生殖腺来源的侧群干细胞的制作方法

本申请要求2014年6月30日递交的美国临时专利申请No.62/019，172的权益，该申请的全部公开内容通过引用并入本文中。

领域

本文公开了用于促进组织再生和疾病治疗的组合物，所述组合物包含生殖腺来源干细胞侧群细胞的基本同质群体。

背景

干细胞已显示出重新填充(repopulate)和修复组织、器官和/或器官系统。再生医学感兴趣的是使用成体或出生后的干细胞侧群细胞用于基于细胞的疗法。

概述

本文公开了用于组织再生中的组合物，所述组合物包含生殖腺来源干细胞侧群细胞的基本同质群体。

在某些实施方式中，提供这样的组合物，其包含经分离的生殖腺来源干细胞侧群(GDSC-SP)细胞的基本同质群体和至少一种药学上可接受的赋形剂。在其它实施方式中，GDSC-SP细胞的基本同质群体中至少约85％的细胞表达细胞表面标志物SSEA4、ABCG2、CD117、CD34、BCRP1、SCA1、CD90、CD49f、VASA、GPR-125中的所有，并且不表达CD45和谱系标志物。在其它实施方式中，所述组合物还包含至少一种生物活性剂，例如生长因子、抗排斥剂、抗炎剂、抗感染剂(例如抗生素和抗病毒剂)、镇痛剂和/或镇痛剂组合、平喘剂、抗惊厥剂、抗抑郁剂、抗糖尿病剂、抗肿瘤剂、抗癌剂、抗精神病剂、抗氧化剂、免疫抑制剂、维生素、矿物质、或者用于心血管疾病的药剂例如抗再狭窄化合物和/或抗凝化合物。在其它实施方式中，所述生物活性剂是免疫抑制剂。

本文还公开了促进有此需要的对象中的组织再生的方法，所述方法包括：向所述对象中的治疗位点施用组织再生有效量的GDSC-SP细胞的基本同质群体，从而在所述治疗位点诱导组织再生，其中GDSC-SP细胞的基本同质群体中至少约85％的细胞表达细胞表面标志物SSEA4、ABCG2、CD117、CD34、BCRP1、SCA1、CD90、CD49f、VASA、GPR-125中的所有，并且不表达CD45和谱系标志物。在其它实施方式中，所述组合物包含GDSC-SP细胞的基本同质群体和药学上可接受的赋形剂。在其它实施方式中，GDSC-SP细胞的基本同质群体对于对象而言是自体的或异体的。

在其它实施方式中，组织再生是创伤位点的皮肤再生、心肌再生、软骨和腱再生、骨再生、神经组织再生、血和血管再生，或者组织再生使创伤位点的疤痕形成减至最少。

在某些实施方式中，组织再生有效量的GDSC-SP细胞的基本同质群体为每天每个治疗位置约0.5x10⁶个细胞/10mm治疗位点。在其它实施方式中，施用步骤包括至少一种选自局部应用、皮内注射、静脉内注射和皮下注射的方法。

在其它实施方式中，在临床级培养基中培养扩增GDSC-SP细胞的基本同质群体，以形成基本同质的GDSC-SP细胞系，所述培养基包含生长促进因子和补充物，包括但不限于FGF、GDNF、EGF、LIF、IGF、PDGF、EPO、GM-CSF、富血小板血浆(PRP)和人血清。

在其它实施方式中，所述方法还包括使GDSC-SP细胞的基本同质群体分化成与需要再生的组织相同组织类型的细胞。

在其它实施方式中，所述组合物还包含至少一种生物活性剂，例如生长因子、抗排斥剂、抗炎剂、抗感染剂(例如抗生素和抗病毒剂)、镇痛剂和/或镇痛剂组合、平喘剂、抗惊厥剂、抗抑郁剂、抗糖尿病剂、抗肿瘤剂、抗癌剂、抗精神病剂、抗氧化剂、免疫抑制剂、维生素、矿物质、或者用于心血管疾病的药剂例如抗再狭窄化合物和/或抗凝化合物。在一些实施方式中，所述生物活性剂包括生长因子。在其它实施方式中，所述生物活性剂包括免疫抑制剂。还在其它实施方式中，通过包括全身施用或在组织再生位点局部施用的途径施用所述生物活性剂。

附图简介

图1描绘了人类雄性生殖干细胞中的侧群体(SP)。几次传代后，培养的人类雄性生殖细胞系干细胞含有40％SSEA4和小SP细胞群体(通过ABCG2抗体检测)。图1A-未染色的对照；图1B-同种型对照；图1C-Alexa-488-抗-ABCG2和PE-抗-SSEA。

图2描绘了雌性生殖干细胞中的SP。几次传代后，培养的鼠雌性生殖干细胞含有50％SP细胞(通过Hoechst染色检测)(图2B)，其中使用异搏定对照(图2A)。

详细说明

本公开提供了用于组织再生和疾病治疗的来自个体的生殖腺来源干细胞侧群(GDSC-SP)细胞的基本同质群体。

在本文中使用时，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物，例如需要这种治疗或预防的哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于奶牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴等，更优选地是人。

出于从人胚胎细胞开发细胞系的道德和伦理考虑，对干细胞的替代性来源的研究正在进行中。已在许多组织类型中发现了成体干细胞的替代性来源，所述组织类型包括脐带血、间质组织、皮肤、脑、骨髓、脂肪组织、羊膜组织和生殖腺。

来自整个组织的大部分干细胞制品是由干细胞和非干细胞组成的细胞混合物。非干细胞群体通常要丰富得多。分离干细胞的程序变得更加普遍，并提供经纯化的干细胞部分。大部分分离程序包括使用抗体、核染料或磁珠。然而，特别感兴趣的是干细胞的亚群：干细胞侧群细胞。

已在哺乳动物生殖腺中鉴定并表征了生殖干细胞的不同亚群(见共同待决的US 2010/0285577)。本文描述了不同的生殖腺来源干细胞群体：生殖腺来源干细胞侧群。

生殖腺来源干细胞侧群(GDSC-SP)是在生殖腺组织中发现的细胞群体，其是多能的且适合用于组织再生应用中。

在流式细胞术中，侧群(SP)是基于所应用的标志物而不同于主群体的细胞亚群。按照定义，侧群中的细胞具有有区别的生物特征(例如，它们可展示干细胞样的特征)，但这种区别的确切性质取决于鉴定侧群时所使用的标志物。侧群已在癌症中被鉴定出，其可以是外排化疗药物的细胞，从而解释癌症对化疗的耐受性。在睾丸干细胞中，多于40％的SP(被定义为显示出较高DNA-结合染料Hoechst 33342外排的细胞)是未分化的精原细胞，而其它分化的部分仅占0.2％。涉及Hoechst 33342外排的分子是ATP-结合盒(ABC)家族的成员，例如MDR1(P-糖蛋白)和ABCG2。

