人胚胎干细胞向胰腺内胚层的分化的制作方法

人胚胎干细胞向胰腺内胚层的分化的制作方法
【专利摘要】本发明提供了促进多能干细胞分化的方法。具体地讲，本发明提供产生胰腺内胚层细胞群的方法，其中未分化多能细胞的初始接种密度被限定。
【专利说明】人胚胎干细胞向胰腺内胚层的分化
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年5月7日提交的美国临时专利申请序列号61/643, 684的权益， 所述美国临时专利申请全文以引用方式并入本文用于任何目的。

【技术领域】
[0003] 本发明在细胞分化领域中。更具体地讲，本发明提供各种范围的接种密度的人多 能细胞和/或表达指示定形内胚层的标志物的细胞，其可用于随后高效生成表达指示胰腺 内胚层的标志物的细胞和表达指示胰腺内分泌的标志物的细胞。

【背景技术】
[0004] 用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集 中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或0细胞的来源上。一种方法是从多能干细 胞，例如胚胎干细胞产生功能性0细胞。
[0005] 在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三 个胚层（外胚层、中胚层和内胚层）的一组细胞。组织例如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝将从 内胚层经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞 表达多种标志物，例如HNF3P、GATA4、MIXL1、CXCR4和S0X17。
[0006] 到原肠胚形成为止，内胚层划分成可通过一组因子的表达来识别的前-后域，所 述因子独特标志内胚层的前、中和后区。例如，Hhex和Sox2鉴定内胚层的前区，而Cdxl、2 和4鉴定内胚层的后半部分。
[0007] 内胚层组织的迁移使内胚层与不同的中胚层组织紧密接近，这帮助肠管的区域 化。这通过多种分泌因子例如？6?、1拉、16?-8、视黄酸（狀）和81^配体及其拮抗剂来完成。 例如，FGF4和BMP促进预定的后肠内胚层中的Cdx2表达并阻遏前基因Hhex和S0X2的表达 (2000Development，127 :1563-1567)。WNT信号传导也已显示与FGF信号传导平行工作， 以促进后肠发育并抑制前肠命运（2007Development，134:2207-2217)。最后，由间充质分 泌的视黄酸调节前肠-后肠边界（2002CurrBiol，12:1215-1220)。
[0008] 特异性转录因子的表达水平可用于指定组织的身份。在定形内胚层转化成原肠管 的过程中，肠管变得区域化成广泛域，所述广泛域可通过限制性基因表达模式在分子水平 上进行观察。例如，肠管中区域化的胰腺域显示I3DX-I的极高表达以及⑶X2和S0X2的极 低表达。相似地，高水平的Foxel的存在指示食道组织；在肺组织中高度表达的是NKX2. 1 ; S0X2/0ddl(OSRl)在胃组织中高度表达；PROXl/Hhex/AFP的表达在肝组织中比较高；S0X17 在胆道结构组织中高度表达；PDX1、NKX6. 1/PTfla和NKX2. 2在胰腺组织中高度表达；并且 CDX2的表达在肠组织中高。上文概括摘自DevDyn2009,238:29-42和AnnuRevCellDev Biol2009,25 :221-251。
[0009] 胰腺的形成起于定形内胚层分化成胰腺内胚层（2009AnnuRevCellDevBiol, 25 :221-251 ;2009DevDyn，238:29-42)。背侧和腹侧胰腺域起于前肠上皮。前肠也产生 食道、气管、肺、甲状腺、胃、肝、胰腺和胆管系统。
[0010] 胰腺内胚层的细胞表达胰-十二指肠同源盒基因roxi。在不存在roxi时，胰腺形 成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，roxi表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。 除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来 自胰腺内胚层的分化。
[0011]D'Amour等人描述了在高浓度激活素和低血清的存在下，产生人胚胎干细胞（ES) 衍生的定形内胚层的富集培养物（NatureBiotechnol2005,23:1534-1541;美国专利 7, 704, 738)。将这些细胞移植在小鼠的肾囊下导致分化成具有内胚层组织特征的更成熟的 细胞（美国专利7, 704, 738)。在添加FGF-IO和视黄酸后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层 细胞还可分化成I3DXl阳性细胞（美国专利公布2005/0266554A1)。这些胰腺前体细胞在免 疫缺陷小鼠的脂肪垫中的后续移植导致在3-4个月成熟期后形成功能胰腺内分泌细胞（美 国专利7, 993, 920和美国专利7, 534, 608)。
[0012]Fisk等人报道用于由人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统（美国专利7, 033, 831)。 在这种情况下，分化途径分成三个阶段。人胚胎干细胞首先使用丁酸钠和激活素A的组合 而分化成内胚层（美国专利7,326,572)。然后将细胞和与￡6?或0细胞素〇3的 &(^11111111) 结合的bmp拮抗剂例如头蛋白一起培养，以生成roxi阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。
[0013] 小分子抑制剂也已用于诱导胰腺内分泌前体细胞。例如，TGF-B受体和BMP受体 的小分子抑制剂（Development2011,138 :861-871;Diabetes2011,60:239-247)已用 于显著提高胰腺内分泌细胞的数目。另外，小分子活化剂也已用于生成定形内胚层细胞 或胰腺前体细胞（CurrOpinCellBiol2009,21:727-732;NatureChemBiol2009,5: 258-265)。
