专利名称：白蛉体内利什曼原虫检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种检测试剂盒，尤其涉及一种白 蛉体内利什曼原虫检测试剂盒及检测方法，应用于现场疾病控制或者流行病学检测。
背景技术：
内脏利什曼病广泛分布于亚洲、非洲、欧洲和拉丁美洲热带及亚热带地区，但以中 国、印度和地中海沿岸国家为主。我国流星雨敢赌、四川、山西、陕西、新疆和内蒙古等17省 (市、区)。根据不同的地理环境、传染源和传播媒介将内脏利什曼病分为3型，山丘型，平 原型和自然疫源型。利什曼原虫不仅种类繁多，且其宿主和媒介亦具多样性和交叉性，因此正确鉴定 利什曼原虫对选择恰当的治疗措施、制定合适的控制策略均至关重要。利什曼原虫虫种复 杂，且新种时有发现。分子方法的不断涌现及应用为解决这一问题提供了契机，但由于各种 方法自身的特点及所分析的靶序列的差异，其分析结果往往不一致，甚至矛盾。如何形成一 种“金标准”的分子分析或鉴定方法，并与外在特征相统一是亟待解决的问题。rRNA是常 用的靶基因。rRNA是生物细胞中最为保守的结构基因，在进化过程中，不同种属真核生物 rDNA序列特征保持相对稳定，常显示出高度的保守性和广泛的异种同源性，其序列不同位 置上的变化速度不同而具有良好的时钟性质，某些序列具有种株特异性，已成为进行病原 体种株鉴定和诊断的靶基因，并应用于系统分类及构建进化树。长期以来，在现场工作中，白蛉的分类鉴定和感染诊断主要依靠镜下鉴定，由于白 蛉个体微小、种间形态近似以及种下多型的现象，想用解剖镜鉴别需要较高的解剖技能，以 及研究者多年的经验，因此常受到标本状态、环境条件和研究者主观经验的影响较大。同 时，黑热病媒介监测和流行病学调查中，面临的往往是大量的白蛉，费时费力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种白蛉体内利什曼原虫检测试剂盒。本发明所要解决的另一技术问题是克服传统白蛉体内利什曼原虫检测方法的不 足，提供一种简单快速、灵敏特异、对技术人员要求不高的分子检测白蛉体内利什曼原虫的 方法。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一方面，提供一种白蛉体内利什曼原虫检测试剂盒，包括下列组成(1)白蛉抽提液；(2)PCR反应液包括双蒸灭菌水、2XMaster PCR mix和引物；所述引物含有两对 引物，引物1的序列为上游:5，-CTT TTC TGG TCC CGC GGG TAG C-3，，其序列如SEQ ID NO 1 所示；下游:5，-CCA CCT GGC CTA TTT TAC ACC A-3，，其序列如 SEQ ID NO 2 所示； 引物 2 的序列为上游5'-CCT GGT TAG TTT CTTTTC CTC CGC T-3，，其序列如 SEQ ID NO: 3 所示；下游5，-CGC AGC TAA CTGTGT GAA ATC-3，，其序列如 SEQ ID NO :4 所示。其中，引物1能特异性扩增利什曼原虫；引物2能特异性扩增白蛉属。在本发明的另一方面，提供一种白蛉体内利什曼原虫的检测方法，包含如下步 骤(1)白蛉的抽提；(2)设计并合成如权利要求1所述的引物1 (上游SEQ ID NO :1，下游SEQID NO 2)和引物 2 (上游 SEQ ID NO :3，下游 SEQ ID NO 4)；(3)将步骤(1)抽提得到的白蛉抽提液作为DNA模板进行复合PCR方法检测；检 测复合PCR反应体系为DNA模板，2 XMaster PCR mix，步骤⑵合成的引物1和引物2，双 蒸灭菌水；(4)步骤⑵所得的PCR产物4°C保存，进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳。步骤⑵中，所述复合PCR反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30seC、55°C退 火30sec、72°C延伸30sec共35个循环，72°C再延伸lOmin。本发明的有益效果在于目前的各种PCR衍生技术中，多重PCR技术可同时实现检 测与假阴性控制。本发明在PCR反应体系中除特异性扩增利什曼原虫的引物外，还加入一 对特异性扩增白蛉属的引物，作为内参，采用该两对引物进行PCR反应可以避免假阴性情 况的发生。本发明所用的复合式PCR方法，在鉴定人员缺乏长期现场经验的情况下，能够及 时快速的进行阳性白蛉的筛选，一次性确定阳性白蛉，是对传统白蛉检测的一种有益的补 充和确认的方法。为现场快速检测白蛉体内的利什曼原虫提供了一种新的检测手段。本发 明从分子水平上进行鉴别和诊断，结果更客观，灵敏度更高。同时可以在后续的工作中应用 本发明方法同时进行蛉种和虫种的鉴别。
图1是实施例1的白蛉和利什曼原虫实验室混合样本与野外标本对照的1. 5%琼 脂糖凝胶电泳图，图1中，M为DNA分子量标准；1为利什曼原虫PCR结果；2为野外标本抽 提DNA的PCR结果；3为实验室白蛉和利什曼原虫混合样本PCR结果；4为阴性对照。