可基于感兴趣的活细胞对Hoechst 33342 DNA染料的被动吸收和Hoechst 33342外排从而鉴定侧群细胞。干细胞和早期祖细胞能够经由ABC转运体泵出Hoechst，从而允许观察到在光谱的蓝色和红色区域均具有Hoechst低荧光的细胞群体。加入碘化丙啶(PI)以排除死细胞，并利用同一个检测器收集碘化丙啶的亮红色荧光作为Hoechst红色荧光。ABC泵可被药物(例如异搏定或利血平)特异性抑制，且在与Hoechst一起孵育之前用这些药物之一处理的样品可显示出SP表型丢失并可被用作对照以确认SP鉴定。SP表型取决于Hoechst浓度、孵育时间和温度稳定性。这些条件可因细胞类型而异。

术语“生殖腺来源干细胞”指的是在出生后哺乳动物中发现的生殖腺细胞群体，其是多能的并具有分化成各种细胞类型的潜能。生殖腺SP、生殖腺来源SP和GDSC-SP细胞均指相同的GDSC亚群，它们具有下述表型：对于标志物ABCG2(ATP-结合盒亚家族G成员2；CDw338；BRCP1)、SCA1、CD90、CD49f、SSEA4、VASA和CPR125中的所有为阳性，并且对于CD45和谱系标志物为阴性。GDSC-SP还具有CD117和CD34的低表达。对于鼠细胞，谱系被定义为标志物CD3e、CD11c、CD45R/B220、Ly-76、Ly-6G和Ly-6C；对于人细胞，谱系被定义为标志物CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b和血型糖蛋白A。谱系阴性细胞不表达任何谱系标志物。生殖腺细胞可获自雄性来源和雌性来源。在一种实施方式中，GDSC-SP细胞是睾丸来源干细胞侧群细胞。在另一种实施方式中，GDSC-SP细胞是卵巢来源干细胞侧群细胞。

在本文中使用时，术语“基本同质”指的是经分离的GDSC-SP群体，其被纯化以使得该群体中至少85％的细胞表达标志物ABCG2(ATP-结合盒亚家族G成员2；CDw338；BRCP1)、SCA1、CD90、CD49f、SSEA4、VASA和CPR125中的所有，并且对于CD45和谱系标志物为阴性。在其它实施方式中，经分离的GDSC-SP的基本同质群体中至少约90％、至少约92％、至少约95％、或至少97％的细胞具有期望的表型。

GDSC-SP细胞特别适用于组织再生。此外，生殖腺SP细胞可分化成成骨细胞、成软骨细胞、心原性细胞、神经原性细胞和脂肪形成细胞。生殖腺来源干细胞的大批(bulk)分离可分化成多种间叶细胞谱系。生殖腺来源SP细胞可以是具有高度可塑性的生殖腺前体细胞，并且保持静止直至某种信号刺激它们成为响应细胞凋亡、细胞损伤，或者用于组织稳态的特定谱系。

从小鼠睾丸组织分离并分类培养、保持未分化的生殖腺来源SP细胞处于静止状态，在体外保持高水平可塑性并具有在体外分化成不同细胞类型的能力。

在其它实施方式中，可通过用低水平激光刺激使静止状态的GDSC-SP细胞由静止状态受刺激，从而导致CDSC-SP增殖。示例性的低水平激光有A1GaAs激光。例如，激光可以是脉冲激光，例如US 20100/265493中所述的脉冲可调谐激光(例如克尔透镜自锁模(KLM)钛蓝宝石(Ti：S)激光)，US 20100/265493关于脉冲可调谐激光所公开的所有内容均通过引用并入本文中。在另一种实施方式中，激光可以是标定激光。用于标定脉冲激光的各个参数(例如，脉冲率、脉冲能量等)的方法和等式可以与关于在眼部手术中使用所描述的那些类似，并针对在治疗本文所述的器官中使用进行调整。例如US 2011/0267446、US 2007/0213697、US 2011/0028956中描述了这种方法，所有这些文献关于标定激光所公开的所有内容均通过引用并入本文中。低水平激光在例如US 2003/0144712、US 2003/0212442、US 2004/0220513、US 2004/0260367、US 2004/0153130和US 2010/0016783中被进一步描述，所有这些文献关于低水平激光所公开的所有内容均通过引用并入本文中。可用于本文所述方法中的激光(包括连续波激光)的附加描述可例如在US 2012/0302879、US 2013/0211388、US 2013/0184693和US 2013/0102880中找到，所有这些文献关于激光(包括连续波激光)所公开的所有内容均通过引用并入本文中。

在另外的实施方式中，可用于本文所公开方法中的激光包括在红外(IR)光谱或近红外(NIR)光谱中的波长，例如波长为约600-1100nm，包括约600-700nm、650-750nm、700-800nm、750-850nm、800-900nm、850-950nm、900-1000nm、950-1050nm、1000-1100nm、650-1050nm、700-1000nm或750-950nm的范围，或者包括约600nm、620nm、625nm、650nm、675nm、700nm、725nm、750nm、775nm、780nm、785nm、790nm、800nm、810nm、820nm、825nm、850nm、875nm、900nm、925nm、950nm、975nm、1000nm、1025nm、1050nm、1075nm或1100nm。

在其它实施方式中，激光包括约1-500mW的功率输出，包括约1-5mW、1-10mW、1-15mW、1-20mW、1-25mW、1-30mW、1-35mW、1-40mW、1-45mW、1-50mW、1-75mW、1-100mW、5-10mW、10-15mW、15-20mW、20-25mW、25-30mW、30-35mW、35-40mW、40-45mW、45-50mW、5-45mW、10-40mW、15-35mW、20-30mW、50-150mW、100-200mW、150-250mW、200-300mW、250-350mW、300-400mW、350-450mW、400-500mW、50-450mW、100-300mW的范围，或者包括约3mW、约5mW、约10mW、约15mW、约20mW、约25mW、约30mW、约35mW、约40mW、约45mW、约50mW、约60mW、约70mW、约80mW、约90mW、约100mW、约150mW、约200mW、约250mW、约300mW、约350mW、约400mW、约450mW或约500mW。

