一种缺失gG和TK基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒和应用的制作方法

专利名称：：一种缺失gG和TK基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于动物基因工程
技术领域：
，具体涉及双基因缺失的一种重组牛传染性鼻气管炎病毒，该病毒缺失了gG和TK基因，该毒株的毒力降低而免疫原性没有影响，本发明还包括利用该重组病毒制备牛传染性鼻气管炎病毒疫苗以及该疫苗的应用。
背景技术：
：牛传染性鼻气管炎(InfectiousBovineRhinotracheitis，IBR)，又称“坏死性鼻炎”或“红鼻病”，是由牛传染性鼻气管炎病毒(InfectiousBovineRhinotracheitisviruses,IBRV)，引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病，该病的危害性在于病毒侵入牛体后，可潜伏于一定部位，导致持续性感染，病牛长期乃至终生带毒，在机体抵抗力下降时，又向外排毒。该病对奶牛的产奶量、公牛的繁殖力及役用牛的使役力均有较大的影响，而且急性呼吸道感染可继发牛致命性细菌性肺炎，是造成养牛业经济损失的主要原因之一。该病在世界范围内流行，并且每年都给养牛业造成巨大的经济损失。目前只有少数欧洲国家已经根除了本病，其他一些国家正在实施扑灭计划，或使用标记疫苗区分自然感染和疫苗免疫的牛群，以便于更好的进行监控和防制。IBRV为有囊膜的双股DNA病毒，病毒粒子呈圆球型，成熟病毒粒子直径约150-220nm，主要由核心、衣壳和囊膜组成。核心由双股DNA和蛋白质缠绕而成，其核衣壳为立体对称的二十面体，外观呈六角形，上面有162个壳粒，周围为一层含脂质的囊膜。双股DNA分子量为84X106，其中G+C含量为72%。据测IBRV基因组可编码大约70个蛋白质，其结构和功能目前大部分已知(李继昌，牛传染性鼻气管炎病的研究进展，黑龙江畜牧兽医.2002，4:50)，其中含有2533种结构蛋白。存在于病毒囊膜的gB、gC、gD和gE四个主要糖蛋白基因已经测序并在原核和哺乳动物中表达。IBRV糖蛋白能刺激机体产生中和抗体，并且在补体的存在下使感染细胞裂解。gB、gC、gD和gE四个基因主要负责病毒的吸附、渗透和在细胞之间扩散病_(BelknapEB,WaltersLM.，KellingC,AyersVK,NorrisJ,McMillenJ,HayhowC,CochranΜ,ReddyDN,WrightJ,CollinsJK.ImmunogenicityandprotectiveeffcacyofagE,gGandUS2gene-deletedbovineherpesvirus-1(BHV-I)vaccine.Vaccine,1999,17(18)=2297-2305),gB、gC、gD是刺激宿主免疫应答的主要抗原蛋白(TikooSK,CamposM,BabiukLA.Bovineherpesvirus1(BHV-I):biology,pathogenesis,andcontrol.Adv.VirusRes,1995,45=191-223),gD能诱导产生最高水平的体液和细胞免疫(BabiukLA,vanDrunenLittel-vandenHurkS,TikooSK,LewisPJ,LiangX.Novelviralvaccinesforlivestock.Vet.ImmunolImmunopatho1,1996,54(1-4):355_363)。gB:gB能引起细胞融合，在哺乳动物细胞中的表达显示出引起细胞融合和多核体的形成，对病毒复制是必需的，国内学对其实现了原核表达并对表达产物的抗原性进行了分析，在杆状病毒中表达的抗原性较gC、gD弱；细胞表面的糖蛋白相互作用，介导病毒吸附的起始，可能调控病毒的数个反式激活子的结合作用，但对病毒的感染并非必需；糖蛋白gB对于穿孔是必需的，并且已经证实侵袭神经和通过神经传播需要gB。gC:gC是BHV-I表达最多的糖蛋白，并且在病毒粒子表面即体液中和抗体和细胞毒性T细胞反应的有效部位能够形成最清晰的影象。它对病毒吸附组织培养细胞是重要的，但它在牛细胞内的表达并不影响病毒蚀斑的数量和病毒的存在。此外，gC促进病毒的穿透即病毒进入细胞的第二过程，也可能参与病毒复制的其他过程。BHV-1、HSV-I和IBRV的gC蛋白与细胞表面的糖蛋白相互作用，介导病毒吸附的起始，还能够诱导细胞介导的免疫应答。