具体实施例方式以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1白蛉的抽提(采用QIAGEN DNA抽提试剂盒，产品型号为69504购自 QIAGEN国内代理商上海市莱枫科技有限公司)1.采集野外白蛉解剖镜下验证利什曼原虫阳性、前鞭毛体感染，带回实验室；2.取一只白蛉放入1. 5mlEP管(离心管)中，加入ATL (组织裂解液，购自QIAGEN 公司)180ul (微升)，充分研磨，加入20ul蛋白酶K (购自QIAGEN公司)，水浴55°C 2小时；3.在EP管中加入200ul AL (裂解液，购自QIAGEN公司，水浴70°C 10分钟；4.在EP管中加入200ul无水乙醇，充分混勻，将混合液移至过滤柱中，离心 8000rpmXlmin ；5.弃收集管和液体，在过滤柱中加入500ul已加入无水乙醇25ml的WAl (洗涤液 1，购自 QIAGEN 公司)，离心 8000rpmXlmin ；
6.弃收集管和液体，在过滤柱中加入500ul已加入无水乙醇30ml的WA2 (洗涤液 2，购自 QIAGEN 公司)，离心 14000rpmX 3min ；7.换新的收集管，空转过滤柱，14000rpmX Imin ；8.加入200ul AE (洗脱液，购自QIAGEN)，把过滤柱放到新的EP管中，静置1分钟 后，离心 8000rpmXlmin ；9.得到DNA模板，4°C保存备用。实施例2、引物设计根据国际基因库中已公布的利什曼原虫保守序列的动基体DNA小环，动基体DNA 具有利什曼原虫属的高度保守性，同时，它还具有高度异质性特点，不但在种间高度差异， 而且在同种不同地理株间也存在差异，设计两对特异性引物引物1的序列为上游:5，-CTTTTC TGG TCC CGC GGG TAG C-3，，其序列如 SEQ ID NO 1 所示；下游5，-CCACCT GGC CTA TTT TAC ACC A-3，，其序列如 SEQ ID NO 2 所示；片段长度140bp左右测序结果CCACCTGGCCTATTTTACACCAACCCCCAGTTTTCCGCCTCGGAGCCCATTTTGGCATTTTTGGCCGAT TTTGAACGGGATTCTGCACCCATTTTTCCGATTTTGCAAAACGCCCCTACCCGCGGGACCAGAAAAGA经过广泛研究证实，核糖体基因(ribosome DNA, rDNA)是分子鉴别和分子系统学 研究的较理想的分子指标，根据基因数据库中白蛉序列为基础，其中白蛉核糖体DNA第2内 转录间隔区(rDNA-ITS2)序列为重要的分子特征序列，以此为基础设计引物。引物2的序列为上游5，-CCTGGT TAG TTT CTT TTC CTC CGC T-3，，其序列如 SEQ ID NO :3 所 示；下游5，-CGCAGC TAA CTG TGT GAA ATC-3，，其序列如 SEQ ID NO 4 所示。片段长度约为500bp测序结果TCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTAATATGCTTAAATTCAGGGGGTAGTCACGCATGAGTTGA GGTCGCTTTTTTAAAAATATACATTTTTTCTTTAGACACATTCTTTATTATGAATAATCTCTTATAGTAATAATACT GGAATGTAACAAAAATCTCACATAAGTGATTTATGCAATGATTATGATGTTACACTCACATAATGTAATATTACATT TTTCAATGAGTACATTCAAATGCGTCAAAAAAAATTTTAAGAGCATGAAAGTACAAAGGACTTACATAGCTCCAATG TTTTTACTACCCCCCAACAATTAGGGTGTAGTAAAAACAATTTGTTCTGCTTATTATTTACGACACTCAACCATACG TGGTCCATGCAGTTTAAAAACATAAGTTAAAAACATTAGCATGGACCGCAATGTGCGTTCAAAATGTCGATGTTCAT GTGTCCTGCAGTTCACACGATTTCACACAGTTAGCTGCGA上述引物由英潍捷基上海贸易有限公司合成，测序由上海鼎安生物科技有限公司 完成。实施例3复合PCR方法检测检测复合PCR反应体系为在0.9ml的PCR管中依次加入以下试剂DNA模板 Ι.Ομ 1 (由实施例1制得)，2XMaster PCR Mix 12. 5 μ 1 (莱枫生物科技有限公司提供)，实 施例2合成好的引物1上游(SEQ ID NO 1)10 μ Μ、引物1下游(SEQ ID NO :2) 10 μ Μ、引物2上游(SEQ ID NO :3) 10 μ M、引物 2 下游(SEQID NO :4) 10 μ M 各 0. 5ul，最后加 ddH20(双蒸 灭菌水)补足25. 0μ 1反应体系。反应条件为，94°C预变性5min，94°C变性30seC、55°C退 火30sec、72°C延伸30sec共35个循环，72°C再延伸lOmin。