[0014] 虽然已在改善由人多能干细胞生成胰腺细胞的方案方面取得重大进展，但不同团 队所报道的有关由ES细胞生成胰腺细胞的效率的结果存在很大程度的可变性。该可变性 归因于多种因素，诸如ES细胞系的差异、方案（包括所用的试剂）的持续时间、以及贴壁培 养与悬浮培养的选择。我们在此证实了虽然引导ES细胞分化成定形内胚层的效率对于细 胞密度并不非常敏感，但生成胰腺内胚层的效率高度依赖于ES细胞的初始接种密度。具体 地讲，在0. 8-2XIO5个细胞/cm2范围内的初始细胞密度导致胰腺内胚层和内分泌标志物的 最商表达。


【发明内容】

[0015] 在一个实施例中，本发明涉及培养多能干细胞的方法，该方法包括将多能干细胞 接种于表面上，其中以约0. 8XIO5个细胞/cm2至约3. 0XIO5个细胞/cm2的密度接种多能 干细胞。在一些实施例中，所培养的多能干细胞是胚胎干细胞。在一些实施例中，所培养的 多能干细胞是人胚胎干细胞。在一些实施例中，接种多能干细胞的表面包括Matrigel?。 [0016] 在一个实施例中，本发明涉及使多能干细胞分化的方法，该方法包括将多能干细 胞以约0. 8XIO5个细胞/cm2至约3.OXIO5个细胞/cm2的密度接种于表面上，以及使多能 干细胞分化成表达指示定形内胚层的标志物的细胞。在一些实施例中，所分化的多能干细 胞是胚胎干细胞。在一些实施例中，所分化的多能干细胞是人胚胎干细胞。在一些实施例 中，接种多能干细胞的表面包括Matrigel?。在一些实施例中，表达指示定形内胚层的标志 物的细胞是人的。
[0017] 在一个实施例中，本发明涉及获得表达指示定形内胚层的标志物的细胞的方法， 该方法包括使以约0. 8XIO5个细胞/cm2至约3. 0XIO5个细胞/cm2的接种密度接种于表面 上的多能干细胞分化。在一些实施例中，在获得表达指示定形内胚层的标志物的细胞的方 法中使用的多能干细胞是胚胎干细胞。在一些实施例中，在获得表达定形内胚层特征性标 志物的细胞的方法中使用的胚胎干细胞是人胚胎干细胞。在一些实施例中，多能干细胞接 种在包括Matrigel?的表面上。在一些实施例中，表达指示定形内胚层的标志物的细胞是 人的。
[0018] 在一个实施例中，本发明提供使表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化的方 法，该方法包括使已以足以使多能干细胞向表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化的效 率最大化的接种密度接种于第一表面上的多能干细胞分化，以及通过将表达指示定形内胚 层的标志物的细胞以足以使表达指示定形内胚层的标志物的细胞向表达胰腺内胚层特征 性标志物的细胞分化的效率最大化的接种密度接种于第二表面上，使表达指示定形内胚层 的标志物的细胞分化成表达指示胰腺内胚层的标志物的细胞。在本发明的一些方面中，足 以使多能干细胞向表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化的效率最大化的接种密度为 约0. 8XIO5个细胞/cm2至约3.OXIO5个细胞/cm2。在本发明的一些方面中，足以使表达 指示定形内胚层的标志物的细胞向表达胰腺内胚层特征性标志物的细胞分化的效率最大 化的接种密度为约I. 5XIO5个细胞/cm2至约5. 0XIO5个细胞/cm2。在一些实施例中，在 使细胞分化的方法中使用的多能干细胞是胚胎干细胞。在本发明的一些实施例中，在使细 胞分化的方法中使用的胚胎干细胞是人胚胎干细胞。在本发明的一些实施例中，接种多能 干细胞的第一表面包括Matrigel?。在本发明的一些实施例中，接种表达指示定形内胚层 的标志物的细胞的第二表面包括Matrigel?。在本发明的一些实施例中，表达指示定形内 胚层的标志物的细胞是人的。在本发明的一些实施例中，表达指示胰腺内胚层的标志物的 细胞是人的。
[0019] 在一个实施例中，本发明涉及使表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化成表达 指示胰腺内分泌的标志物的细胞的方法，该方法包括使已以约〇. 8XIO5个细胞/cm2至约 3.OXIO5个细胞/cm2的接种密度接种于表面上的多能干细胞分化成表达指示定形内胚层 的标志物的细胞，以及使表达定形内胚层的标志物的细胞分化成表达指示胰腺内分泌的标 志物的细胞。在本发明的一些方面中，用于分化成表达指示定形内胚层的标志物的细胞的 多能干细胞是胚胎干细胞。在一些实施例中，用于分化成表达指示定形内胚层的标志物的 细胞的胚胎干细胞是人胚胎干细胞。在一些实施例中，将用于分化成表达指示定形内胚层 的标志物的细胞的多能干细胞接种于包括Matrigel?的表面上。
[0020] 在一个实施例中，本发明涉及获得表达指示胰腺内胚层的标志物的细胞的方法， 该方法包括将多能干细胞接种于表面上，使多能干细胞分化成表达指示定形内胚层的标 志物的细胞，将表达指示定形内胚层的标志物的细胞接种于表面上，以及使表达指示定形 内胚层的标志物的细胞分化成表达指示胰腺内胚层的标志物的细胞。在本发明的一些 方面中，将在获得表达指示胰腺内胚层的标志物的细胞的方法中使用的多能干细胞以约 0. 8XIO5个细胞/cm2至约3. 0XIO5个细胞/cm2的密度接种于表面上。在本发明的一些方 面中，将表达指示定形内胚层的标志物的细胞以约I. 5XIO5个细胞/cm2至约5.OXIO5个 细胞/cm2的密度接种于表面上。在本发明的一些方面中，分化成表达指示定形内胚层的标 志物的细胞的多能干细胞是胚胎干细胞。在本发明的一些方面中，分化成表达指示定形内 胚层的标志物的细胞的胚胎干细胞是人胚胎干细胞。在本发明的一些方面中，将多能干细 胞接种于包括Matrigel?的表面上。在本发明的一些方面中，将表达指示定形内胚层的标 志物的细胞接种于包括Matrigel?的表面上。
[0021] 在一个实施例中，本发明涉及获得表达指示胰腺内分泌的标志物的细胞的方法， 该方法包括将多能干细胞接种于表面上；使多能干细胞分化成表达指示定形内胚层的标志 物的细胞；以及使表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化成表达指示胰腺内分泌的标志 物的细胞。在本发明的一些方面中，将在获得表达指示胰腺内胚层的标志物的细胞的方法 中使用的多能干细胞以约〇.8XIO5个细胞/cm2至约3. 0XIO5个细胞/cm2的密度接种于表 面上。在本发明的一些方面中，将表达指示定形内胚层的标志物的细胞以约I. 5XIO5个细 胞/cm2至约5. 0XIO5个细胞/cm2的密度接种于表面上。在本发明的一些方面中，分化成表 达指示定形内胚层的标志物的细胞的多能干细胞是胚胎干细胞。在本发明的一些方面中， 分化成表达指示定形内胚层的标志物的细胞的胚胎干细胞是人胚胎干细胞。在本发明的一 些方面中，将多能干细胞接种于包括Matrigel?的表面上。在本发明的一些方面中，将表达 指示定形内胚层的标志物的细胞接种于包括Matrigel?的表面上。