gD:gD与病毒穿透，进入宿主细胞有关，含有gD基因的质粒作为免疫原可能诱导细胞毒性淋巴细胞的反应(Muralidhar，2002)，被认为是病毒粒子表面和病毒感染细胞的主要分子。与其它相关的几种糖蛋白比较，抗gD抗体的病毒中和效果最好，具有制备亚单位疫苗的前景。鼠和牛的免疫试验显示出gD能够引起比gB、gC更强而持久的细胞免疫。gE:gE是IBR病毒粒子的主要成分之一，它能够在病毒粒子表面及病毒感染细胞表面高水平表达，以细胞特异的方式影响病毒从感染细胞的释放，而且是中和抗体的主要作用靶位，因此gE是牛传染性鼻气管炎鉴别诊断的可靠标记。gE基因缺失也影响到病毒在细胞间的传播。在动物，gE的存在对病毒有效地感染中枢神经系统方面有重要作用。gE是病毒复制非必需的，这使基因缺失苗的构建成功成为可能，缺失gE特定部位的编码区能降低疫苗的毒力且能充分抵抗病毒的入侵。研究表明，gE可用于ELISA诊断方法的建立。gG:gG是IBRV的主要囊膜糖蛋白之一，具有很强的抗原性(HartleyCA,DrummerHE,StuddertMJ.ThenucleotidesequenceoftheglycoproteinGhomologueofequineherpesvirus3(EHV3)indicatesEHV3isadistinctequidalphaherpesvirus.ArchVirol,1999,144(10):2023_2033)，是许多疱疹病毒的诊断抗原，被广泛用于其它疱疹病毒感染性疾病的血清学诊断。同时，糖蛋白gG也是病毒复制非必需的分泌性蛋白，它在α疱疹病毒中相对保守(NakamichiK,OharaK,KurokiD,OtsukaH.Bovineherpesvirus1glycoproteinGisrequiredforviralgrowthbycell-to-cellinfection,virusreseach，2000，68:175-181)。可影响病毒在宿主细胞内有效增殖与细胞间扩散，与病毒毒力相关，已被广泛用作IBRV外的其它疱疹病毒的诊断抗原(NakamichiK，KurokiD，MatsumotoY，OtsukaH.Bovineherpesvirus1glycoproteinGisrequiredforpreventionofapoptosisandefficientviralgrowthinrabbitkidneycells.Virology,2001,279(2)488-498；NakamichiK,MatsumotoY，OtsukaH.Bovineherpesvirus1glycoproteinGisnecessaryformaintainingcell-to-celljunctionaladherenceamonginfectedeelIs.Virology,2002，294(1)22-30；SaschaTrapp，NikolausOsterrieder,GiintherM.KeiliMartinBeer.Mutagenesisofabovineherpesvirustype1genomeclonedasaninfectiousbacterialartificialchromosomeanalysisofglycoproteinEandGdoubledeletionmutants.Virology,2003，84301-306)。TK:TK基因在核酸代谢中起重要作用，是α-疱疹病毒的毒力基因，对病毒的复制并非需要，但对病毒维持在神经组织的持续性感染十分重要。所以，TK基因一直是疱疹病毒分子生物学研究的热点之一。TK基因缺失后可使毒力降低，并且在非分裂细胞中的复制能力也很低，从而使潜伏的病毒不易激活，因此在研制基因缺失疫苗时，TK基因是常用的靶基因(KitS,OaviHiGainesJD，BillingsleyP,McConnellS.Thymidinekinase-negativebovineherpesvirustype1mutantisstableandhighlyattenuatedincalves.ArchVirol,1985,86:63_83)。此外，病毒的TK基因比细胞的相应基因具有更广谱的磷酸化底物，在设计抗病毒治疗药物和治疗肿瘤药物时具有广泛的应用价值。国外已经研制了TK/gE双基因缺失疫苗(KaashoekMJ，vanEngelenburgFA,MoermanA，GielkensAL,RijsewijkFA,vanOirschotJT.VetMicrobiol.1996Jan；48(1-2)143-53)ο而我国的IBRV的血清学的阳性率很高(B.F.Yrn，Serologicalsurveyofbovineherpesvirustype1infectioninChina,veterinarymicrobiogy,2007,127，136-141)牛传染性鼻气管炎是呈世界性广泛传播，严重危害养殖业的发展而我国尚无应对措施，所以能够研制出适合我国国情的疫苗是非常有意义的