在其它实施方式中，激光发射约4mm²或约0.1256cm²的波束面积。在另一实施方式中，激光可发射约0.1-10mm²的波束面积，包括约0.5-9.5mm²、1-9mm²、2-8mm²、3-7mm²、4-6mm²、1—7mm²、2-6mm²、3-5mm²、0.1-1mm²、1—2mm²、2-3mm²、3-4mm²、4-5mm²、5-6mm²、6-7mm²、8-9mm²、9-10mm²的范围，或者约0.1mm²、0.5mm²、1mm²、1.5mm²、2mm²、2.5mm²、3mm²、3.5mm²、4mm²、4.5mm²、5mm²、5.5mm²、6mm²、6.5mm²、7mm²、7.5mm²、8mm²、8.5mm²、9mm²、10mm²或更多。

在其它实施方式中，应用能量约1-120秒，包括约1-5、1-10、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、1-110、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、35-40、45-50、50-55、55-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110或110-120秒的范围，或者约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，100、105、110、115或120秒。

在其它实施方式中，激光的功率密度(辐照度)为约1mW-5W/cm²，包括约1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-75、1-100、1-150、1-200、1-250、1-300、1-350、1-400、1-450、1-500、1-600、1-700、1-800、1-900、1-1000、1-2000、1-3000、1-4000、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000或4000-5000mW/cm²的范围，或者约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000或5000mW/cm²。

在一些实施方式中，通过以下方法从生殖腺组织分离GDSC-SP细胞，所述方法包括：从哺乳动物获得生殖腺组织，形成生殖腺细胞的细胞悬浮物，用Hoechst 33342染料对生殖腺细胞进行染色和从经Hoechst染色的生殖腺细胞中分离细胞侧群。在其它实施方式中，可以通过与细胞表面标志物(包括但不限于SSEA4和ABCG2)缀合的磁珠分离GDSC-SP。

在其它实施方式中，GDSC-SP细胞的尺寸小于4μm。在其它实施方式中，GDSC-SP细胞的尺寸小于3μm或者小于2μm。在另外的实施方式中，GDSC-SP细胞的尺寸为约0.5-4μm、约0.5-3μm、约0.5-2μm、约1-3μm或约1-2μm。在某些实施方式中，基于Hoechst外排和尺寸二者分离GDSC-SP细胞。

此外，GDSC-SP细胞在被引入异体对象时可展示出免疫赦免。GDSC-SP不激活T细胞并且不会刺激T细胞增殖，从而不触发免疫系统。因此，可以建立GDSC-SP的库、细胞系或者其它可再生来源，以允许其作为用于治疗疾病的“现成”组合物使用。在另一实施方式中，GDSC-SP可发挥免疫抑制作用和免疫调节作用。细胞或器官移植期间共输注GDSC-SP细胞可通过抑制宿主对移植细胞的免疫应答从而降低免疫排斥和移植物抗宿主疾病(GVHD)的可能性。

在其它实施方式中，GDSC-SP发挥血管生成作用和抗炎作用，以使得GDSC-SP细胞的注射导致在注射位点降低的炎症、新的血管形成和改善的血液供给。

本公开还提供用于组织再生的GDSC-SP细胞。在一种实施方式中，GDSC-SP细胞对于接受对象而言是自体的。在其它方式中，GDSC-SP细胞对于接受对象而言是异体的。

因此，在某些实施方式中，提供使用异体的GDSC-SP细胞的基本同质群体(例如通过组织再生)治疗疾病的方法。

在一种实施方式中，GDSC-SP细胞的基本同质群体被用于皮肤组织再生和/或创伤愈合。在一种非限制性实例中，在期望的治疗位置或位点附近或者之内注射每天每个治疗位置约0.5x10⁶到约5.0x10⁶个GDSC-SP个细胞/10mm治疗位点。GDSC-SP细胞通过增加血管化、增加到损伤位点的细胞迁移、减少疤痕形成量和增加组织再生，从而帮助组织再生。GDSC-SP细胞还减少创伤愈合时间，从而减低了感染的可能性。此外，本文所公开的某些实施方式帮助具有慢性病(例如糖尿病)的患者的伤口愈合。

GDSC-SP细胞的基本同质群体提供组织再生以治疗急性创伤和慢性创伤。急性创伤是在30天(或者在糖尿病患者中为60天)内迅速愈合的那些创伤。可以用本发明治疗的急性创伤的非限制性实例包括擦伤、撕脱伤、挫伤、挤压伤、割伤、撕裂伤、飞弹伤和刺伤。慢性创伤包括但不限于糖尿病皮肤溃疡、褥疮、外科创伤、脊髓损伤、烧伤、化学品所致创伤和归因于血管疾病的创伤。

本发明的GDSC-SP细胞的基本同质群体和组合物的优点为：它们通过相似组织再生而非疤痕形成促进组织愈合。

在一种实施方式中提供这样的方法，其中使GDSC-SP细胞的基本同质群体分化，然后用于组织再生。在一种非限制性实例中，为了使心肌梗塞后的心脏组织组织再生，可以使GDSC-SP分化成心原性前体细胞或心肌细胞，然后将细胞移植到治疗位点。在另一种实施方式中，可以使GDSC-SP细胞分化成神经元并用于神经退行性疾病(包括帕金森病和阿尔茨海默病)、感觉神经元和听觉神经元的修复。

在另一种实施方式中，GDSC-SP细胞的基本同质群体可用于软骨细胞分化、骨细胞分化、软骨修复、骨修复和骨关节炎。

本公开还包括组合物，所述组合物包含在合适载体中的GDSC-SP细胞的基本同质群体。在一种实施方式中，组合物还包含生物活性剂。在其它实施方式中，含GDSC-SP细胞的基本同质群体的组合物与一种或多种生物活性剂一起共同施用。“共同施用”表示：在施用上述治疗组合物之前、同时(例如联合同一制剂或者单独制剂中的生物活性剂)或者之后施用。

在本文中使用时，措辞“生物活性剂”指的是有生物活性或生物相关性的任何有机剂、无机剂或活剂(living agent)。例如，生物活性剂可以是蛋白质、多肽、多糖(例如肝素)、寡糖、单糖或二糖、有机化合物、有机金属化合物、或者无机化合物。它可以包括活的或衰老的细胞、细菌、病毒或其部分。它可以包括生物活性分子例如激素、生长因子、产生生长因子的病毒、生长因子抑制剂、生长因子受体、抗炎剂、抗代谢物、整合素阻断剂、或者完整或部分功能性的有义(insense)基因或反义基因。它还可以包括携带生物相关或生物活性材料的人造颗粒或材料。一个实例是包含核的纳米颗粒，其中核上有药物和包衣。

