可以体内结合到Src启动子区域(图4g)。因此，NFAT直接激活下游基因Src的表达。实施例5、Src对Calcinuerin-NFAT信号通路引起的ES细胞分化是必需的Src是NFAT信号通路的下游基因，那么它对NFAT诱导的ES分化是否必需呢。本发明人首先在ES细胞中过表达Src的活性形式(Src F)，它可以快速诱导ES细胞发生分化(图如)，多能性标志基因显著降低，而分化标志基因，特别是滋养层和原始内胚层明显提高(图恥)，这和过表达激活形式的NFAT或者Ras引起的表型是是十分相似的。本发明人进一步实验发现Src抑制剂PP2也可以从细胞形态和分子标志基因上完全阻断NFATc3引起的ES细胞分化(图5c、d)。为了排除抑制剂的非特异性，通过RNA干涉下调基因Src同样可以抑制NFATc3引起的ES细胞分化(图k和图14)。除此之外，Src抑制剂PP2还可以阻断撤除LIF或者过表达激活的Ras弓丨起的ES细胞分化(图5f、g和图15)。因此，基因Src和NFAT和Ras —样对诱导ES细胞分化是充分和必需的。实施例6、NFAT-Src介导的EMT对ES细胞分化是一个必要的阶段因为Src在多种细胞中可以诱导上皮-间充质细胞转换即EMT，而且许多EMT诱导因子(Tgf β，Fgf家族，Ras-Erkl/2)都可以诱导ES细胞分化，因此提示Src通过诱导EMT 而促发ES细胞分化。本发明人发现，Src在促发ES细胞分化的同时，也可以激活EMT相关标志基因 (Igf2、SIP1、Ncad和Snail)的表达。其中作为EMT重要组成部分基质金属蛋白酶(Mmp) 的表达也有明显升高(图6a)。E-cadherin是上皮细胞的重要标志基因，在ES细胞未分化状态定位于细胞膜，Src引起ES细胞分化后，E-cadherin定位发生变化，在细胞浆出现表达(图6b)。作为Src的上游激活通路，激活NFAT或Ras通路同样可以诱导EMT相关标志基因的升高(图16a、b)。而且在过表达CA-NFATc3或者撤除LIF引起的ES细胞分化过程中，E-cadherin的定位也发生同样的变化(图16c、d)。因此，Src在促发ES细胞分化的同时也诱导EMT的发生。为研究EMT和ES细胞分化之间的关系，本发明人进行了 CA_NFATc3诱导ES细胞分化不同时间点的研究。发现EMT相关标志基因在诱导表达CA-NFATc31天后升高，早于ES 细胞分化标志基因1. 5天的升高和多能性标志基因3天的降低(图6c)，表明EMT早于ES 细胞分化发生。本发明人进一步用MMP广谱的抑制剂GM6001 (Merck)抑制EMT过程，发现GM6001 也可以阻断NFATc3弓丨起的ES细胞分化(图6d、e)，而且可以部分阻断撤除LIF弓丨起的ES 细胞分化(图17)。而且，Calcinuerin抑制剂CsA和Src抑制剂PP2也可以有效的阻断撤除LIF引起的EMT相关标志基因的上升，提示它们通过抑制EMT过程而维持ES细胞的自我更新。实施例7、Calcinuerin-NFAT信号通路的激活对早期胚胎发育是必不可少的最后，本发明人在早期小鼠胚胎水平上研究了 Calcinuerin-NFAT信号通路的表达和功能。植入前阶段的小鼠胚胎包含三种细胞类型滋养层，原始内胚层和上胚层。胚胎染色表明NFATc3在上胚层这些未分化细胞中定位于细胞浆，为非活性形式，而在滋养层和 4. 5天胚胎的原始内胚层这些分化细胞中被激活，进入于细胞核。与之相反，多能性标志基因0ct4只在上胚有表达(图7a)。因此NFAT信号通路在胚胎早期发育中被激活。为研究Calcinuerin-NFAT信号通路在早期小鼠胚胎发育中的功能，本发明人用 Calcinuerin抑制剂CsA和Src抑制剂PP2处理8细胞期的小鼠胚胎。小鼠胚胎在8细胞阶段用抑制剂处理，2天后观察囊胚腔的形成。实验表明，它们能不同程度的阻断囊胚腔的形成，使胚胎发育阻滞在桑椹胚阶段(表1)。表1、抑制剂CsA和PP2对囊胚腔形成的作用
权利要求
1.钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子信号通路的调节剂的用途，用于制备调节胚胎干细胞分化和胚胎发育的组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的调节剂是抑制剂，其用于制备抑制胚胎干细胞分化和胚胎发育的组合物。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂选自环孢素A；FK506 ； VIVIT ；GM6001 ；PP2 ；特异性干扰钙调神经磷酸酶基因表达的干扰分子；特异性结合钙调神经磷酸酶的抗体或配体。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的调节剂是促进剂，其用于制备促进胚胎干细胞分化和胚胎发育的组合物。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的促进剂是一表达载体，其中含有钙调神经磷酸酶编码基因或活化T细胞核因子编码基因；或者，所述的促进剂是促进Ca2+信号通路的物质。
6.如权利要求1-5任一所述的用途，其特征在于，所述的钙调神经磷酸酶包括亚基=CnA ；或所述的活化T细胞核因子包括AFAI^cl、NFAjTcZ、NFATc3, NFATc40
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于激活下游靶基因Src 或促进上皮-间充质细胞转换。
8.一种筛选调节胚胎干细胞分化和胚胎发育的潜在物质的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)将候选物质与含有钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子信号通路的体系接触；(2)检测候选物质对钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子信号通路的影响；若所述候选物质提高钙调神经磷酸酶和/或活化T细胞核因子的表达或活性，则表明该候选物质是促进胚胎干细胞分化和胚胎发育的潜在物质；若所述候选物质抑制钙调神经磷酸酶和/或活化T细胞核因子的表达或活性，则表明该候选物质是抑制胚胎干细胞分化和胚胎发育的潜在物质。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括在测试组中，将候选物质加入到含有钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子信号通路的体系中；和/或步骤( 包括检测测试组的体系中钙调神经磷酸酶和/或活化T细胞核因子的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的含有钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子信号通路的体系；如果测试组中钙调神经磷酸酶和/或活化T细胞核因子的表达或活性在统计学上高于对照组，就表明该候选物质是促进胚胎干细胞分化和胚胎发育的潜在物质；如果测试组中钙调神经磷酸酶和/或活化T细胞核因子的表达或活性在统计学上低于对照组，就表明该候选物质是抑制胚胎干细胞分化和胚胎发育的潜在物质。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的体系中还包含Src表达品.，步骤( 包括检测候选物质对Src表达的影响；若所述候选物质促进Src表达，则表明该候选物质是促进胚胎干细胞分化和胚胎发育的潜在物质；若所述候选物质抑制Src表达，则表明该候选物质是抑制胚胎干细胞分化和胚胎发育的潜在物质。
全文摘要
本发明涉及调控胚胎干细胞及早期胚胎的胚层分化的方法和试剂。首次揭示激活Calcinuerin-NFAT信号通路与胚胎干细胞(ES)的分化或自我更新密切相关，激活该通路可以促发ES细胞进行胚层分化，而抑制这条信号通路可以长期维持ES细胞自我更新。
文档编号C12N5/0735GK102382796SQ20101026830
公开日2012年3月21日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者朱莉莉, 李翔, 金颖 申请人:中国科学院上海生命科学研究院