发明内容本发明的目的在于获得一种免疫原性好和安全性强的牛传染性鼻气管炎的基因工程毒株。本发明的第二个目的是牛传染性鼻气管炎的基因工程毒株在制备牛传染性鼻气管炎基因工程疫苗上的应用。本发明通过以下技术方案实现申请人:构建了一种重组牛传染性鼻气管炎(InfectiousBovineRhinotracheitis,IBR)基因工程毒株IBRVΔgG/ΔTK，该基因工程毒株于2009年10月23日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC-V200915。本发明的基本构建方法是首先针对目的基因gG，TK构建四个转移质粒，将其分别命名为，pcDNA3.l-ZYP，pcDNA3.l-ZYP-l，pZF08_16和pZF08_16_l，其中pcDNA3.1-ZYP-I禾口pZF08-16都含有EGFP表达盒以便筛选，而pcDNA3.1-ZYP-2和pZF08_16_l不含EGFP表达盒以便反向筛选。将pcDNA3.1-ZYP-1和IBRV基因组共转染于MDBK(牛肾细胞)细胞，获得IBRVΔgG/EGFP+毒株，再用pcDNA3.1-ZYP-I和IBRV基因组共转染于MDBK细胞，获得BRVAgG毒株，再以该毒株为基础用同样的操作过程获得最终要构建的疫苗株IBRVAgG/ΔΤΚ。为深入评价用该重组牛传染性鼻气管炎病毒基因工程毒株制备的牛传染性鼻气管炎病毒疫苗在防制牛传染性鼻气管炎中的应用，用制备的疫苗在试验动物(日本大耳白兔，购自湖北省疾病预防控制中心)进行了免疫效果评价及安全评价。本发明的主要优点是1、本发明通过同源重组的方法将牛传染性鼻气管炎病毒gG，TK基因完整或部分缺失，从而使得重组病毒株不能表达牛传性染鼻气管炎病毒的gG蛋白和TK胸苷激酶，与针对gG蛋白的单克隆抗体配建立一种鉴别诊断方法，为牛传染性鼻气管炎的预防、净化奠定■石出。2、本发明构建的gG，TK基因缺失株不含报告基因，应用于疫苗更加安全。3、本发明所缺失的TK基因是IBRV的毒力基因，缺失后该病毒的毒力明显降低，动物(兔)实验表明该病毒毒力大大降低，而对机体的免疫没有影响。更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。1、序列表SEQIDNO:1是gG基因上游同源臂(包含gG全长序列，gG下游同源臂)的核苷酸序列。2、序列表SEQIDNO2是报告基因EGFP的核苷酸序列。3、序列表SEQIDNO3是TK基因上游同源臂(包含TK全长序列，TK下游同源臂)的核苷酸序列。图1是本发明的基本流程示意图。基本步骤是先将重组转移质粒和IBRV(牛传染性鼻气管炎病毒)基因组共转染于MDBK(牛肾传代细胞)，以报告基因为标识，挑取发绿色荧光的空斑；再把含有报告基因的病毒基因组与重组转移质粒共转染，将报告基因敲除，获得单基因缺失株，之后用同样的过程构建双基因缺失株。图2是重组转移质粒pcDNA3.I-ZYP的构建流程图。图3是重组转移质粒ZPF08-16的构建流程4是重组转移质粒pcDNA3.1-ZYP-I的构建流程图。图5重组转移质粒ZPF08-16-1的构建流程图。图6gG基因上游同源臂PCR扩增结果。图中LaneM:DL2000DNAMarker；Lane1gG基因上游同源臂，大小为IOOObp。图7:gG基因下游同源臂PCR扩增结果。图中LaneM:DL2000DNAMarker；Lane1:gG基因下游同源臂，大小为800bp。图8:EGFP表达盒的PCR扩增结果。图中LaneM:DL2000DNAMarker；Lane1由PCR扩增出的1.9kbEGFP表达盒。图9是本发明的重组转移质粒pcDNA3.I-ZYP转移质粒酶切鉴定图。M:DL15000DNAMarker；1用HindIIIandEcoRI双酶切，结果可见两条带，大小分别为5.5kband3.7kb；2用KpnI单酶切，结果可见一条9.2kb大小的DNA片段。图10:zPF08_16酶切鉴定图。图11是本发明构建的IBRVAgG/EGFP+PCR扩增鉴定图。图中Linel:2号空斑(IBRVΔgG/EGFP+)Line21号空斑(IBRVΔgG/EGFP+)Line3阳性对照，Line4阴性对照LineM:DL25000DNAMarker,Line5阴性对照Line6阳性对照，Line72号空斑(IBRVΔgG/EGFP+)，Line81号空斑(IBRVΔgG/EGFP+)。