生物活性剂还可以包括药物，例如可对生物体有治疗效果的化学或生物化合物。非限制性实例包括但不限于，生长因子、抗排斥剂、抗炎剂、抗感染剂(例如抗生素和抗病毒剂)、镇痛剂和镇痛剂组合、平喘剂、抗惊厥剂、抗抑郁剂、抗糖尿病剂、抗肿瘤剂、抗癌剂、抗精神病剂、抗氧化剂、免疫抑制剂、维生素和矿物质、以及用于心血管疾病的药剂例如抗再狭窄化合物和/或抗凝化合物。

生物活性剂还可以包括在于体内代谢、分解(例如切割分子组分)或者以其它方式加工和修饰之后展示出相关生物活性的前体材料。这些可包括这样的前体材料，它们在所述修饰之前，可被视为是相对生物学惰性的，或者对于与有待治疗的医疗状况有关的特定结果而言是无效的。

可以制造任何前述实例的组合、共混物或其它制品，且它们仍然被视为在本文旨在含义内的生物活性剂。涉及生物活性剂的本公开的方面可包括前述实例中的任何或所有。

在一种实施方式中，生物活性剂是生长因子。生长因子是促进移植的GDSC-SP细胞的增殖、分化和功能性的任何剂。合适生长因子的非限制性实例包括白血病抑制因子(LIF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞源生长因子(FGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、和血管内皮生长因子(VEGF)、人生长激素、血小板源生长因子(PDGF)、白介素、细胞因子及其组合。

在一种实施方式中，生物活性剂是免疫抑制剂。免疫抑制剂是防止、延迟期望的免疫应答(例如排斥移植的细胞、组织或器官)的发生或者降低所述期望免疫应答的强度的任何剂。某些免疫抑制剂抑制下述细胞介导的免疫应答，所述细胞介导的免疫应答针对被免疫系统鉴定为异物的细胞。免疫抑制剂的实例包括但不限于环孢菌素、环磷酰胺、强的松、地塞米松、氨甲喋呤、硫唑嘌呤、霉酚酸酯、萨力多胺、FK-506、全身性类固醇，以及大范围抗体、受体激动剂、受体拮抗剂、以及本领域技术人员已知的其它此类剂。

在本文中使用时，“免疫抑制”指的是(例如通过施用本文所限定的“免疫抑制剂”)防止免疫应答以使得检测不到本文所限定的“免疫应答”。在本文中使用时，“防止”免疫应答表示检测不到免疫应答。根据本文所限定和本领域公知的方法来检测免疫应答(例如移植排斥或抗体产生)。

“免疫抑制”还表示：与尚未接受免疫抑制剂的移植接受者或者已经用本文所限定的非“免疫盲化(immunologically blinded)”或“免疫豁免”的材料移植的移植接受者中的任何一个相比，免疫应答发生延迟。免疫应答发生延迟可以是短延迟，例如1小时-10天，即1小时、2天、5天或10天。免疫应答发生延迟也可以是长延迟，例如10天-10年(例如，30天、60天、90天、180天、1年、2年、5年或10年)。

“免疫抑制”还表示免疫应答强度降低。免疫应答强度可降低至：其比尚未接受免疫抑制剂的移植接受者或者已经用非自体材料移植的移植接受者中的任何一个的免疫应答强度低5-100％、优选地25-100％、最优选地75-100％。可以通过测定移植材料被排斥时的时间点来测量免疫应答强度。例如，包括在移植后的第1天移植材料被排斥的免疫应答的强度，比包括在移植后的第30天移植材料被排斥的免疫应答的强度更大。还可以通过测定能够与移植材料结合的特定抗体的量来测量免疫应答强度，其中抗体产生水平与免疫应答强度直接相关。替代性地，可以通过测定检测到能够与移植材料结合的特定抗体的时间点来测量免疫应答强度。

各种策略和剂可用于免疫抑制。例如，一般可利用剂例如FK-506、或环孢菌素或其它免疫抑制剂来抑制淋巴细胞的增殖和活性。另一种可能的策略是施用抗体(例如抗-GAD65单克隆抗体)或者另外的化合物，其遮蔽移植细胞上的表面抗原，从而使得该细胞对宿主的免疫系统实际不可见。

在另一种实施方式中，GDSC-SP细胞的基本同质群体与高压氧疗法一起施用以治疗慢性创伤。

在一种实施方式中，GDSC-SP细胞的基本同质群体与皮肤移植物一起施用以帮助移植过程和组织再生。

GDSC-SP细胞的基本同质群体或者由其分化的细胞可被移植入接受者中，在此细胞将增殖和分化以形成新的细胞和组织，从而提供通常由该组织提供的生理过程。在本文中使用时，术语“移植的”指的是单独的转移细胞或者嵌入支持基质中的细胞。在本文中使用时，术语“组织”指的是执行特定功能时联合的类似特化细胞的聚集体。组织旨在涵盖所有类型的生物组织，包括硬组织和软组织二者。软组织指的是连接、支持或围绕身体的其它结构和器官的组织。软组织包括肌肉、腱(使肌肉与骨相连的纤维带)、纤维组织、脂肪、血管、神经和滑膜组织(关节周围的组织)。硬组织包括结缔组织(例如，坚硬形式例如骨组织或骨)以及其它肌肉组织或骨骼组织。

在另一种实施方式中，GDSC-SP细胞的基本同质群体与药学上可接受的载体或赋形剂一起施用。本文所述的药学上可接受的赋形剂(例如，运载体、佐剂、载体或稀释剂)为本领域技术人员所公知且公众易于获得。优选地，药学上可接受的载体或赋形剂是在使用条件下无有害副作用或毒性的一类和对于治疗组合物而言为化学惰性的一类。

赋形剂或载体的选择部分取决于特定的治疗组合物、以及用于施用所述组合物的特定方法。因此，存在多种合适的治疗组合物制剂。本文所述制剂仅仅是示例性的而绝非限制性的。

药学上可接受的载体往往是水性pH缓冲溶液。药学上可接受的载体的实例包括但不限于盐水，溶剂，分散介质，细胞培养介质，水性缓冲液(例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸)；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐平衡离子，例如钠；和/或非离子型表面活性剂，例如TWEEN^TM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS^TM。