[0022] 在一个实施例中，本发明涉及使表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化的方 法，该方法包括将表达指示定形内胚层的标志物的细胞以约1.5XIO5个细胞/cm2至约 5.OXIO5个细胞/cm2的接种密度接种于表面上，以及使表达指示定形内胚层的标志物的细 胞分化成表达指示胰腺内胚层的标志物的细胞。在本发明的一些方面中，所使用的细胞是 人的。
[0023] 本发明提供了通过0. 8XIO5个多能细胞/cm2至3XIO5个多能细胞/cm2的逐步分 化而体外获得的表达指示胰腺内胚层谱系的标志物的细胞群。
[0024] 在本发明的一个实施例中，通过0. 8XIO5个多能细胞/cm2至3XIO5个多能细胞/ cm2的逐步分化而体外获得表达指示胰腺内分泌谱系的标志物的细胞。
[0025] 在本发明的一个实施例中，通过以1.5XIO5个细胞/cm2至5XIO5个细胞/cm2的 密度接种于表面上的表达指示定形内胚层的标志物的细胞的逐步分化而体外获得表达指 示胰腺内胚层谱系的标志物的细胞。
[0026] 在本发明的一个实施例中，通过以I. 5XIO5至5XIO5个细胞/cm2接种于表面上 的表达指示定形内胚层的标志物的细胞的逐步分化而体外获得表达指示胰腺内分泌谱系 的标志物的细胞。

【专利附图】

【附图说明】
[0027] 图IA至图IF示出了以0?3XIO5个细胞/cm2 (图1A)、0. 75XIO5个细胞/cm2 (图 18)、1父105个细胞/〇112(图1〇、1.5\105个细胞/〇11 2(图10)、1.8\105个细胞/〇112(图 1E)和2XIO5个细胞/cm2(图1F)接种的Hl细胞的CXCR4(Y轴，DE的标志物）和CD-9(X 轴，未分化ES细胞的标志物）的FACS直方表达谱。
[0028] 图2A至图2G示出了如实例1所概述的以各种密度接种并随后分化为DE的人胚胎 干细胞系Hl的细胞中的下列基因的表达的实时PCR分析的数据：S0X7(图2A)、NANOG(图 2B)、0CT4 (图 2C)、AFP(图 2D)、S0X17 (图 2E)、F0XA2 (图 2F)和CXCR4 (图 2G)。
[0029] 图3A-3H示出了在诱导以如下各种细胞密度接种的DE之前培养物的相衬图像： 0? 3XIO5 个细胞 /cm2 (图 3A)、0? 5XIO5 个细胞 /cm2 (图 3B)、0? 75XIO5 个细胞 /cm2 (图 3C)、 0. 9XIO5 个细胞/cm2 (图 3D)、1XIO5 个细胞/cm2 (图 3E)、1.IXIO5 个细胞/cm2 (图 3F)、 1. 2XIO5 个细胞 /cm2 (图 3G)和I. 5XIO5 个细胞 /cm2 (图 3H)。
[0030] 图4A-4G示出了初始以如下各种ES细胞的细胞密度接种的DE第4天培养物的 相衬图像：〇? 3X105个细胞/cm2(图4A)、0. 5X105个细胞/cm2 (图4B)、0. 75X105个细胞 /cm2 (图 4C)、IXIO5 个细胞 /cm2 (图 4D)、I.IXIO5 个细胞 /cm2 (图 4E)、I. 2XIO5 个细胞 / cm2 (图 4F)和I. 5XIO5 个细胞 /cm2 (图 4G)。
[0031] 图5A-5F示出了初始以如下各种ES细胞的细胞密度接种的第5阶段培养物的相 衬图像：5X104个细胞/cm2 (图5A)、7. 5X104个细胞/cm2 (图5B)、1X105个细胞/cm2 (图 5C)、I. 5XIO5 个细胞 /cm2 (图OT)、I. 8XIO5 个细胞 /cm2 (图 5E)和 2. 0XIO5 个细胞 /cm2 (图 5F)。
[0032] 图6A至图6J示出了如实例2所概述的以各种密度接种并随后分化为第5阶段 的人胚胎干细胞系Hl的细胞中的下列基因的表达的实时PCR分析的数据：ZICl(图6A)、 CDX2 (图 6B)、roX-1 (图 6C)、NKX6. 1 (图 6D)、NKX2. 2 (图 6E)、NGN3 (图 6F)、NEUROD(图 6G)、胰岛素（图 6H)、HNF4a(图 61)和PTFla(图 6J)。

【具体实施方式】
[0033] 为了以不受限制的方式清晰说明本公开，将本发明的【具体实施方式】分成下列描述 或阐明本发明某些特征、实施例或应用的小节。
[0034] 定义
[0035] 干细胞是通过其在单细胞水平上既自我更新又分化的能力来定义的未分化细胞。 干细胞可产生子代细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和终末分化细胞。干细胞的特 征还在于其在体外分化成来自多个胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的多种细胞谱系的功 能细胞的能力。干细胞还在移植后产生多种胚层的组织，并且在注射到胚泡内之后，促成基 本上至大部分（如果不是所有的话）组织。
[0036] 干细胞通过其发育潜能分类为：（1)全能的，意指能够产生所有胚胎和胚胎外细 胞类型；（2)多能的，意指能够产生所有胚胎细胞类型；(3)多潜能的，意指能够产生细胞谱 系子系，但全部在特定组织、器官或生理系统内（例如造血干细胞（HSC)可产生的后代包 括HSC(自我更新）、局限于血细胞的寡能祖细胞、以及其为正常血液组分的所有细胞类型 和成分（例如血小板））；(4)寡能的，意指能够产生比多潜能干细胞更受限制的细胞谱系子 系；以及（5)单能的，意指能够产生单细胞谱系（例如生精干细胞）。
[0037] 分化是未特化的（"未定向的"）或特化不足的细胞获得特化细胞（如神经细胞或 肌肉细胞）的特征的过程。分化的细胞或诱导分化的细胞是已在细胞谱系中占据更特化的 ("定型的"）位置的细胞。当应用于分化的过程时，术语"定型的"指在分化途径中已进行 到这样的点的细胞：其中在正常环境下，它继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，并 且在正常环境下，不能分化成不同细胞类型或回复到分化程度较低的细胞类型。"去分化" 指细胞通过其回复到在细胞谱系内特化（或定型）程度较低的位置的过程。本文所用的 "细胞的谱系"限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将 细胞定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特异性标志物指与所关注谱系的细胞的表型明 确相关的特征，可用来评估未定向细胞向所关注谱系的分化。