图12是本发明构建的IBRVAgG/EGFP+westernblot图。图中Linel对照，Line2ΔgG/EGFP+，Line3:IBRV,Line4=Marker0图13是本发明构建的IBRVAgG去掉了EGFP后荧光显微镜下空斑图。图14是本发明构建的IBRVAgGKPCR扩增鉴定图。Linel:DL2000,Line2对照，Line3:IBRV,Line4_7=IBRVAgG0图15是本发明18欣八86基因组与#08_16成功共转染后图片。图16是本发明构建的IBRVAgG/ATK/EGFP+PCR鉴定图。图Linel:DL2000，Line2阴性对照，Line3阳性对照，Line4_6三对不同引物扩增IBRVΔgG/ΔTK/EGFP+。图17是构建的IBRVAgG/ΔTK的PCR鉴定图。图中，Linel-2:IBRVΔgG/ΔΤΚ，Line3-4JBRV野生型。M:LD2000图18是构建的IBRVΔgG/ΔTKwesternblot图。图中Linel=Marker,Line2IBRV，Line3=IBRVΔgG/ΔTK,Line4阴性对照(MDBK细胞总蛋白)。图19是本发明构建的IBRVAgG/ΔTK株用于兔体试验后，在急性感染期，潜伏期以及再激活期间分毒情况。图20是是本发明构建的IBRVAgG/ΔTK免疫实验动物兔子后，中和抗体产生情况。具体实施例方式实施例11.引物设计将质粒pEGFP-Cl(购自Becton，DickisonandCompany)用BamHI和BglII双酶切，T4连接酶连接后作为模板，扩增标记基因EGFP，并引入酶切位点为KpnI、BamHI，片段大小约为1900bp；根据GenBank上发表的牛传染性鼻气管炎病毒基因组的全长核苷酸序列(GenBank登录号AJ004801)，设计两对引物，以IBRVprecipitationDNA为模板，分别扩增gG基因的上下游同源臂，设计的酶切位点为Hindlll、KpnI，片段大小约为800bp，1000以及本发明的中间产物PCR鉴定引物(引物由上海生工生物工程技术有限公司合成)分别如下(以下引物都可以在上述《》中所述的SEQIDN0:l-3的序列中识别，可得知本发明及其中间产物中所缺失基因的大小及PCR鉴定时所扩增出的片段大小)SEQIDNO4P1:5，cgtgcgctaagetttcgcattateeggc3，(HindIII)(gG上游同源臂上游引物)SEQIDNO5P2:5，tgtggtaccgcttgcgctcgcgttc3，(KpnI)(gG上游同源臂下游引物)SEQIDNO6P3:5，cgaactgaggtacctacagcgtgagc3，(KpnI)(艮告基因上游引物)SEQIDNO7P4:5，cgcgttaggatecattgatgagtttgg3，(BamHI)(艮告基因下游引物)SEQIDNO8P5:5，atcgccggatccccacgccgccccgac3，(BamHI)(gG下游同源臂上游引物)SEQIDNO9P6:5，tgctcggaattcegggccgggaagcacgcg3，(EcoRI)(gG下游同源臂下游引物)SEQIDNO10P75'aaactctagacgcccgagcgccatgg3‘(TK上游同源臂上游引物)XbaISEQIDNO11P85'cgagaattccacttaaggcgtccgt3‘(TK上游同源臂下游引物)EcoRISEQIDNO12P9:gacgcgaattcacgcgttaagatacaEcoRI(报告基因上游同源臂上游引物)SEQIDNO:13P10:agggtagaattcagaatacctacagcgtEcoRI(报告基因下游弓I物)SEQIDNO14P11:tgccggaattctacccgggcggcg(TK下游同源臂上游引物)SEQIDNO15P12:aggaagcttagccccaccgccagccgag(TK下游同源臂下游引物)以下引物为鉴定缺失基因的引物SEQIDNO16P135'acgccgaccgcctcctacaccagatS'(鉴定gG)SEQIDNO17P145'aatcgacgctcaagtcagaggtggcg3，(鉴定gG)SEQIDNO18P155'acgccgaccgcctcctacaccagat3'(^^gG)SEQIDNO19P165'atcacatggtcctgctggagttcgtg3，(鉴定gG)SEQIDNO20P175‘acgccgaccgcctcctacaccagat3，(鉴定gG，完整缺失的)SEQIDNO21P