本公开还提供可用于实施治疗方法的组合物。主题组合物包含混合的药学上可接受的赋形剂(载体)或介质和GDSC-SP细胞的基本同质群体(包括来源于此的组织)，所述GDSC-SP细胞的基本同质群体是单独的或者与一种或多种生物活性剂组合，并且其强度对于通过各种方法施用至经历细胞或组织缺损或缺陷的患者是有效的。

另一实施方式提供用于方法中的组合物，所述组合物包含或者基于GDSC-SP细胞的基本同质群体，包括细胞的谱系未定(lineage-uncommitted)群体、细胞的谱系确定(lineage-committed)群体或来源于此的组织，以及药学上可接受的载体或介质。还包括这样的组合物，其包含作用于或者调节GDSC-SP细胞和/或来源于此的组织的生物活性剂，以及药学上可接受的载体或介质。

基于细胞或者组织的组合物的制备在本领域是公知的。可在药学上可接受的介质中配制这种组合物。细胞可以处于溶液中或者嵌在基质中。具有生物活性剂(例如，生长因子)作为活性成分的组合物的制备在本领域是公知的。活性治疗成分经常与药学上可接受并且与活性成分相容的赋形剂或介质混合。此外，如果期望，组合物可含有少量增强活性成分效力的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂。

生物活性剂可以作为经中和的药学上可接受盐的形式被配制到组合物中。药学上可接受盐包括(与多肽或抗体分子的游离氨基形成的)酸加成盐，其与无机酸(例如，盐酸或磷酸)或有机酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。由游离羧基形成的盐也可来源于无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)或有机碱(例如，异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等)。

通过与剂型相容的方式，以治疗有效量施用组合物。施用量取决于例如待治疗的对象和虚弱(debilitation)、对象器官的容纳能力、接纳组合物的细胞和免疫系统、以及细胞或组织疗法的性质等。需要施用的组合物的精确量取决于执业者的判断并且对于每个个体都是独特的。但组合物的合适剂量可在每天每个治疗位置约0.05-100.0x10⁶个基本同质GDSC-SP细胞/10mm治疗位点的范围内，优选地在每天每个治疗位置约0.10-50.0x10⁶个基本同质GDSC-SP细胞/10mm治疗位点的范围内，更优选地在每天每个治疗位置约0.5-5.0x10⁶个基本同质GDSC-SP细胞/10mm治疗位点的范围内，并取决于施用途径和治疗位置的尺寸。最初施用和随后施用的合适方案也是可变的，但可包括最初施用接着通过随后注射或其它施用间隔1小时或更多小时或1天施用重复剂量。

对于特定目的，本领域技术人员可容易地确定合适的细胞浓度。示例性的剂量在每天每个治疗位置约0.05-100.0x10⁶个细胞的范围内。在非限制性实例中，在治疗位点附近或者之内皮内注射每天每个治疗位置约0.5x10⁶个基本同质GDSC-SP细胞/10mm治疗位点。

在其它实施方式中，当需要组织再生时，在创伤或损伤出现后的任何时间点，向哺乳动物的治疗位点施用GDSC-SP细胞的基本同质群体。治疗组合物的精确施用日程取决于执业者的判断，且每个个体的创伤或损伤的类型和程度都是独特的。

本文所公开的GDSC-SP的基本同质群体、由其分化的细胞可通过注射到对象的靶位点而被施用，优选地通过递送装置(例如管，例如导管)进行。在一种实施方式中，管另外包含针，例如注射器，通过其可将细胞引入对象的期望位置。向对象施用细胞的具体、非限制性实例还可包括通过皮下注射、肌内注射或静脉内注射施用。如果施用是静脉内施用，则可以制备细胞的可注射悬浮液并通过持续滴注施用或推注(bolus)施用。

细胞还可以以不同形式被插入递送装置(例如，注射器)中。例如，细胞可以悬浮在这种递送装置中所含的溶液中。在本文中使用时，术语“溶液”包括细胞在其中能保持存活的药学上可接受的载体或稀释剂。这些载体和稀释剂的使用是本领域公知的。溶液优选地是无菌的并且具有一定程度的流动性以至于其以可容易注射形式存在。优选地，溶液在制备和贮藏条件下是稳定的，并通过使用例如苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等而保持抗微生物(例如，细菌和真菌)的污染作用。可如下制备溶液：将本文所述的GDSC-SP细胞的基本同质群体或分化的细胞掺入药学上可接受的载体或稀释剂和(根据需要)上述列举的其它成分中，然后进行过滤除菌。

细胞可以全身施用(例如，静脉内施用)或局部施用(例如，在手术期间在可视化条件下直接施用，或者在超声波心动图指导下直接施用到心肌缺损)。对于这类注射，细胞可以处于可注射的悬浮液制品中或者处于生物相容性介质中，所述生物相容性介质呈液体形式时是可注射的并且在受损组织位点变成半固体。可以使用常规心脏内注射器或可控制的内窥镜递送装置，只要针腔或孔具有足够的直径(例如，30号(gauge)或更大)以至于剪切力不会损伤被递送的细胞即可。

可以通过允许细胞被移植到预期组织位点并重建或再生功能缺陷区域的任何方式施用细胞。

基本同质的GDSC-SP细胞可掺入或嵌入其中的支持基质包括这样的基质，其具有生物相容性、接受者相容性并降解成对接受者无害的产物。这些基质在活体内为GDSC-SP细胞和分化的细胞提供支持和保护。

天然的和/或合成的可生物降解基质是这种基质的实例。天然的可生物降解基质包括血浆凝块(例如源自哺乳动物)、胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白基质。用于细胞移植基质的合适合成材料必须具有生物相容性以排除迁移和免疫学并发症，并且能够支持广泛的细胞生长和分化的细胞功能。其还必须是可恢复原状的，从而允许完全天然的组织替代。基质可被配置成各种形状并且可具有足够强度以防止移植后坍塌。最近的研究表明：由聚乙醇酸制成的可生物降解聚酯聚合物满足所有这些标准，如Vacanti，等J.Ped.Surg.23∶3-9(1988)；Cima，等Biotechnol.Bioeng.38∶145(1991)；Vacanti，等Plast.Reconstr.Surg.88∶753-9(1991)所述。其它合成的可生物降解支持基质包括合成聚合物，例如聚酸酐、聚正酯和聚乳酸。合成聚合物的其它实例以及将细胞掺入或嵌入这些基质中的方法在本领域中也是已知的。参见例如美国专利Nos.4,298,002和5,308,701。

