专利名称：由万能干细胞所分化的神经上皮细胞的培养方法及培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种神经上皮细胞的分化方法及其使用的培养基，特别是指一种由万能干细胞所分化的神经上皮细胞的分化方法及其所使用的培养基。
背景技术：
干细胞是指尚未完全分化，而具有自我更新能力，并可分化成两种以上成熟细胞的原始细胞。以分化能力将干细胞分类，可分为全能干细胞(totipotent stem cell)、万能干细胞(pluripotent stem cell)、多能干细胞(multipotent stem cell)及双能细胞(bipotent stem cell);另依干细胞来源区分，则可分为胚胎干细胞(embryonic stemcell)、成体干细胞(somatic stem cell)及诱导型万能干细胞(induced pluripotentstem cell ；iPSC)0其中，人类胚胎干细胞属于万能干细胞，来自于未着床前囊胚时期的内细胞团块，具有万能性而可分化为各种成体细胞；另外，诱导型万能干细胞则以强制表达(enforced expression)操作的方式,将特定基因或蛋白质导入已分化的体细胞,使该体细胞被重新程式化(reprogrammed)而成为类似胚胎干细胞。由于干细胞具有细胞分裂、再生更新的能力，也可被诱导分化成为特定组织，因此，目前许多研究学者致力于干细胞分化的研究，希望干细胞分化成为特定细胞或是组织器官后，能够具有用于人类疾病治疗或再生医学等的用途，例如:可将分化培养的多巴胺神经元用以治疗帕金森氏症、分化后的器官用于器官损伤的病人。尤其是针对神经发育、神经损伤及神经退化性疾病、或是相关药物筛检等生物医学研究，更是需要借由经干细胞分化后的神经细胞来进行。然而成熟的神经细胞来自于神经上皮细胞，因此，如何获得大量且高纯度的神经上皮细胞就显得非常重要。许多研究学者于胚胎干细胞分化初期利用加入纤维细胞生长因子-2 (FGF2) (Li, X.J.et al., 2005 ；Timothy et al., 2009 ；Xu et al., 2005 ；Vallier, L.et al.，2005)，以悬浮培养方式进行诱导神经分化，该种分化方法虽可获得具有类神经管表现的神经上皮细胞，然所需分化时间约需十四天以上，分化出来的细胞于贴附过程还夹杂有众多非神经细胞，需以酵素及人力操作于显微镜下将神经上皮细胞挑出，才可获得高纯度的神经细胞。另有学者于干细胞分化过程加入两种smad抑制剂(smad inhibitors)(Elkabetz et al., 2008 ；Lee et al., 2007 ；Chambers et al., 2009),包括 Noggin 和SB431542，用以缩短神经分化时间；也有学者利用基因操作诱导分化或是利用其他细胞共同培养诱导分化等(Pankratz et al.，2007 !Chambers et al.，2009),然而上述方法虽可得到神经上皮细胞，但仍无法使大部分的胚胎干细胞分化成为神经细胞，并且具有生产成本昂贵、利用病毒进行基因操作的安全疑虑及与其他细胞共同培养的不确定因素等缺点。此外，倘若所生产的神经上皮细胞夹杂有其他非神经细胞或未分化细胞等，可能会影响后续神经的分化，且此未分化万能干细胞移植入动物体内也可能变成畸胎瘤。因此，有效率分化出高纯度并表现大部分神经标记的神经上皮细胞，未来将有助于成熟神经细胞的分化，而提升临床运用的可靠性及减少使用的危险。
发明内容