185'atcacatggtcctgctggagttcgtg3”(鉴定gG，完整缺失的)SEQIDNO22P19:5，acgggctgggaaagacaacaacgg3，(鉴定TK)SEQIDNO:23P205‘ccggatctagataactgatcataatcagc3‘(鉴定TK)SEQIDNO24P21:5，ctcaagtcagaggtggcgaaacccg3，(鉴定TK)SEQIDNO:25P225'gcggacacgtccagcacgaaca3‘(鉴定TK)SEQIDNO26P235‘acgggctgggaaagacaacaacgg3，(鉴定TK)SEQIDN0:27P24:5‘gcggacacgtccagcacgaaca3'(鉴定TK)2.DNA3.I-ZYP质粒的构建(见附图2、6、7、8、9)根据GenBank上发表的牛传染性鼻气管炎病毒基因组的全长核苷酸序列(GenBank登录号AJ004801)，设计两对引物，以IBRV的DNA为模板，分别扩增gG基因的上下游同源臂，设计的酶切位点为HindIII、KpnI，用pi、p2，p5、p6引物分别扩增出约1050bp和887bp的特异性片断，与预期大小相符，如箭头所示(图6、7)，上游同源臂扩增反应条件为95°C5min，94°C45s,48°C45s,72°C90s,35cycles,72°CIOmin,holdin4°C。反应体系Template1.0μL,SmmoVLP15.0μL,5mmol/LP25·0μL，Taql.0μL，DMSO2.0μL,H2O29μL；下游同源臂扩增反应条件为95°C4min，94°C45s,60°Clmin,72°C100s,35cycles,72°CIOmin,holdin4°C。Template1.0μL,IOXbuffer5.0μL，Immo1/LdNTP2.0μL,5mmol/LP55.0μL,5mmol/LP65.0μL,Taq1.0μL,DMSO2.0uL,H2O29μL0回收之后连接到pMD18_T载体，测序结果显示，上下游同源臂分别为1050bp和887bp，与GenBank登录序列IBRV(登录号AJ004801)的同源性分别为98%和99%。将质粒pEGFP-Cl用BamHI和BglII双酶切，T4连接酶连接后作为模板，扩增标记基因EGFP，并引入酶切位点为KpnI.BamHI，片段大小约为1900bp；将质粒pEGFP-Cl用BamHI和BglII双酶切修饰，T4连接酶连接后作为模板，扩增报告基因EGFP表达盒，扩增出约1939bp的片段，与预期大小相符，如图8箭头所示。PCR反应条件为95°C5min,94°C30s,40°C45s,72°C90s，35循环，72°CIOmin保存在4°C中，Template1.0μL,IOXbuffer5.0μL；lmmol/LdNTP2.0μL,5mmol/L；P35.0μL,5mmol/LP45.OMl；Taq1.0μL,DMSO2.0μL,H2O29μL。将扩增出的上游同源臂及载体pcDNA3.1酶切后用Τ4连接酶(购自宝生物工程(大连)有限公司)16°C连接过夜，同理，下游同源臂及报告基因EGFP也连接到pcDNA3.1中，最终构建成转移载体DNA3.1-ZYP，其质粒的酶切鉴定见图9。3.重组质粒ZPF08-16的构建。(见附图3、10)根据GenBank上发表的牛传染性鼻气管炎病毒基因组的全长核苷酸序列(GenBank登录号AJ004801)，设计两对引物，以IBRVprecipitationDNA为模板，分别扩增TK基因的上下游同源臂，设计的酶切位点为XbaI.HindIII，用p7、p8，pll、pl2引物分别扩增出约1070bp和1150bp的特异性片断，与预期大小相符，如箭头所示(图10)，上游同源臂扩增反应条件为95°C5min，94°C45s,58°C45s,72°C90s，35循环，72°CIOmin,保存在4°C中。反应体系Template1.0μL,5mmol/LP75.0μL,5mmol/LΡ85·0μL，Taq1.ΟμL,DMSO2.0μL,H2O29μL；下游同源臂扩增反应条件为95°C4min，94°C45s,60°Clmin，72°C100s，35循环，72°ClOmin，保存在4°C中。Template1.ΟμL,IOXbuffer5.0μL,Immol/LdNTP2.0μL,5mmol/LP115.0μL,5mmol/LP125.0μL,Taq1·0μL，DMSO2.OuUH2O29μL0回收之后连接到pMDIS-T载体，测序结果显示，上下游同源臂分别为1050bp和1150bp，与GenBank登录序列IBRV(登录号AJ004801)的同源性分别为98%和97%。