可通过用以下化合物包被聚合物来增强细胞与聚合物的附着，所述化合物例如基底膜组分、琼脂、琼脂糖、明胶、阿拉伯树胶、I型胶原、II型胶原、III型胶原、IV型胶原、V型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、葡糖氨基葡聚糖、其混合物，和细胞培养领域的技术人员已知的其它材料。用于基质中的所有聚合物必须满足为细胞以及随后的生长和增殖提供充分支持所必需的机械参数和生化参数。

可生物降解聚合物基质的一个优点是：血管生成化合物和其它生物活性化合物可直接掺入支持基质中，以使得它们在体内随着支持基质降解而缓慢释放。由于细胞-聚合物结构是血管化的且该结构降解，所以胎盘干细胞可根据其固有特性分化。以下物质可掺入基质中或者与基质结合提供：因子，包括营养物、生长因子、分化诱导物或去分化诱导物(即，导致已分化细胞丧失分化特性并获得例如增殖和更普遍功能的特性)、分泌产物、免疫调节剂、炎症抑制剂、退化因子、增强或允许淋巴网络或神经纤维向内生长的生物活性剂、透明质酸、和购自供应商例如Collaborative Research，Sigma Chemical Co.的药物(其是本领域技术人员已知的并且是市售的，同时带有关于多少量构成有效量的说明书)、血管生长因子例如血管表皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)以及结合肝素的表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)。类似地，可以合成含有肽例如附着肽RGD(Arg-Gly-Asp)的聚合物以用于形成基质(参见，例如美国专利Nos.4,988,621、4,792,525、5,965,997、4,879,237和4,789,734)。

在另一实例中，可将细胞移植到凝胶基质(例如来自Upjohn Company的Gelfoam)中，所述凝胶基质聚合形成干细胞或已分化细胞可在其中生长的底物。已经开发了多种包封技术(Lacy等，Science 254∶1782-84(1991)；Sullivan等，Science 252∶718-712(1991)；WO 91/10470；WO 91/10425；美国专利No.5,837,234；美国专利No.5,011,472；美国专利No.4,892,538)。在涉及直接物理触及受损组织和/或器官的开放式手术程序中，未分化干细胞或已分化干细胞递送制品的全部所述形式都是可行的选择。可间断地重复移植这些细胞，直至获得期望的治疗效果。

在示例性实施方式中，包含有效量的GDSC-SP细胞的基本同质群体的治疗组合物可用于治疗患血管疾病的对象。在本文中使用时，“血管疾病”指的是人血管系统的疾病。实例包括外周动脉疾病、腹主动脉瘤、颈动脉疾病和静脉疾病。GDSC-SP细胞可用来产生血管内皮细胞，所述血管内皮细胞可用于重构组织或替代对象中的疤痕组织的方法中。血管内皮细胞也可以被用于修复血管损伤。

实施例

实施例1

分离鼠雄性生殖腺干细胞

将新生小鼠幼畜(出生后2-5天)或成体小鼠的睾丸从身体中无菌移除。除去睾丸包膜并将生精小管悬浮在酶溶液中，所述酶溶液由磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1mg/mL胶原酶1A和10单位/mL DNA酶组成。在水浴中在37℃下消化睾丸直至所有小管被消化。利用胎牛血清(FBS)使反应终止。移除上层的酶-FBS溶液，然后将细胞重悬在培养基中并保持在冰上直至使用。

实施例2

分离鼠雌性生殖腺干细胞

在微解剖显微镜下解剖40-60只2-5日龄幼畜的小鼠卵巢，并用于细胞分离。首先将卵巢收集在含有冷D-PBS(补充有4mM EDTA)的培养皿中。然后使用5ml移液器将卵巢转移到50ml锥形管中。离心和洗涤之后，移除D-PBS洗涤溶液，然后将卵巢重悬在胶原酶(1mg/ml)和DNA酶-I(20单位/ml)中，并放置在37℃水浴中。每隔10分钟，通过移液器物理破坏正在消化的卵巢组织，并在孵育结束时(30分钟)加入5ml FBS以中和酶。使产生的细胞悬浮物穿过40μm过滤器以除去组织碎片，并通过以400xG离心10分钟来收集经分离的细胞。移除上层的酶-FBS溶液，然后将细胞重悬在培养基中并保持在冰上直至使用。

实施例3

分离灵长目雄性生殖腺干细胞

该研究使用人睾丸，所述人睾丸以来自患非梗阻性无精子症的患者的睾丸活检物形式或者在睾丸切除术之后收集的剩余睾丸组织的形式收集。所有组织均是捐赠的并得到患者的知情同意。在收集的24小时内将组织转移到4℃的PBS-抗生素中。处理人睾丸组织的程序与下文关于灵长类动物所公开的程序相似。

手术移除3-7岁龄的被实施安乐死的猕猴的睾丸；然后将其放置在补充有青霉素/链霉素(分别来自Cellgro和Invitrogen)的PBS中并在冰上运输过夜。手术移除睾丸包膜之后，移除活检样品用于组织学和分子分析。将剩余的生精小管组织切得极碎并用胶原酶A(1mg/ml)(Roche)和DNA酶(10U/mL)(Invitrogen)在往复式37℃水浴中消化15分钟。胶原酶消化后，未消化的组织在单位重力下沉淀，然后移除上清液中的细胞。使未消化的组织在往复式37℃水浴中的酶混合物中进一步消化20分钟，所述酶混合物由DMEM中的1.5mg/mL胶原酶A、1.5mg/mL V型透明质酸酶(Sigma)、0.5mg/mL胰蛋白酶(Worthington Biochemical Corporation)和10单位/mL DNA酶组成。使已消化的组织和未消化的组织穿过70μm过滤器进入FBS中以使酶失活。以400Xg离心10分钟之后，将细胞小球重悬在DMEM+10％FBS中并放置在5％CO₂/95％空气的湿润恒温箱中的经包覆的15cm组织培养皿中。

实施例4

鉴定生殖腺来源干细胞侧群细胞

对于GDSC-SP分析，将在实施例1—3中分离的生殖腺细胞以1x10⁶个细胞/mL的浓度悬浮在含10％FBS的DMEM中。将细胞与终浓度为2.5μg/mL的Hoechst 33342(Sigma)一起孵育。在37℃水浴中每隔20分钟轻轻搅动细胞持续共90分钟。孵育之后，通过离心使细胞形成小球，然后保持在冰上直至流式分选。为了证明Hoechst外排抑制，除了Hoechst染色之外，还将细胞与终浓度为2.5μg/mL的异搏定(Sigma)一起孵育持续同样的孵育期。