[0038] 如本文所用的，"标志物"是在所关注细胞中差异表达的核酸或多肽分子。在该 语境中，差异表达意指与未分化细胞相比阳性标志物的水平升高并且阴性标志物的水平下 降。标志物核酸或多肽的可检测水平，在所关注细胞中充分地高于或低于在其他细胞中，使 得可使用多种本领域公知的方法中的任何一种将所关注细胞与其他细胞鉴别和区分开来。
[0039] 如本文所用，当在细胞中检测到特定标志物时，细胞对于"特定标志物"是"阳性 的"或是"阳性的"。相似地，当在细胞中未检测到特定标志物时，细胞对于"特定标志物"是 "阴性的"或是"阴性的"。
[0040] 如本文所用，"细胞密度"和"接种密度"在本文可互换使用，并且是指每单位面积 的平坦或弯曲基底所接种的细胞的数量。
[0041] 如本文所用，"第1阶段"和"S1"在本文中可互换使用，以鉴定表达定形内胚层 (DE)特征性标志物的细胞。
[0042] 如本文所用，"定形内胚层"指这样的细胞，其具有在原肠胚形成过程中起于上胚 层的细胞的特征，并形成胃肠道及其衍生物。定形内胚层细胞表达下述标志物中的至少一 种：HNF3P、GATA4、S0X17、CXCR4、Cerberus、0TX2、goosecoid、C-Kit、CD99 和MIXLl。 [0043] 如本文所用，"肠管"指源自定形内胚层的细胞，所述细胞表达下述标志物中的至 少一种：HNF3-0、HNF1-P*HNF4-a。肠管细胞可产生所有内胚层器官，例如肺、肝、胰腺、 胃和肠。
[0044] 在本文中可互换使用的是"第2阶段"和"S2"，其鉴定表达原肠管特征性标志物的 细胞。
[0045] "前肠内胚层"指产生食道、肺、胃、肝、胰腺、胆囊和一部分十二指肠的内胚层细 胞。
[0046]"后前肠"指可产生后胃、胰腺、肝和一部分十二指肠的内胚层细胞。
[0047]"中肠内胚层"指可产生肠、一部分十二指肠、盲肠和升结肠的内胚层细胞。
[0048]"后肠内胚层"指可产生横结肠远端三分之一、降结肠、乙状结肠和直肠的内胚层 细胞。
[0049] "第3阶段"和"S3"可互换使用，以鉴定表达前肠内胚层特征性标志物的细胞。如 本文所用，"表达前肠谱系特征性标志物的细胞"指表达下述标志物中的至少一种的细胞： PDX-1、F0XA2、CDX2、S0X2 和HNF4a。
[0050] 本文可互换使用的是"第4阶段"和"S4"，以鉴定表达胰腺前肠前体特征性标志物 的细胞。如本文所用，"表达胰腺前肠前体谱系特征性标志物的细胞"指表达下述标志物中 的至少一种的细胞：PDX-1、NKX6. 1、HNF6、F0XA2、PTFla、Proxl和HNF4a。
[0051] 如本文所用，"第5阶段"和"S5"可互换使用，以鉴定表达胰腺内胚层和胰腺内分 泌前体细胞特征性标志物的细胞。如本文所用的，"表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细 胞"指表达下述标志物中的至少一种的细胞：PDX1、NKX6. 1、HNF1P、PTF1a、HNF6、HNF4a、 S0X9、HB9或PROXl。表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞基本上不表达⑶X2或S0X2。
[0052] 如本文所用，"胰腺内分泌细胞"或"胰腺激素表达细胞"或"表达胰腺内分泌谱系 特征性标志物的细胞"指能够表达下述激素中的至少一种的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生 长抑素、生长素释放肽和胰多肽。
[0053]"胰腺内分泌前体细胞"或"胰腺内分泌祖细胞"指能够变成胰腺激素表达细胞的 胰腺内胚层细胞。此类细胞可表达下述标志物中的至少一种：NGN3、NKX2. 2、NeuroD、ISL-l、 Pax4、Pax6 或ARX。
[0054] 本文可互换使用的是"dl"、"d1"和"第I天"；"d2"、"d2"和"第2天"；"d3"、 "d3"和"第3天"等等。这些数字字母组合指定在本专利申请的逐步分化方案过程中的不 同阶段中的温育天数。
[0055]"葡萄糖"和"D-葡萄糖"在本文中可互换使用，并且指右旋糖，在自然界中通常发 现的糖。
[0056] 在本文中可互换使用的是"NeuroD"和"NeuroDl"，其鉴定在胰腺内分泌祖细胞中 表达的蛋白质及其编码基因。
[0057] 在本文中可互换使用的是"LDN"和"LDN-193189"，以指示可得自Stemgent(CA， USA)的BMP受体抑制剂。
[0058] 多能干细朐的分离、扩增和培养
[0059] 多能干细胞可表达阶段特异性胚胎抗原（SSEA)3和4以及可用称为Tra-1-60 和Tra-1-81的抗体检测的标志物中的一种或多种（Thomson等人，1998，Science282 : 1145-1147)。多能干细胞在体外的分化导致SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81表达的丧失。 未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，所述碱性磷酸酶活性可通过用4%多聚 甲醛固定细胞，然后用矢量红（VectorRed)作为底物显色来检测，如由制造商（Vector Laboratories，CA,USA)描述的。如通过RT-PCR检测的，未分化的多能干细胞通常也表达 0CT4 和TERT。
[0060] 增殖多能干细胞的另一种希望表型是分化成所有三种胚层的细胞的潜能：内胚 层、中胚层和外胚层。多能干细胞的多能性可例如通过下述加以证实：将细胞注射到SCID 小鼠内，使用4%多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后就来自三个胚层的细胞类型的证据对 它们进行组织学检查。作为另一种选择，多能性可通过这样来确定：产生胚状体并评价该胚 状体是否存在与三个胚层相关的标志物。
[0061] 增殖的多能干细胞系可以用标准G-显带技术进行核型分析并与所公开的相应灵 长类物种的核型相比较。理想的是获得具有"正常核型"的细胞，"正常核型"的细胞意指该 细胞是整倍体，其中所有人染色体都存在并且没有显著改变。多能细胞在培养物中可使用 多种饲养层或通过使用基质蛋白质涂布的容器容易地扩增。作为另外一种选择，与成分确 定的培养基例如mTeSRl培养基（StemCellTechnologies，Vancouver，Canada)组合的化学 成分确定的表面可用于常规细胞扩增。多能细胞可使用酶促、机械或使用多种钙螯合剂例 如EDTA(乙二胺四乙酸）容易地从培养皿中取出。作为另外一种选择，多能细胞可在不存 在任何基质蛋白质或饲养层的情况下悬浮扩增。
