一种提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法与流程

本发明涉及胚胎干细胞体外培养技术，具体地说，涉及一种提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法。

背景技术：

escs是来源于附植前胚胎内细胞团(innercellmass,icm)，保持未分化状态并能自我增殖的多能性细胞。escs具有分化为机体所有细胞的潜力，可用于早期胚胎发育的研究。自从m.j.evans等1981年建立了第1个小鼠escs，陆续获得了猕猴、人和大鼠的escs。在牛上，经过研究人员大量努力，仍无法获得公认的牛escs，只获得了牛类escs。其中一个重要的原因就是牛icm体外培养效率低，获得的类escs克隆假阳性率高。

在小鼠诱导干细胞(ipscs)研究领域，人们不断发现小分子物质及抗氧化剂在提高ipscs的形成效率方面有着重要作用。褪黑素(mt)是一种公认的抗氧化剂，在提高哺乳动物卵母细胞体外成熟、胚胎体外生产效率和成熟过程中发挥越来越重要的作用。目前，关于mt对牛类escs形成效率及阳性克隆比例等方面还缺乏深入细致的研究。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供褪黑素在提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例中的应用。所述牛类胚胎干细胞来自于牛体外受精胚胎干细胞。

本发明提供的提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法，其是在牛体外受精胚胎培养液以及干细胞培养液中全程添加10^-11-10^-7m(优选10^-9m)褪黑素，进而提高牛类escs形成效率及阳性克隆比例。

本发明所述牛体外受精胚胎培养液为含10％fbs的cr1a培养液，所述干细胞培养液为2i/lif培养液。其它种类的用于牛类胚胎干细胞体外培养技术的牛体外受精胚胎培养液及干细胞培养液，均落入本发明保护范围。

在本发明的一个具体实施方式中，提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法包括以下步骤：

1)卵母细胞的收集和体外成熟

从牛卵巢采集直径2-8mm卵泡中卵丘-卵母细胞复合体cocs，选择含有3层及以上颗粒细胞的cocs，用成熟液洗涤3遍后，按50枚cocs/每孔/500μl成熟培养液放入预平衡2h的四孔板中，于培养箱内在38.5℃、5％co2和饱和湿度的条件下培养。

其中，所述成熟液配方：tcm199+10μg·ml^-1卵泡刺激素+10μg·ml^-1·黄体生成素·+10μg·ml^-1雌二醇+10％fbs。

2)体外受精胚胎的生产

cocs体外培养22～24h后，用含有0.1％透明质酸酶的tcm199消化2～3min去除颗粒细胞，挑选具有第一极体且胞质均匀的卵母细胞进行体外受精；将牛冷冻细管精液于37℃水浴解冻后，用7ml洗精液、500g离心两次，每次5min，精子沉淀用受精液调整精子密度为5×10⁶个/ml；吸取20μl精液加入含有20枚卵母细胞的80μl受精液小滴中(精子终密度为1×10⁶个/ml)，于38.5℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中受精18-20h；将受精后的卵母细胞移入含有褪黑素的牛体外受精胚胎培养液的培养小滴中培养，间隔48h半量换液，受精卵体外培养7d后发育到囊胚阶段。

其中，所述洗精液为含有2.5mm咖啡因的bo液；所述受精液配方：bo液+20mg/mlbsa+20μg/ml肝素钠+100iu/ml青霉素钾+100μg/ml链霉素；所述含有褪黑素的牛体外受精胚胎培养液配方：cr1a培养液+10％fbs+10^-11～10^-7m褪黑素。

3)囊胚的接种

提前0.5h将培养小滴更换为含有褪黑素的干细胞培养液，然后将培养7d的囊胚接种到饲养层上；置于培养箱内，在38.5℃、5％co2和饱和湿度的条件下培养，隔天半量更换培养液，待贴壁后可全量换液。

其中，使用的饲养层为经10μg·ml^-1丝裂霉素c处理2～3h的第2代小鼠胎儿成纤维细胞；所述含有褪黑素的干细胞培养液配方：2i/lif培养液+10^-11～10^-7m褪黑素。

4)胚胎内细胞团icm的分离与传代培养

囊胚培养7～10d后用机械分离法进行第1次传代，具体用注射器的针头(优选1ml注射器的针头)将icm形成的细胞团块挑出，并分离成较小的细胞团块，转移至新的含有褪黑素的干细胞培养液中；每隔5～7d进行传代，传至第10代。