4.重组转移质粒pcDNA3.1-ZYP-I的构建(见附图4)将重组质粒pcDNA3.1-ZYP进行双酶切，反应体系分别为限制性内切酶HindIII，KpnI各3μL，重组质粒pcDNA3.I-ZYP5μL,Mbuffer,3μL,dH2019μL；限制性内切酶HindIII，KpnI各3μL，重组质粒pcDNA3.14μL，Mbuffer,3μL,dH2020μL。跑胶分别回收gG上游同源臂lOOObp，载体5400bp。再将回收的片段放于反应体系为T4DNAIigase(购自宝生物工程(大连)有限公司)0.51^34DNAIigaseBuffer(购自宝生物工程(大连)有限公司)1μL，回收产物gG上游同源臂5μL，载体3.5μL，16°C连接过夜。再将重组质粒pcDNA3.I-ZYP进行双酶切，反应体系分别为限制性内切酶BamHI，EcoRI各3μL，重组质粒pcDNA3.I-ZYP5μL,IOxKbuffer,3μL,dH2019μL；限制性内切酶BamHI，EcoRI各3口1^，含有86上游同源臂的？00嫩3.1载体4“1^，1(^Kbuffer,3μL,dH2020yL。跑胶分别回收gG下游同源臂860bp，载体6400bp。16°C连接过夜，反应体系为T4DNAIigase0.5μL,Τ4DNAligaseBuffer1μL，回收产物gG下游同源臂5μL，载体3.5μL。5.ZPF08-16-1的构建流程(见附图5)将重组质粒ZPF08-16进行双酶切，反应体系分别为限制性内切酶Xbal，EcoRI各3μL，重组质粒zPF08-165μL,IOxMbuffer,3μL,dH2019μL；限制性内切酶Xbal，EcoRI各3μL，重组质粒pBSK4μL,IOxMbuffer,3μL,dH2020μL。跑胶分别回收TK上游同源臂约1060bp，载体3000bp。再将回收的片段放于反应体系为T4DNAligase()0.5μL,Τ4DNAligaseBuffer1μL，回收产物TK上游同源臂5μL，载体3.5μL，16°C连接过夜。再将重组质粒zPF08-16进行双酶切，反应体系分别为限制性内切酶Hindlll，EcoRI各3μL，重组质粒zPF08-165yL，IOxMbuffer,3μL,dH2019μL；限制性内切酶Hindlll，EcoRI各3yL，含有TK上游同源臂的pBSK载体4μL，IOxMbuffer,3μL,dH2020μL0跑胶分别回收TK下游同源臂1130bp，载体4060bp。将回收的片段放于反应体系为T4DNAligase0.5μL,Τ4DNAligaseBufferlμL，回收产物TK下游同源臂5μL，载体3.5μL。16°C，连接过夜。6.重组牛传染性鼻气管炎病毒ΔgG/EGFP+缺失株的构建及鉴定(见图11)①在MDBK细胞(购自中国兽药监察所，北京)上增殖牛传染性鼻气管炎病毒IBRV亲本株(株号=BarthaNu/67株，购自中国兽药监察所)提取牛传染性鼻气管炎病毒基因组DNA，方法如下待MDBK细胞病变达80%以上，收集病毒，蔗糖梯度离心，25000rpm,处理2h。用TE溶解，加十二烷基磺酸钠(SDS)裂解液裂解及RNA酶水浴30mins，再加蛋白酶K水浴作用30mins；然后用苯酚氯仿异戊醇(体积比为25241)抽提四次，用无水乙醚去除苯酚、氯仿和异戊醇，最后用无水乙醇将病毒基因组沉淀出来。②将制备好的病毒基因组与线性化(将上下游同源臂从DNA3.I-ZYP转移质粒酶切下来)共转染于MDBK细胞，挑取发绿色荧光的空斑，将其纯化引物，pl3、pl4，pl5、pl6PCR检测，大小约为380bp禾口480bp结果如图11所示，Line7、8用的引物为pl3、pl4；LineU2用的引物为pl5、pl6.③Western-blotting鉴定将.重组ΔgG/EGFP+缺失株接种于刚长成单层的MDBK细胞，16小时后收集病变细胞。按常规方法(萨姆布鲁I，弗里奇E和曼尼阿蒂斯T著，分子克隆实验指南，第二版，金冬雁等译校，科学出版社，1998年)制备样品，进行SDS-PAGE和Western-blotting鉴定，结果如图8所示。经过Western-blotting分析，感染重组ΔgG/EGFP+缺失株的MDBK细胞泳道，发现其不可以与牛传染性鼻气管炎病毒阳性血清在约65KD处发生反应，而感染野生型IBRV的MDBK细胞可以反应，如图12所示，说明已将gG基因成功敲除掉。7.