分选在Cytopeia InFlux细胞分选仪(Seattle，WA)上进行。用355nm20mW UV激光(Lightwave Electronics，Mountain View，CA)激发经Hoechst染色的细胞，将Hoechst蓝光发射和红光发射用560nm二向色镜分开，并分别使用460/50带通滤波器和670/40带通滤波器收集。用488nm200mW激光(Coherent，Santa Clara，CA)激发异硫氰基荧光素(FITC)和藻红蛋白(PE)，并分别使用530/40带通滤波器和580/30带通滤波器收集发射光。用638nm25mW激光(Coherent)激发别藻蓝蛋白(APC)，并使用670/40带通滤波器收集发射光。

对于抗体染色，将细胞离心，然后浓缩到500mL Hoechst染色缓冲液中并保持在冰上。利用抗小鼠Sca-1-PE、CD90-APC、CD117-APC、CD34-FITC和用于谱系测定的抗体(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)对细胞进行染色。谱系试剂盒含有抗小鼠CD3e、CD11c、CD45R/B220、Ly-76、Ly-6G和Ly-6C，它们均缀合到APC上。其它标志物包括SSEA4、CD49f和ABCG2/BCRP1。对细胞染色30分钟，然后在冷Hoechst染色缓冲液中洗涤一次并保持在冰上直至流式分析。

在生殖腺组织中观察到了Hoechst 33342外排的保守现象。为了鉴定侧群细胞，使所有散点事件均包含在散点图的第一门中。在散点图上，为通过Hoechst染色鉴定的生殖腺来源干细胞SP细胞反向设门(backgate)。经消化的生殖腺组织在散点图上显示出三个主要的细胞群。生殖腺来源干细胞SP细胞存在于与低侧向散射(SSC)以及低至中正向散射(FSC)有关的区域中。生殖腺来源干细胞SP细胞具有低SSC，这表示他们比主要的细胞群要小。

许多组织中的SP表型是由ABC转运体超家族的膜结合蛋白转运体引起的。为了判断ABC转运体活性是否导致GDSC-SP细胞中的SP表型，将异搏定加入细胞悬浮物中至终浓度为25μg/mL。加入异搏定减少了Hoechst染料外排，从而暗示SP表型归因于ABC转运体。

针对许多类型侧群细胞所共有的表面标志物，对生殖腺来源干细胞SP细胞染色。所有标志物均为利用流式细胞术研究的直接缀合抗体。负对照是未染色的生殖腺细胞。阳性染色被定义为荧光强度高于95％负对照。落在30％-80％范围内的不强烈的染色被视为低水平至中等水平的染色。

被严格调节控制的成体干细胞在其生命周期中主要是静止的。用碘化丙啶对新分选的生殖腺侧群细胞进行染色以评估其细胞周期状态。数据表明：侧群细胞和主群细胞均主要是静止的，其中少于0.5％的细胞处于生长期。对于用Hoechst 33342以更大强度染色的其它细胞也是如此。

生殖腺来源干细胞SP细胞是外排Hoechst 33342染料并且富含干细胞的细胞。然而，并非所有GDSC-SP细胞都表达干细胞标志物。GDSC-SP细胞群含有尚未成为任何谱系的细胞。

实施例5

使GDSC-SP细胞分化

分选后，将GDSC-SP细胞用补充有10％FBS的DMEM洗涤一次，然后在小鼠胚胎成纤维细胞STO细胞的饲养层上培养。将STO饲养细胞涂布在包覆有0.1％(wt/v01)明胶的皿上，然后用浓度为10μg/ml的丝裂霉素C(Sigma)在37℃下处理2.5小时，接着用PBS洗涤3次。将分选的GDSC-SP细胞涂布在经丝裂霉素C处理的STO饲养细胞上，并每天更换细胞培养基。

在另一实施方式中，在不含饲养物/不含异种补充物的临床级培养条件下，使用用于粘合培养的合适基质或者在悬浮的生物反应器中培养GDSC-SP细胞。

为了检验GDSC-SP细胞的功能性性能，使它们分化成不同细胞类型。对于骨生成、脂肪形成和神经形成，涂布50000个传代4次的培养的GDSC-SP细胞。对于软骨形成，涂布80000个传代4次的培养的GDSC-SP细胞。

脂肪形成

根据制造商的说明书使50000个细胞在脂肪形成诱导和维持培养基(Cambrex，Walkersville，MD)中生长。简而言之，将细胞涂布到6cm皿中含10％FBS的DMEM中并允许附着。将细胞转移到脂肪形成诱导培养基中持续3天，然后更换为脂肪形成维持培养基并持续3天。在脂肪形成培养基中培养GDSC-SP细胞3整天直至脂肪泡生成。脂肪泡显现的最早时间为7-10天。一定百分比的GDSC-SP细胞生成脂肪泡。随着细胞变大，最显著的形态变化是脂肪泡的外观。

然后对在脂肪形成培养基中培养的细胞进行染色以观察脂肪形成变化。将细胞在PBS中洗涤2次，然后在4℃下在4％多聚甲醛中过夜固定。将板在70％乙醇中洗涤3次，然后在室温下与油红O染色染料一起孵育5分钟。将板在70％乙醇中洗涤3次，并用dH₂O洗涤2次以除去过量染料。加入苏木精5分钟以使细胞核可视化。将板用dH₂O洗涤2次。用油红O染色使具有油滴的细胞显示为深红色。对照皿没有油红染色。

软骨形成

根据制造商的说明书使80000个细胞在软骨形成诱导培养基(Cambrex)中生长。简而言之，在100μL含10％FBS的DMEM中使细胞颗粒化成为微团，并允许其紧紧附着到涂布在6cm皿中心的微团中。利用软骨形成诱导培养基培养细胞，所述培养基每两天更换一次。在软骨形成培养基中时，早在5天时便开始形态变化。细胞扩大且微团变得密实得多。在7-8天时，微团凝聚成可见的小球并向上脱离培养皿。

此时，利用阿尔新蓝试剂对细胞进行染色以检测蛋白糖基化。将细胞在PBS中洗涤2次，然后在4℃下在4％多聚甲醛中过夜固定。将细胞与0.1NHCl中的1％(w/v)阿尔新蓝一起孵育。在室温下孵育板1小时。将板用0.1N HCl洗涤3次以除去过量染料。整个微团染上深蓝色且周围细胞的细胞质也染上蓝色。对照皿几乎没有至没有染色。