5)进行ap染色，并在显微镜下观察牛类胚胎干细胞阳性克隆数。

本发明通过在牛体外受精胚胎培养液、escs培养液中全程添加10^-9mmt，采用全胚接种结合机械传代法将牛类escs体外传至第10代。mt处理组第10代类escs克隆形成效率和ap染色阳性率(7.05个/囊胚，90.20％)显著高于对照组(3.52个/囊胚，70.59％)，mt处理组牛类escs中oct4、nanog、sox2的阳性率(93.33％，97.06％，91.18％)要显著高于对照组(70.97％，71.88％，74.19％)；mt处理组牛类escs中oct4、nanog和sox2甲基化位点甲基化水平(8.00％，10.48％，2.08％)要显著低于对照组(20.00％，19.05％，9.86％)，而mt处理组牛类escs中oct4、nanog、sox2基因mrna水平要显著性高于对照组(p<0.05)。

本发明具有操作简单，成本低等优点，能有效提高牛类escs形成效率及阳性克隆比例，对于促进牛escs的研究进展，具有重要的理论和实际意义。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中牛体外受精囊胚接种体外培养获得的第10代牛类escs显微镜下观察结果；其中，a～f分别为接种后3天的囊胚，接种后4天扩展中的细胞克隆，接种后7天扩展中的细胞克隆，接种后14天的第1代细胞克隆，接种后39天的第5代细胞克隆，接种后80天的第10代细胞克隆。

图2为本发明较佳实施例中牛第10代escs的ap染色结果。

图3为本发明较佳实施例中牛第10代escsoct4、nanog、sox2染色图。

图4为本发明较佳实施例中mt对牛第10代类escsoct4、nanog和sox2mrna水平的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法

1、卵母细胞的收集和体外成熟

从牛卵巢(采自河北大厂)上采集直径2-8mm卵泡中卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte-complexes，cocs)，选择含有3层及以上颗粒细胞cocs用成熟液(tcm199+10μg·ml^-1fsh+10μg·ml^-1·lh·+10μg·ml^-1e2+10％fbs)洗涤3遍后，按50枚cocs/每孔/500μl成熟培养液放入预平衡2h的四孔板中，于二氧化碳培养箱38.5℃、5％co2和饱和湿度培养。

2、体外受精胚胎的生产

牛体外受精生产胚胎参照nedambale等(2004)的方法，略有改动。cocs体外培养22～24h后，用0.1％透明质酸酶tcm199消化2～3min去除颗粒细胞，挑选具有第一极体且胞质均匀的卵母细胞进行体外受精。奶牛冷冻细管精液(牛号:11101930，北京市奶牛中心)于37℃水浴解冻后，用7ml洗精液(bo液+2.5mmcaffeine)、500g离心两次，每次5min，精子沉淀用受精液(bo液+20mg/mlbsa+20μg/ml肝素钠+100iu/ml青霉素钾+100μg/ml链霉素)调整精子密度为5×10⁶个/ml。吸取20μl精液加入含有20枚卵母细胞的80μl受精液小滴中(精子终密度为1×10⁶个/ml)，38.5℃、5％co2、饱和湿度二氧化碳培养箱中受精18-20h。将受精后的卵母细胞移入100μl牛体外受精胚胎培养液(cr1a+10％fbs+10^-9m褪黑素)培养小滴中培养，间隔48h半量换液，受精卵体外培养7d后统计发育到囊胚阶段。

3、囊胚的接种

饲养层为经10μg·ml^-1丝裂霉素c处理2～3h的第2代小鼠胎儿成纤维细胞。提前0.5h将培养小滴更换为含有10^-9mmt的escs培养液(2i/lif)，然后将培养7d的ivf囊胚接种到饲养层上。置于培养箱(38.5℃、5％co2、饱和湿度)中培养，隔天半量更换培养液，待贴壁后可全量换液。

4、icm的分离与传代培养

接种7～10d后用机械分离法进行第1次传代，方法是用1ml注射器的针头将icm形成的细胞团块挑出，并分离为较小的细胞团块，转移至新的饲养层上培养。然后每隔5～7d进行传代，传至第10代。

5、ap染色

利用es细胞鉴定试剂盒(millipore,usa﹠canada)进行ap染色。第10代牛类escs采用4％多聚甲醛固定1～2min；弃固定液，1×rinsebuffer冲洗；染色剂(fastredvioletsolution：naphthol：water＝2:1:1)在室温、黑暗环境下培养icm克隆15min；弃染色剂，1×rinsebuffer冲洗；加入1×pbs后在显微镜下观察阳性克隆数。

6、mt对牛类escs中oct4、sox2、nanog基因甲基化水平和mrna表达水平的影响

(1)甲基化检测：将mt组、对照组第10代牛类escs，提取dna进行亚硫酸盐处理，检测oct4(nm_174580.2)、sox2(nm_001105463.2)、nanog(nm_001025344.1)基因甲基化水平。根据millaretal.(2002)的方法，对提取的dna采用亚硫酸盐处理。根据oct4、sox2、nanog外显子区域设计pcr引物(表1)，pcr产物克隆至pmd18-t载体后转入top10细胞。采用abiprism-77测序仪对每个pcr产物的15个克隆进行测序，进而统计甲基化位点的甲基化情况。