[0062] 多能干细朐的来源
[0063] 可使用的多能干细胞的类型包括源自妊娠后形成的组织的建立的多能细胞系，包 括在妊娠期间的任何时间取得的胚胎前组织（例如胚泡）、胚胎组织或胎儿组织，所述时间 通常但不一定是在大约10至12周妊娠前。非限制性例子是建立的人胚胎干细胞（hESC) 或人胚胎生殖细胞系，例如人胚胎干细胞系HI、H7和H9(WiCellResearchInstitute，Madison,WI，USA)。另外合适的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞 群体的细胞。还合适的是诱导多能细胞（IPS)或重编程的多能细胞，其可使用多种多能 相关转录因子的被迫表达而源自成人体细胞，所述转录因子例如0CT4、NANOG、Sox2、KLF4 和ZFP42(AnnuRevGenomicsHumGenet2011,12:165-185)。在本发明的方法中使用的 人胚胎干细胞也可如由Thomson等人描述的进行制备（美国专利5, 843, 780 ;Science， 1998,282 :1145-1147；CurrTopDevBiol1998,38 ： 133-165；ProcNatlAcadSci U.S.A. 1995,92 :7844-7848)。
[0064] 由多能干细朐形成表汰胰腺内杯层谱系特征件标志物的细朐
[0065] 多能干细胞的特征是本领域技术人员众所周知的，并且多能干细胞的附加特征不 断被鉴定。多能干细胞标志物包括例如下述中的一种或多种的表达：ABCG2、cripto、F0XD3、C0NNEXIN43、C0NNEXIN45、0CT4、S0X2、NAN0G、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra 1-60、Tra1-81。
[0066]适用于本发明的多能干细胞包括例如人胚胎干细胞系H9(NIH代码：WA09)、人胚 胎干细胞系H1(NIH代码：WA01)、人胚胎干细胞系H7(NIH代码：WA07)和人胚胎干细胞系 SA002(Cellartis，Sweden)。还适用于本发明的是表达下述多能细胞特征性标志物中的至 少一种的细胞：ABCG2、cripto、CD9、F0XD3、C0NNEXIN43、C0NNEXIN45、0CT4、S0X2、NAN0G、 hTERT、UTFl、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tral-6(^PTral-81。
[0067] 定形内胚层谱系特征性标志物选自S0X17、GATA4、HNF3P、GSC、CER1、Nodal、 FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4、CD48、脱中胚蛋白（EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、 CXCR4、C-Kit、⑶99和0TX2。适用于本发明的是表达至少一种定形内胚层谱系特征性标志 物的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是原条前体细 胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是中内胚层细胞。在另一方面， 表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是定形内胚层细胞。
[0068] 胰腺内胚层谱系特征性标志物选自PDX1、NKX6. 1、HNF1P、PTF1a、HNF6、HNF4a、 S0X9、HB9和PR0X1。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内胚层谱系特征性标志物的细 胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞是胰腺内胚层细胞，其 中TOX-I和NKX6. 1的表达基本上高于⑶X2和S0X2的表达。
[0069] 胰腺内分泌谱系特征性标志物选自NGN3、NEUR0D、ISL1、PDX1、NKX6. 1、PAX4、ARX、 NKX2. 2和PAX6。在一个实施例中，胰腺内分泌细胞能够表达下述激素中的至少一种：胰岛 素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内分泌谱系特征 性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞是胰腺 内分泌细胞。胰腺内分泌细胞可以是表达胰激素的细胞。作为另外一种选择，胰腺内分泌 细胞可以是分泌胰腺激素的细胞。
[0070] 在本发明的一个方面，胰腺内分泌细胞是表达P细胞谱系特征性标志物的细胞。 表达P细胞谱系特征性标志物的细胞表达I3DXl和下述转录因子中的至少一种：NKX2. 2、 NKX6. 1、NEUR0D、ISL1、HNF3P、MAFA、PAX4和PAX6。在本发明的一个方面，表达P细胞谱 系特征性标志物的细胞是P细胞。
[0071] 本发明描述了培养人多能干细胞的方法，该方法包括将人多能干细胞以约 0.8XIO5个细胞/cm2至约3.OXIO5个细胞/cm2的密度接种于表面上。在本发明的一 个方面，人多能干细胞是人胚胎干细胞。在本发明的一些方面中，接种细胞的表面包括 Matrigel?。
[0072] 在一个方面，本发明涉及使多能干细胞分化的方法。该方法包括将多能干细胞以 约0. 8XIO5个细胞/cm2至约3.OXIO5个细胞/cm2的密度接种于表面上，然后使多能细胞 分化成表达指示定形内胚层的标志物的细胞。在本发明的一些方面中，多能细胞是胚胎干 细胞。在本发明的一些方面中，胚胎干细胞是人胚胎干细胞。在本发明的一些方面中，接种 细胞的表面包括Matrigel?。
[0073] 本发明涉及通过如下方式获得表达指示定形内胚层的标志物的细胞的方法：使已 以约0. 8XIO5个细胞/cm2至约3. 0XIO5个细胞/cm2的接种密度接种于表面上的人胚胎多 能干细胞分化。在本发明的一些方面中，接种细胞的表面包括Matrigel?。