本发明的主要目的，在于提供一种将万能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法。 本发明的另一目的，在于提供一种神经诱导培养基，其含有Wnt信号激动剂(ffnt-signal agonist)、转化生长因子 β 信号抑制剂(TGF β-signal inhibitor)及纤维母细胞生长因子信号激动剂(FGF-signal agonist)，用以使干细胞得以分化出高纯度的神经上皮细胞。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:一种神经诱导培养基，它包含有Wnt信号激动剂(Wnt-signal agonist)、转化因子β信号抑制剂(TGFβ-signal inhibitor)及纤维母细胞生长因子信号激动剂(FGF-signal agonist)。如上所述的神经诱导培养基，优选地，所述fct信号激动剂选自Wntligands和月干醣合成酶激酶_3β抑制剂(glycogen synthase kinase 3 β inhibitor)如药物Bio(6-bromoindirubin_3’ -oxime)中的一种或多种。如上所述的神经诱导培养基，优选地，所述Wnt信号激动剂为浓度介于0.05 μ M(即 0.05 μ mol/L,下同)至 50 μ M 间的药物 Bio (6_bromoindirubin_3’ -oxime)。如上所述的神经诱导培养基，优选地，所述转化因子β信号抑制剂选自骨形态发生蛋白质抑制剂(bone morphogenetic protein inhibitor)、chordin 蛋白质、noggin 蛋白质、dorsomorphin 蛋白质、Smadl 抑制剂(Smadl inhibitor)>Activin/Nodal 受体抑制剂药物如SB431542、及Smad2/3抑制剂(Smad2/3_inhibitor)中的一种或多种。如上所述的神经诱导培养基，优选地，所述转化因子β信号抑制剂为浓度介于I μ M 至 100 μ M 间的药物 SB431542。如上所述的神经诱导培养基，优选地，所述纤维母细胞生长因子信号激动剂选自纤维母细胞生长因子2 (FGF2)、纤维母细胞生长因子受体的配体(ligand)、活化胞外信号调控激酶(extracellular signal-related kinases ;ERK)的促进剂、活化 c_jun N 端蛋白质激酶(c-jun N-terminal kinase kinase ;JNK)的促进剂及活化磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinosital_3kinase ；PI3K)的促进剂中的一种或多种。如上所述的神经诱导培养基，优选地，所述纤维母细胞生长因子信号激动剂为浓度介于Ing/mL至100ng/mL间的纤维母细胞生长因子2 (FGF2)。一种如上所述的神经诱导培养基的用途，是将该培养基用于将万能干细胞培养分化成神经上皮细胞。一种将万能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，它包含有下列步骤:步骤a:将万能干细胞悬浮培养形成类胚体(embryoid body)；步骤b:将该类胚体培养于第一神经诱导培养基中，分化形成神经上皮细胞；其特征在于:所述第一神经诱导培养基选自如权利要求1至7中任意一项所述的神经诱导培养基。如上所述的将万能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，优选地，所述方法还包含有一步骤C，将所述第一神经诱导培养基更换为第二神经诱导培养基，使该被培养细胞继续分化为神经上皮细胞。如上所述的将万能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，优选地，所述第二神经诱导培养基至少由神经干细胞培养基、N2神经细胞生长添加剂、非必须胺基酸及肝素所组成。如上所述的将万能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，优选地，所述步骤a的万能干细胞为人类的胚胎干细胞株及诱导型万能干细胞中的一种或多种。本发明的有益效果在于:本发明提供的将万能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，使用添加有fct信号激动剂、转化因子β信号抑制剂及纤维母细胞生长因子信号激动剂的该神经诱导培养基，不仅可缩短万能干细胞分化为神经上皮细胞的分化时间，还可获得高纯度的神经上皮细胞而可高度表现神经标记，借此，可将该神经上皮细胞于临床上进一步分化为成熟神经细胞而应用于再生医学、筛选神经疾病药物等。