重组牛传染性鼻气管炎病毒AgG缺失株的构建及鉴定将纯化好的重组牛传染性鼻气管炎病毒ΔgG/EGFP+缺失株作为亲本，进行扩增，提取重组牛传染性鼻气管炎病毒AgG/EGFP+缺失株基因组DNA，方法同①。将转移质粒DNA3.1-ZYP-1将其线性化，与所述的牛传染性鼻气管炎病毒AgG/EGFP+基因组共转染，操作方法同上述②，挑取不发绿色荧光的空斑，纯化(如图13所示)。通过PCR检测，获得结果如图14所示，片段大小为330bp，与预期的片段大小相符。8.重组IBRVΔgG/ΔTK/EGFP+的构建及鉴定先增殖牛传染性鼻气管炎病毒IBRVAgG，然后提取牛传染性鼻气管炎病毒IBRVΔgG基因组DNA，再与zPF08_16共转染，操作方法同上述①②，进而成功构建了牛传染性鼻气管炎病毒IBRVAgG/ATK/EGFP+，将该毒株命名为重组牛传染性鼻气管炎病毒GAZH-2009-01，得到如图15所示的结果。通过PCR检测，其鉴定结果如图16所示。由图16，自左至右分别为部分的gG上游同源臂及基因全长加上部分gG的下游同源臂长度为1680bp左右，部分TK上游同源臂及TK基因全长加上部分TK下游同源臂的长度为887bp左右，以牛传染性鼻气管炎病毒18欣八86/八11(/^6+为模板，分别用引物？17、？18，？19、？20，？21、p22，分别扩增出330bp，300bp，360bp大小的带。PCR反应条件为95°C5min,94°CImin62°Clmin，72°Cmin，30个循环，72°ClOmin，保持4°C中。该牛传染性鼻气管炎病毒缺失株GAZH-2009-01已于2009年7月3日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCCNO:V2009109.重组IBRVΔgG/ΔTK的构建及鉴定将质粒zPFOS-16中的EGFP报告基因切除，即只含上下游同源臂，将其线性化，与IBRVΔgG/ΔTK/EGFP+基因组共转，方法同①，挑取不发绿色荧光的空斑，纯化，通过PCR检测，结果如图13所示。方法如下Linel以IBRVΔgG/ΔTK为模板，p23、p24为引物，扩增出约230bp的片段，Line2同样以IBRVΔgG/ΔTK为模板，pl7、pl8为引物，扩增出约330bp大小的片段，与预期大小相符，Line3、4是以IBRV为模板，分别用pl7、pl8，p23、p24为引物，扩增出部分gG上下游同源臂及gG全长基因序列和部分TK上下游同源臂及TK基因全长，片段大小为分别1670bp，870bp左右。PCR反应条件为95°C5min,94°Clmin62°Clmin,72°Cmin，30循环，72°ClOmin，保存在4°C中。Western-blotting鉴定方法同前③，但不同的是一抗为gG蛋白多抗。经过Western-blotting分析，感染重组IBRVΔgG/ΔTK缺失株的MDBK细胞泳道，发现其不可以与牛传染性鼻气管炎病毒阳性血清在约65KD处发生反应，而感染野生型IBRV的MDBK细胞可以反应，如图14所示，说明gG基因仍然被敲除掉了。7.重组IBRVΔgG/ΔTK缺失株的兔体实验将重组IBRVΔgG/ΔTK双基因缺失株在长满的单层MDBK细胞上增殖，于_80冰箱冻融三次，收毒，测出毒价为5X107PFU/ml，以每只日本大耳兔(购于湖北省疾病预防控制中心)鼻腔内滴灌3XIO7PFU个病毒，同时以IBRVAgG及野生型IBRV为对照，攻毒途径及剂量同IBRVAgG/ΔTK组。定期采集鼻拭子和血液分离血清，并且在第21天打地塞米松。鼻拭子分度结果证明，IBRVAgG/ΔTK缺失株感染兔子后，急性感染期的时间与IBRVAgG和野毒比，明显缩短，并且当打地塞米松(3.8mg/kg体重)后，IBRVAgG和野毒组的病毒都能被再次激活，而本发明制备的IBRVAgG/ΔTK毒株组则不能被再激活。发明效果见图19所示。采集血液分离的血清测得各组攻毒后的中和抗体效价结果显示了各个组的中和抗体水平比较接近，其中IBRVAgG/ΔTK组的中和抗体水平并没有因gG和TK两个基因的缺失而降低(参见图20)。序列表<110>华中农业大学<120>一种缺失gG和TK基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒和应用<130><141>2009-12-17<160>27<170>PatentInversion3.1<210>1<211>3215<212>DNA<213>牛传染性鼻气管炎(InfectiousBovineRhinotracheitis)<220><221>gene<222>(1)..