[0074] 在一个方面，本发明涉及使表达指示人定形内胚层的标志物的细胞分化的方法， 该方法包括使已以足以使多能细胞分化最大化的接种密度接种于第一表面上的人胚胎多 能干细胞分化成表达指示定形内胚层的标志物的细胞；以及使以足以使分化效率最大化的 接种密度接种于第二表面上的表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化成表达指示胰腺 内胚层的标志物的细胞。在一些实施例中，以约0. 8XIO5个细胞/cm2至约3.OXIO5个细 胞/cm2的接种密度接种多能干细胞。在一些实施例中，将表达指示定形内胚层的标志物的 细胞以约I. 5XIO5个细胞/cm2至约5.OXIO5个细胞/cm2的接种密度接种于表面上。在一 些方面，使表达指示人定形内胚层的标志物的细胞分化的方法中的多能细胞包括使用胚胎 干细胞。在本发明的一些方面中，胚胎干细胞是人胚胎干细胞。在本发明的一些方面中，接 种细胞的表面包括Matrigel?。
[0075] 本发明涉及使表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化的方法，所述表达指示定 形内胚层的标志物的细胞已通过多能干细胞分化成表达指示胰腺内分泌的标志物的细胞 产生。其中多能干细胞已以约〇. 8XIO5个细胞/cm2至约3. 0XIO5个细胞/cm2的接种密度 接种于表面上。在本发明的一些方面中，所使用的多能干细胞是胚胎干细胞。在本发明的 一些方面中，所使用的胚胎干细胞是人胚胎干细胞。在本发明的一些方面中，接种细胞的表 面包括Matrigel?。
[0076] 在一个方面，本发明涉及获得表达指示胰腺内胚层的标志物的细胞的方法，该方 法包括将多能干细胞接种于表面上；使多能干细胞分化成表达指示定形内胚层的标志物的 细胞；以及使表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化成表达指示胰腺内胚层的标志物的 细胞。在本发明的一些方面中，以约〇. 8XIO5个细胞/cm2至约3. 0XIO5个细胞/cm2的密 度接种多能干细胞。在本发明的一些方面中，以约I. 5XIO5个细胞/cm2至约5. 0XIO5个 细胞/cm2的密度接种表达指示定形内胚层的标志物的细胞。在本发明的一些方面中，多能 干细胞是胚胎干细胞。在本发明的一些方面中，胚胎干细胞是人胚胎干细胞。在本发明的 一些方面中，接种细胞的表面包括Matrigel?。
[0077] 在一个方面中，本发明涉及获得表达指示胰腺内分泌谱系的标志物的细胞的方 法，该方法包括将多能干细胞接种于表面上；使多能干细胞分化成表达指示定形内胚层的 标志物的细胞；以及使表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化成表达指示胰腺内分泌的 标志物的细胞。在本发明的一些方面中，以约0. 8XIO5个细胞/cm2至约3.OXIO5个细胞/ cm2的密度接种用于获得表达指示胰腺内分泌谱系的标志物的细胞的多能干细胞。在本发 明的一些方面中，以约I. 5XIO5个细胞/cm2至约5.OXIO5个细胞/cm2的密度接种表达指 示定形内胚层的标志物的细胞。在本发明的一些方面中，多能干细胞是胚胎干细胞。在本 发明的一些方面中，胚胎干细胞是人胚胎干细胞。在本发明的一些方面中，接种细胞的表面 包括Matrigel?。
[0078] 在一个方面中，本发明涉及使表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化的方 法，该方法包括将表达指示定形内胚层的标志物的细胞以约1.5XIO5个细胞/cm2至约 5. 0XIO5个细胞/cm2的接种密度接种于表面上，然后使表达指示定形内胚层的标志物的细 胞分化成表达指示胰腺内胚层的标志物的细胞。在本发明的一些方面中，该方法中使用的 表达指示定形内胚层的标志物的细胞是表达指示定形内胚层的标志物的人细胞。在本发明 的一些方面中，表达指示胰腺内胚层的标志物的细胞是人的。
[0079] 在一个方面，本发明涉及这样的方法：使以约I. 5XIO5个细胞/cm2至约5.OXIO5 个细胞/cm2的接种密度接种于表面上的表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化，然后使 表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化成表达指示胰腺内分泌的标志物的细胞。在一些 方面，表达指示定形内胚层的标志物的细胞是人的。在一些方面，表达指示胰腺内分泌的标 志物的细胞是人的。
[0080] 本发明描述了可高效分化为胰腺内胚层和内分泌谱系的一系列ES细胞密度。
[0081] 本发明的另一个方面描述了可高效分化为胰腺内胚层和内分泌谱系的一系列DE 细胞密度。
[0082] 将本文通篇中所引用的出版物的全文以引用的方式并入本文。本发明通过下述实 例进一步举例说明，但并不受其限制。
[0083] SM
[0084]实例1
[0085] 杯胎干细朐的接种密度不会显著影响定形内杯层标志物的表汰
[0086] 进行该实例以便了解ES细胞的初始接种密度是否会显著影响定形内胚层谱系的 细胞的产生。
[0087] 人胚胎干细胞系Hl(hESCHl)的细胞在不同传代（第40代至第52代）时进行收 获，并且以如下密度：〇. 3XIO5个细胞/cm2、0. 5XIO5个细胞/cm2、0. 75XIO5个细胞/cm2、 0. 9XIO5 个细胞 /cm2、IXIO5 个细胞 /cm2、1. 25XIO5 个细胞 /cm2、I. 5XIO5 个细胞 /cm2、 1.8X105个细胞/cm2和2X105个细胞/cm2作为单细胞接种于Matrigel?(l: 30稀释 度；BDBiosciences，FranklinLakes，NJ)包被的培养皿上的补充有IOiiMY27632(Rock 抑制剂，目录号Y0503，SigmaAldrich，St.Louis,MO)的niTeSR'、1 培养基（StemCell Technologies，Vancouver，Canada)或MEF-CM(条件培养基）中。接种后四十八小时，将培 养物洗涤并在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸盐缓冲盐水）中温育大约30秒。按照如下 方法使培养物分化成定形内胚层（DE)谱系：