PCR产物4°C保存，进行1. 5% 琼脂糖凝胶(含5 μ g/ml EB (溴化乙锭))电泳。 实验结果如图1所示的第2条带，测序均为目的条带。图1中，M为DNA分子量标 准；1为利什曼原虫PCR结果；2为野外标本抽提DNA的PCR结果；3为实验室白蛉和利什曼 原虫混合样本PCR结果；4为阴性对照。可见，图1验证了此实验的可行性，过去媒介白蛉 的流行病学调查只能依靠现场解剖，对解剖标本的前处理也很繁琐，本实验可一次处理大 量样本(96孔板PCR仪可一次性处理96只白蛉)，采集标本后不用特殊处理，可直接抽提， 且对实验人员没有很高的要求，所以更利于普及，总耗时4个小时左右。白蛉活动范围小， 飞行能力弱，随着以药物杀灭白蛉为防治的主要措施的实施，结合环境治理和个人防护达 到了较好的防治目的。所以目前现场的白蛉的前鞭毛体感染率很低，可以结合本实验考虑 混合样本抽提(10只白蛉为一个样本)，可以使现场操作更快捷。序列表
<110>中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所
<120>白蛉体内利什曼原虫检测试剂盒及检测方法
<130>NP-10-14384
<160>4
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>1
cttttctggt cccgcgggta gc 22
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc feature
<223>引物
<400>2
ccacctggcc tattttacac ca 22
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>3cctggttagt ttcttttcct ccgct 20<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223> 引物<400>4cgcagctaac tgtgtgaaat c2权利要求
一种白蛉体内利什曼原虫检测试剂盒，其特征在于，包括下列组成(1)白蛉抽提液；(2)PCR反应液包括双蒸灭菌水、2×Master PCR mix和引物；所述引物含有两对引物，引物1的序列为上游5’ CTT TTC TGG TCC CGC GGG TAG C 3’，其序列如SEQ ID NO1所示；下游5’ CCA CCT GGC CTA TTT TAC ACC A 3’，其序列如SEQ ID NO2所示；引物2的序列为上游5’ CCT GGT TAG TTT CTTTTC CTC CGC T 3’，其序列如SEQ ID NO3所示；下游5’ CGC AGC TAA CTGTGT GAA ATC 3’，其序列如SEQ ID NO4所示。
2.如权利要求1所述的白蛉体内利什曼原虫检测试剂盒，其特征在于，所述引物1特异 性扩增利什曼原虫，所述引物2特异性扩增白蛉属。
3.一种白蛉体内利什曼原虫的检测方法，其特征在于，包含如下步骤(1)白蛉的抽提；(2)设计并合成如权利要求1所述的引物1和引物2；(3)将步骤(1)抽提得到的白蛉抽提液作为DNA模板进行复合PCR方法检测；检测复 合PCR反应体系为DNA模板，2 XMaster PCR mix，步骤(2)合成的引物1和引物2，双蒸灭 菌水；(4)步骤(2)所得的PCR产物4°C保存，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。
4.如权利要求3所述的白蛉体内利什曼原虫的检测方法，其特征在于，步骤(2)中， 所述复合PCR反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30sec、55°C退火30sec、72°C延伸 30sec共35个循环，72°C再延伸IOmin0
全文摘要
本发明公开了一种白蛉体内利什曼原虫检测试剂盒，包括下列组成(1)白蛉抽提液；(2)PCR反应液包括双蒸灭菌水、2×Master PCR mix和两对引物；引物1的序列为上游5’-CTT TTC TGG TCC CGC GGG TAG C-3’；下游5’-CCACCT GGC CTA TTT TAC ACC A-3’；引物2的序列为上游5’-CCT GGT TAG TTTCTT TTC CTC CGC T-3’；下游5’-CGC AGC TAA CTG TGT GAA ATC-3’。此外，本发明还公开了白蛉体内利什曼原虫的检测方法。本发明的试剂盒敏感性高、特异性强、检测方法简单实用，对技术人员要求不高，为现场快速检测白蛉体内的利什曼原虫提供了新的检测手段。
文档编号C12Q1/04GK101921862SQ20101026824
公开日2010年12月22日 申请日期2010年9月1日 优先权日2010年9月1日
发明者周晓俊, 周晓农, 张仪, 顾灯安, 马宪亮 申请人:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所