表1oct4、nanog、sox2外显子区域pcr扩增引物

(2)mrna表达水平检测：采集mt组、对照组牛类escs进行qrt-pcr，检测oct4、sox2、nanog基因mrna表达水平。采用purelinktmrnamicro试剂盒(invitrogen)来提取rna，具体方法参照操作手册。提取出rna后进行逆转录。然后进行荧光定量pcr扩增(引物见表2)，用β-actin作内参基因。

pcr反应体系为25μl：17.3μl超纯水+2.5μl10×buffer+2.0μl镁离子(25mmol·l^-1)+0.2μldntps(25mmol·l^-1)+0.5μl上游引物(10μmol·l^-1)+0.5μlsybr(20x)+0.5μl下游引物(10μmol·l^-1)+0.3μltaq酶(5u·μl^-1)+1.2μl模板(除模板外，均为invitrogen公司产品)。

pcr反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性10s，60℃退火30s，45个循环。每个样品重复3次，荧光定量结果采用2^-δδct(schmittgen和livak,2008)法进行分析。

表2oct4、nanog、sox2mrna检测引物

7、实验设计

实验分为两组，(1)mt组：牛受精卵体外培养液(cr1a+10％fbs)及干细胞培养液(2i/lif)中均添加10^-7m、10^-9m、10^-11mmt；(2)对照组：牛受精卵体外培养液(cr1a+10％fbs)及干细胞培养液(2i/lif)中均不添加mt。比较两组牛类escs在克隆形成效率、ap和表面标记(oct4、nanog、sox2)阳性率、多能性基因(oct4、nanog、sox2)甲基化及其mrna表达水平的影响。

8、数据统计

采用sas软件对实验数据进行分析，百分数比较时经反正旋转化后采用方差分析，结果以平均数依标准差表示，p<0.05为差异显著性标准。各处理组至少重复3次以上。

9、实验结果

(1)mt对牛类escs形成效率的影响

牛体外受精囊胚接种及接种后牛类escs传代情况见图1和表3。如表3所示，10^-9mmt处理组第10代类escs克隆形成效率(7.05个/囊胚)显著高于对照组(3.52个/囊胚)、10^-7mmt处理组(5.07个/囊胚)、10^-11mmt处理组(5.48个/囊胚；p<0.05)。

表3mt对牛类escs形成效率的影响

^a,b,c：不同的上标表示纵列上数值差异显著(p<0.05)，以下表格同。

(2)mt对牛类escsap染色结果的影响

对牛第10代类escs进行ap染色，阳性克隆呈紫红色(图2)。如表4所示，在牛受精卵、escs培养液中添加10^-9mmt，能够显著提高第10代类escs中ap染色阳性率(90.20％)显著高于10^-7mmt处理组(79.73％)、10^-11mmt处理组(78.48％)和对照组(70.59％；p<0.05)。

表4mt对牛第10代类escsap染色结果的影响

(3)mt对牛类escsoct4、nanog、sox2染色结果的影响

牛第10代类escsoct4、nanog、sox2染色图如图3和表5所示。如表5所示，10^-9mmt处理组牛类escs中oct4、nanog、sox2的阳性率(93.33％、97.06％、91.18％)要显著高于对照组(70.97％、71.88％、74.19％)、10^-7mmt处理组(80.65％、87.88％、81.25％)、10^-11mmt处理组(82.76％、88.57％、84.38％；p<0.05)。

表5mt对牛第10代类escsoct4、nanog、sox2染色结果的影响

(4)mt对牛类escs中oct4、nanog和sox2基因甲基化及mrna表达水平的影响

如表6所示，10^-9mmt处理组牛类escs中oct4、nanog和sox2甲基化位点甲基化水平(8.00％、10.48％、2.08％)要显著低于对照组(20.00％、19.05％、9.86％)、10^-7mmt处理组(12.97％、14.76％、7.22％)、10^-11mmt处理组(13.94％、15.24％、5.56％；p<0.05)。

如图4所示，10^-9mmt处理组牛类escs中oct4、nanog、sox2基因mrna水平要显著性高于对照组、10^-7mmt和10^-11mmt处理组(p<0.05)。

表6mt对牛类oct4、nanog和sox2甲基化位点甲基化水平的影响

由以上实验结果可以得出，与对照组相比，在牛受精卵培养液、干细胞培养液中添加10^-9mmt，能够显著性提高牛类escs形成效率及ap和表面标记(oct4、nanog、sox2)染色阳性率，并能够降低oct4、nanog、sox2基因甲基化水平及提高其mrna表达水平。该研究成果将极大促进牛escs的研究进展。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120>一种提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法

<130>khp171113423.3

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<170>patentinversion3.3

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