[0088]第1阶段（定形内胚层（DE)_4天）：细胞在下述第1阶段培养基中培养一天： MCDB-131 培养基（目录号 10372-019,Invitrogen，Carlsbad，CA)，其补充有 2 %无脂肪 酸BSA(目录号 68700,Proliant，Ankeny，IA)、0.0012g/ml碳酸氢钠（目录号S3187， SigmaAldrich)、lXGlutaMax?(目录号 35050-079，Invitrogen)、2.5mMD-葡萄糖（目录 号G8769，SigmaAldrich)、1 : 50000XITS-X(Invitrogen)、100ng/ml⑶F8(R&DSystems,Minneapolis，MN)和 2. 5iiMMCX化合物（GSK3B抑制剂，14-丙-2-烯-1-基 _3,5,7，14，17， 23, 27-七氮杂四环[19. 3.I. 1 ?2,6 -- 1 ?8,12 ?]二十七-1(25)，2(27)，3, 5,8 (26)， 9,11，21，23-壬烯-16-酮，美国专利申请公布2010-0015711 ;该专利申请全文以引用的方 式并入本文）。细胞随后在MCDB-131培养基中培养另外三天，所述MCDB-131培养基补充有 2%无脂肪酸BSA、0.0012g/ml碳酸氢钠、IXGlutaMax?、2.5mMD-葡萄糖、lOOng/ml⑶F8 和I: 50000XITS-X。
[0089] 在DE阶段结束时，收集样品并通过实时PCR和荧光激活细胞分选（FACS)进行分 析。通过在37°C下在TrypLEExpress(Invitrogen目录号12604)中温育3-5分钟，使细 胞hESC来源的细胞释放到单细胞悬液中，随后使用血球计进行双重计数。然后将细胞在 染色缓冲液（含〇? 2%BSA的PBS)(BDBiosciences目录号554657)中洗涤两次。为进行 表面标志物染色，将IXlO5至IXlO6个细胞重悬于100 封闭缓冲液（以1 : 4稀释于 染色缓冲液中的0.5%人Y-球蛋白）中。将直接偶联的一抗⑶184APC(别藻蓝蛋白，BD Biosciences目录号 555976)和CD9PE(BDBiosciences目录号 555372)以 1 : 20 的最终 稀释度添加到细胞中，并在4°C下温育30分钟。将染色细胞在BD染色缓冲液中洗涤两次， 重悬于200ill染色缓冲液中，然后在15ill的7AAD中温育以便在BDFACSCanto上分析 之前进行活/死细胞辨别。
[0090] 根据制造商说明书，用RNeasy小量提取试剂盒（Qiagen!Valencia,CA)提取 总RNA并使用高容量cDNA逆转录试剂盒（AppliedBiosystems，FosterCity,CA)逆转 录。使用预上样于定制Taqman阵列（AppliedBiosystems)上的Taqman通用预混液和 Taqman基因表达分析试剂盒扩增cDNA。使用序列检测软件（AppliedBiosystems)分析数 据，并使用△ACt方法归一化为未分化的人胚胎干细胞（hES)。所有引物均购自Applied Biosystems0
[0091] 图IA至图IF示出了以0?3XIO5个细胞/cm2 (图1A)、0. 75XIO5个细胞/cm2 (图 18)、1父105个细胞/〇112(图1〇、1.5\105个细胞/〇11 2(图10)、1.8\105个细胞/〇112(图 1E)和2XIO5个细胞/cm2(图1F)接种的Hl细胞的CXCR4(Y轴，DE的标志物）和CD-9(X 轴，未分化ES细胞的标志物）的FACS直方表达谱。CXCR4和⑶9的表达百分比汇总于表I 中。如图1和表I所示，未分化ES细胞的初始接种密度对随后分化为定形内胚层没有显著 影响，如CXCR4的上调和CD9的下调所测量的。
[0092] MI
[0093]ES细朐的接种密度对定形内杯层标志物CXCR4的表汰的影响
[0094]

【权利要求】
1. 一种培养多能干细胞的方法，包括将所述多能干细胞以约0. 8X 105个细胞/cm2至 约3. OX 105个细胞/cm2的接种密度接种于表面上。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干细胞。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述胚胎干细胞是人胚胎干细胞。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述多能干细胞接种于包括Matrigel?的表面上。
5. -种使多能干细胞分化的方法，包括将所述多能干细胞以约0.8X105个细胞/cm 2至 约3. 0X105个细胞/cm2的密度接种于表面上；以及使所述多能干细胞分化为表达指示定形 内胚层的标志物的细胞。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干细胞。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述胚胎干细胞是人胚胎干细胞。
8. 根据权利要求5所述的方法，其中接种所述多能干细胞的所述表面包括Matrigel?。
9. 根据权利要求5所述的方法，其中所述表达指示定形内胚层的标志物的细胞是人 的。
10. -种获得表达指示定形内胚层的标志物的细胞的方法，包括使多能干细胞分化成 表达指示定形内胚层的标志物的细胞，其中所述多能干细胞已以约0.8X10 5个细胞/cm2至 约3. OX 105个细胞/cm2的密度接种于表面上。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干细胞。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述胚胎干细胞是人胚胎干细胞。
13. 根据权利要求10所述的方法，其中接种所述多能干细胞的所述表面包括 MatrigelTm〇
14. 根据权利要求10所述的方法，其中所述表达指示定形内胚层的标志物的细胞是人 的。
15. -种使表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化的方法，包括将多能干细胞以足 以使所述多能干细胞的分化效率最大化的接种密度接种于第一表面上；使所述多能干细胞 分化成表达指示定形内胚层的标志物的细胞；以足以使所述表达指示定形内胚层的标志物 的细胞的分化效率最大化的接种密度接种所述表达指示定形内胚层的标志物的细胞；以及 使所述表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化成表达指示胰腺内胚层的标志物的细胞。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述多能干细胞以约0. 8X 105个细胞/cm2至 约3. OX 105个细胞/cm2的接种密度接种于所述第一表面上。