骨生成

根据制造商的说明书使50000个细胞在骨生成诱导培养基(Cambrex)中生长。简而言之，将细胞涂布到6cm皿中含10％FBS的DMEM中，并允许附着。利用骨生成诱导培养基培养细胞，所述培养基每两天更换一次。培养10-14天之后，开始显示骨生成形态变化。经历骨生成时，生殖腺SP细胞变大并变成立方形。

培养21天之后，用von Kossa试剂对骨原细胞进行染色以鉴定表示早期骨生成的钙化沉积。将细胞在PBS中洗涤2次，然后在4℃下在4％多聚甲醛中过夜固定。将板在dH₂O中洗涤2次。添加5％硝酸银(w/v)并使板暴露于UV光45-60分钟。将板在dH₂O中洗涤直至除去所有硝酸银。用2％硫代硫酸钠对板进行复染色持续5分钟。接近90％的细胞染上von Kossa。

神经形成

使50000个细胞在含20％FBS并补充有1mM β-巯基乙醇的DMEM中生长共3天。每天更换培养基。早在培养后2天便可看到神经形成的形态迹象。神经元样树状突出物开始发展且细胞体开始具有锥状形态，这是神经元特有的形状。培养3天后，针对巢蛋白对细胞进行染色。将细胞在PBS中洗涤2次，然后在4℃下在4％多聚甲醛中过夜固定。用PBS封闭缓冲液(1xPBS+10％FBS)中稀释的Fc封闭物(BD Pharmingen)封闭板30分钟。将细胞在PBS-T洗涤缓冲液(1x PBS+0.1％Triton X-100)中洗涤3次并在PBS-T中进一步孵育30分钟。将小鼠抗-巢蛋白(IgG1)(Chemicon，Temecula，CA)在1x PBS-T+2％FBS中稀释至最终稀释度为1∶200，然后伴随着等速旋转孵育1小时。将板在PBS-T中洗涤2次。将在PBS-T+2％FBS中以1∶200稀释的抗小鼠免疫球蛋白PE(BD Pharmingen)孵育30分钟以用于可视化。约70％已分化的GDSC-SP细胞表达巢蛋白。

心脏发生

使50000个细胞在含10％FBS并补充有5-氮杂胞苷(Sigma)至终浓度为9mM的DMEM中生长。在心脏发生诱导培养基中培养细胞3天，然后将培养基改变为含10％FBS的DMEM，并针对心脏标志物肌钙蛋白对细胞进行染色。将细胞在PBS中洗涤2次，然后在4℃下在4％多聚甲醛中过夜固定。用含10％FBS的1x PBS中稀释的Fc封闭物(BD Pharmingen)封闭板15分钟。将细胞在PBS-T洗涤缓冲液(1x PBS+0.1％Triton X-100)中洗涤2次并在PBS-T中进一步孵育30分钟。将小鼠抗肌钙蛋白1(IgG2a)(Chemicon)在1x PBS-T+2％FBS中稀释至最终稀释度为1∶200，然后伴随着等速旋转孵育1小时。将板在PBS-T洗涤2次。将在PBS-T+2％FBS中以1∶200稀释的抗-小鼠Ig PE(BD Pharmingen)孵育30分钟以用于可视化。

实施例6

在小鼠中利用GDSC-SP细胞诱导创伤愈合

在NOD/Scid小鼠(每组3只动物)的背部开约10cm的切口并保持创伤打开。在一组小鼠中，在损伤后约1分钟时，将50000个GDSC-SP细胞注射在损伤位点。第二组小鼠不接受细胞移植(对照组)。在损伤后2周时，取损伤位点的组织切片以评价创伤愈合和组织再生的程度。

损伤后14天，来自对照小鼠的组织切片展示出创伤诱导的皮肤结构破坏和疤痕组织形成。来自植入GDSC-SP细胞的小鼠的组织切片展示出恢复正常皮肤组织的创伤愈合，且没有疤痕组织的证据。

除另指出外，在所有情况下，说明书和权利要求中所使用的所有表示成分数量、性质(例如分子量)、反应条件等的数值均应理解成受术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，说明书和所附权利要求中列出的数值参数均为近似值，其可根据本发明想要获得的期望性质而改变。在最低程度上，且并不旨在将等同原则的应用限制于权利要求保护的范围，至少应该根据所报告数字的有效数位和通过惯常的四舍五入法来理解每一个数字参数。尽管陈述本发明的宽广范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实施例中所述数值被尽可能精确地报告。然而，任何数值都固有地包含了必然来自于在它们各自的测试测量中出现的标准偏差的某些误差。

描述本发明的内容时，不使用数量词时(尤其在权利要求书的上下文中)应解释为涵盖单数和复数，除非另外指明或者与上下文明显矛盾。本文中数值范围的列举仅意欲作为分别指每个落入所述范围内的单独值的简略表达方法。除非本文另有说明，每个单独的值均如其在本文中被单独地引用一样包含在本说明书中。除非在本文中另外指明或同上下文明显抵触，否则本文所述的所有方法均可以任何适当的顺序进行。本文中所提供的任何和所有实例或示例性语句(如″例如")的使用仅意欲用来更好地阐述本发明，而非对本发明原本要求保护的范围进行限制。说明书中的任何语言均不应被解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实施而言是必须的。

本文公开的本发明的替代要素或实施方式的分组不应理解为限制性的。各个组组员可以单独地或者以与所述组的其它组员或者本文内的其它要素任意组合被指代且要求保护。应当预期，组的一个或更多个组员可以由于方便和/或专利性的原因包含在组中或从组中删除。当出现任何这类包含或删除时，认为说明书包含所改写的组，从而满足用于所附权利要求中的所有马库什组的书面描述。

本文描述了本发明的优选实施方式，包括本发明的发明人已知的实现本发明的最佳模式。当然，本领域普通技术人员阅读上述说明书后会明白这些优选实施方式的变型。发明人预期熟练的技术人员可适当地采用此类变型，并且发明人意欲使得本发明以与本文具体描述不同的方式被实施。因此，本发明在适用法律允许的条件下包括所附权利要求中所提及主题的所有修改形式和等效形式。此外，除非在本文中另外指明或同上下文明显抵触，否则本发明涵盖上述要素在其所有可能变型中的任意组合。

此外，本说明书通篇引用了许多专利和印刷出版物。每个上面所引用的参考文献和印刷出版物被分别以引用方式整体并入本文中。

最后，应理解本文所公开的本发明的实施方式仅用于阐述本发明的原则。其它可用的修改也在本发明的范围内。因此，通过示例而非限制方式，可根据本文的教导利用本发明的替代实施方式。因此，本发明并不限于如精确所示和所述的实施方式。