图1A至C为人类胚胎干细胞培养于无喂养细胞环境下的mTESRl培养基中的生长形态图。图2为分化过程中 加入药物Bio、药物SB431542及纤维母细胞生长因子2的第一
神经诱导培养液进行悬浮培养的细胞形态图。图3A为以显微镜倍率为100倍的显微镜下观察的细胞形态图。图3B为以显微镜倍率为200倍的显微镜下观察的细胞形态图。图3C为以显微镜倍率为400倍的显微镜下观察的细胞形态图。图4A为将分化后的神经上皮细胞贴附后神经管状细胞呈现的细胞形态图。图4B为图4A培养两天后细胞伸展的形态图。图5A_la及图5A_lb为神经上皮细胞以一级抗体0ct4表现的免疫荧光表现图。图5A_2a及图5A_2b为神经上皮细胞以一级抗体Sox2表现的免疫荧光表现图。图5A_3a及图5A_3b为神经上皮细胞以一级抗体Nanog表现的免疫荧光表现图。图5A_4a及图5A_4b为神经上皮细胞以一级抗体Zo-1表现的免疫荧光表现图。图5A-5为神经上皮细胞以一级抗体Nestin表现的免疫荧光表现图。图5B_la及图5B_lb为神经上皮细胞以一级抗体Soxl表现的免疫荧光表现图。图5B_2a及图5B_2b为神经上皮细胞以一级抗体Pax6表现的免疫荧光表现图。图5B_3a及图5B_3b为神经上皮细胞以一级抗体Zicl表现的免疫荧光表现图。图5B_4a及图5B_4b为神经上皮细胞以一级抗体N_cadherin表现的免疫荧光表现图。图5C-1及图5C-2为神经上皮细胞以一级抗体BFl表现的免疫荧光表现图。图为神经上皮细胞经贴附后以一级抗体Tujl表现神经轴突的免疫荧光表现图。
具体实施方式
本发明提供了一种将万多能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，其是取一万多能干细胞而将之聚集成为类胚体，再利用包含有fct信号激动剂、转化生长因子β信号抑制剂及纤维母细胞生长因子信号激动剂的神经诱导培养基，作用于该万多能干细胞，使该万多能干细胞分化形成神经上皮细胞。借由本发明所提供的将万多能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法及所使用的神经诱导培养基，可使超过90%的未分化万多能干细胞于一周内成功地分化形成神经上皮细胞，并可高度表达神经标记与前脑标记分子。关于本发明专利申请所使用的名词，其核心含义如下所述，但其含义的范围并不为此所限:万多能干细胞:包含有哺乳类动物的胚胎干细胞、经由基因或蛋白质的外来表现而形成的诱导性万多能干细胞或是其他具有分化为所有体细胞特性的万多能型细胞。于以下实施例中所使用的万多能干细胞为人类胚胎干细胞TWl (由李茂盛妇产科诊所提供；En-Hui Cheng et al，2008)，如图1A至C所示，其是由人类胚胎干细胞培养于无喂养细胞(non-feeder cells)环境下的mTESRl培养基中的生长形态图。神经标记:如Nestin、Soxl、Pax6、Zic-1和N-cadherin等基因，在神经上皮细胞内所表达，因此，通过分析该神经标记即可鉴定万多能干细胞是否已经分化形成神经上皮细胞。前脑标记分子:如脑因子I (brain factor I ;BF1),表达于神经前脑细胞的转录因子，因此，通过分析该前脑标记分子是否表达，用以鉴定万多能干细胞是否以分化形成神经上皮细胞。 胚胎干细胞标记分子:如0ct4及nanog等转录因子，于胚肽干细胞中大量表达，因此，借由分析胚胎干细胞标记分子的表达，可用以鉴定万多能干细胞分化为神经上皮细胞的效率。神经上皮细胞:其细胞呈球型结构，而边缘逐渐成管状紧密规则排列结构，排列如花瓣状，又称 neural rossettes。Wnt信号激动剂:可为一种肝醣合成酶激酶-3 β的抑制剂，稳定β _连结蛋白质(β-catenin),包括:Wntl、Wnt3a、肝醣合成酶激酶-3 β抑制剂如药物Bio。其中，下列实施例中所使用的fct信号激动剂为药物Bio，其化学式为C16H10BrN302，结构式为