17. 根据权利要求15所述的方法，其中所述表达指示定形内胚层的标志物的细胞以约 1. 5X 105个细胞/cm2至约5. OX 105个细胞/cm2的接种密度接种于所述第二表面上。
18. 根据权利要求15所述的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干细胞。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述胚胎干细胞是人胚胎干细胞。
20. 根据权利要求15所述的方法，其中所述第一表面包括Matrigel?。
21. 根据权利要求15所述的方法，其中所述第二表面包括Matrigel?。
22. 根据权利要求15所述的方法，其中所述第一表面和所述第二表面是相同表面。
23. 根据权利要求15所述的方法，其中所述表达指示定形内胚层的标志物的细胞是人 的。
24. 根据权利要求15所述的方法，其中所述表达指示胰腺内胚层的标志物的细胞是人 的。
25. -种使表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化的方法，包括使多能干细胞分化 成表达指示定形内胚层的标志物的细胞；以及使所述表达指示定形内胚层的标志物的细胞 分化成表达指示胰腺内胚层的标志物的细胞；其中所述多能干细胞已以约0. 8X 105个细胞 /cm2至约3. OX 105个细胞/cm2的接种密度接种于表面上。
26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干细胞。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述胚胎干细胞是人胚胎干细胞。
28. 根据权利要求25所述的方法，其中所述表面包括Matrigel?。
29. 根据权利要求25所述的方法，其中所述表达指示定形内胚层的标志物的细胞是人 的。
30. 根据权利要求25所述的方法，其中所述表达指示胰腺内胚层的标志物的细胞是人 的。
31. -种获得表达指示胰腺内胚层的标志物的细胞的方法，包括： a) 将多能干细胞接种于表面上； b) 使所述多能干细胞分化成表达指示定形内胚层的标志物的细胞；以及 c) 使所述表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化成表达指示胰腺内胚层的标志物 的细胞。
32. 根据权利要求31所述的方法，其中所述多能干细胞以约0. 8X 105个细胞/cm2至 约3. OX 105个细胞/cm2的接种密度接种于表面上。
33. 根据权利要求31所述的方法，还包括以约1. 5X 105个细胞/cm2至约5. OX 105个 细胞/cm2的接种密度接种所述表达指示定形内胚层的标志物的细胞的步骤。
34. 根据权利要求31所述的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干细胞。
35. 根据权利要求34所述的方法，其中所述胚胎干细胞是人胚胎干细胞。
36. 根据权利要求31所述的方法，其中所述表面包括Matrigel'
37. 根据权利要求31所述的方法，其中所述表达指示定形内胚层的标志物的细胞是人 的。
38. 根据权利要求31所述的方法，其中所述表达指示胰腺内胚层的标志物的细胞是人 的。
39. -种获得表达指示胰腺内分泌的标志物的细胞的方法，包括： a) 将多能干细胞接种于表面上； b) 使所述多能干细胞分化成表达指示定形内胚层的标志物的细胞；以及 c) 使所述表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化成表达指示胰腺内分泌的标志物 的细胞。
40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述多能干细胞以约0. 8X 105个细胞/cm2至 约3. OX 105个细胞/cm2的接种密度接种。
41. 根据权利要求39所述的方法，还包括以约1. 5X 105个细胞/cm2至约5. OX 105个 细胞/cm2的接种密度接种所述表达指示定形内胚层的标志物的细胞的步骤。
42. 根据权利要求39所述的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干细胞。
43. 根据权利要求40所述的方法，其中所述胚胎干细胞是人胚胎干细胞。
44. 根据权利要求39所述的方法，其中所述表面包括Matrigel?。
45. 根据权利要求39所述的方法，其中所述表达指示定形内胚层的标志物的细胞是人 的。
46. 根据权利要求39所述的方法，其中所述表达指示胰腺内胚层的标志物的细胞是人 的。
47. -种使表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化的方法，包括将表达指示定形内 胚层的标志物的细胞以约1. 5 X105个细胞/cm2至约5. 0X105个细胞/cm2的接种密度接种 于表面上；以及使所述表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化成表达指示胰腺内胚层的 标志物的细胞。
48. 根据权利要求47所述的方法，其中所述表达指示定形内胚层的标志物的细胞是人 的。
49. 根据权利要求47所述的方法，其中所述表达指示胰腺内胚层的标志物的细胞是人 的。
50. -种使表达指示定形内胚层的标志物的细胞分化成表达指示胰腺内分泌的标志物 的细胞的方法，包括将表达指示定形内胚层的标志物的细胞以约1.5X10 5个细胞/cm2至约 5. OX 105个细胞/cm2的接种密度接种于表面上；以及使所述表达指示定形内胚层的标志物 的细胞分化成表达指示胰腺内分泌的标志物的细胞。
51. 根据权利要求50所述的方法，其中所述表达指示定形内胚层的标志物的细胞是人 的。
52. 根据权利要求50所述的方法，其中所述表达指示胰腺内胚层的标志物的细胞是人 的。
53. -种由人胚胎干细胞体外分化的细胞群，其与人胚胎干细胞相比时显示出选自 H)X-1、NKX6. 1、NGN3、NKX2. 2、NeuroD和胰岛素的至少一种标志物的表达下降，以及ZIC1和 CDX2的上调；并且其中所述人胚胎干细胞以小于5X105个细胞/cm2的接种密度接种于表 面上。
【文档编号】C12N5/0735GK104284977SQ201380024226
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年5月7日 优先权日:2012年5月7日
【发明者】A.雷扎尼亚 申请人:詹森生物科技公司