OC转化因子β信号抑制剂:使胚胎干细胞减少自我更新的能力，使0ct4表现量降低，包括:骨形态发生蛋白质抑制剂(bone morphogenetic protein inhibitor)、chordin蛋白质、noggin 蛋白质、dorsomorphin 蛋白质、Smadl 抑制齐[J(Smadl inhibitor)、Activin/Nodal受体抑制剂药物如SB431542，或Smad2/3抑制剂(Smad2/3-1nhibitoiO。其中，下列实施例中所使用的转化因子β信号抑制剂为药物SB431542，化学式为:C22-H16-N4_03，结构式为
权利要求
1.一种神经诱导培养基，其特征在于，它包含有fct信号激动剂、转化因子β信号抑制剂及纤维母细胞生长因子信号激动剂。
2.如权利要求1所述的神经诱导培养基，其特征在于，所述fct信号激动剂选自Wntligands和肝醣合成酶激酶_3 β抑制剂中的一种或多种。
3.如权利要求1或2所述的神经诱导培养基，其特征在于，所述Wnt信号激动剂为浓度介于0.05 μ M至50 μ M间的药物Bio。
4.如权利要求1所述的神经诱导培养基，其特征在于，所述转化因子β信号抑制剂选自骨形态发生蛋白质抑制剂、chordin蛋白质、noggin蛋白质、dorsomorphin蛋白质、Smadl抑制剂、Activin/Nodal受体抑制剂药物及Smad2/3抑制剂中的一种或多种。
5.如权利要求1或4所述的神经诱导培养基，其特征在于，所述转化因子β信号抑制剂为浓度介于I μ M至100 μ M间的药物SB431542。
6.如权利要求1所述的神经诱导培养基，其特征在于，所述纤维母细胞生长因子信号激动剂选自纤维母细胞生长因子2、纤维母细胞生长因子受体的配体、活化胞外信号调控激酶的促进剂、活化c-jun N端蛋白质激酶的促进剂及活化磷脂酰肌醇3激酶的促进剂中的一种或多种。
7.如权利要求1或6所述的神经诱导培养基，其特征在于，所述纤维母细胞生长因子信号激动剂为浓度介于Ing/mL至lOOng/mL间的纤维母细胞生长因子2。
8.—种如权利要求1所述的神经诱导培养基的用途，其特征在于，其是将该培养基用于将万能干细胞培养分化成神经上皮细胞。
9.一种将万能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，它包含有下列步骤: 步骤a:将万能干细胞悬浮培养形成类胚体； 步骤b:将该类胚体培养于第一神经诱导培养基中，分化形成神经上皮细胞； 其特征在于: 所述第一神经诱导培养基选自如权利要求1至7中任意一项所述的神经诱导培养基。
10.如权利要求9所述的将万能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，其特征在于，所述方法还包含有一步骤C，将所述第一神经诱导培养基更换为第二神经诱导培养基，使该被培养细胞继续分化为神经上皮细胞。
11.如权利要求9所述的将多能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，其特征在于，所述第二神经诱导培养基至少由神经干细胞培养基、N2神经细胞生长添加剂、非必须胺基酸及肝素所组成。
12.如权利要求9、10或11所述的将万能干细胞分化成神经上皮细胞的分化方法，其特征在于，所述步骤a的万能干细胞为人类的胚胎干细胞株及诱导型万能干细胞中的一种或多种。
全文摘要
本发明提供了一种神经诱导培养基，它包含有Wnt信号激动剂(Wnt-signal agonist)、转化因子β信号抑制剂(TGFβ-signal inhibitor)及纤维母细胞生长因子信号激动剂(FGF-signal agonist)。使用该神经诱导培养基对万能干细胞进行培养，不仅可缩短万能干细胞分化为神经上皮细胞的分化时间，还可获得高纯度的神经上皮细胞而可高度表现神经标记，借此，可将该神经上皮细胞于临床上进一步分化为成熟神经细胞而应用于再生医学、筛选神经疾病药物等。
文档编号C12N5/079GK103160466SQ20121018553
公开日2013年6月19日 申请日期2012年6月6日 优先权日2011年12月14日
发明者苏鸿麟, 陈圣美 申请人:中兴大学