(3215)<223><400>1aagctttcgcattatccggcggttgacccccggctcggagggacgcgtgtttgaggcaac60ggggcctgctcccgcgcaggagcacgtggtgctcaagatcggggcctcggcctctacgct120ggccgaggctatgctactgcgaaccttggaccacgccaacgtggtcaagctgaaggccgt180gctcttccacggggagctggtgtgcgtggtgctggcgcgctaccgcgaggacctgcacac240gcacctctggagaatcaaccgcccgctggcgctccccgcggcgctggcggtgacgcgggc300cgtgctgcggggcctcgcgtacctgcactcccgccggatcgctcaccgggacgtcaaaac360ggaaaacgtcttcctcaacggcccaggcgacgtgtgcctgggcgactttggcgcggcaca420cgggccggtcaccgagccccgctactacggcctggccggcaccctggagacgaactcgcc480agagctgctggcgcgcgcgcgctacgactgccgcacggacgtgtggagcgcgggcgtcgt540cgcgtacgagatgctggcatacccgcgcgcgctgttcgacagccccgcgggcccgcaggg600cgaggacgccgaggcatcgggcccgccgacgatcttgggcgaccgcgactgcgcccggca660gctgctccgcgtgattcgccggctggccgtgcacgccgaagagtttccacccagccccac720tgaccggctgacccgcaacttcaagcgccacgcgagcacgcgccgagagccgcacagccc780gtaccgctgcctggcggtgctccggctgccctgcgacgccgaccgcctcctacaccagat840gctgacctttgactttcgcgcgcgccccaccgccgcggagctgctggagcaccccgtctt900cggtgcggcctcggggtagccccgggggtttcccgcaaaactgaggcatataaggcgcgg960gcaccggcaagtttggcatccacacttcgcgctgtggacacgagagcgaacgcgagcttg1020gccgccgtcgccctaatcctgctctgcggggccgccgttttggggcgccccgcgcccgac1080gacctctgtttcgccgacgtgcgccgcactggcatggcgccctcccgcccgctggggccc1140gtcctgaacctagcggcctcggatttgacctcgcgggtttcggtgcgcgcggtggacgct1200tcgcgcggctgcgccctggccctcttggacatggcggagacggtggtgcccggcggaccg1260cgagccgccgacgtcgtcgacgtcggctgggcttaccaagacggggactgcatggtgcct1320ctggcatatcgccagtactttaactgcacggggggcgcgctgcccggccaaaacgtctgc1380gccgggctctctgagacccgcatccgcggtggctttggaacctccgactacgcgctctac1440gggacgtcgctagtactgcgccccggcctgtacgaccgcgggacctacatctacttcctt1500ggatacggcccagacgacatctacgtgggcagcgtcacgctcatggtgggcgccgacatc1560cacaaatacccctgcgggctggaccgagggctcggtgtggccctgcaccacaagagcgga1620ccggcccgacctctgacagaggacgacgccaccggcgactgggcctgcggctgcttcccc1680gcccttgttgaggttgacgcggtgtggggcaacgtaagcgccgcagagctgggcctggcc1740gacccgatcgactacgccgacgaagggggtgaggtcgaagtgctcgaggacgaagccggg1800agcgccagcggaaacctgccgcaggacgaccccgaccccgacctcgcagattgccggacc1860gtcgggctctttagcgaaagcgacatgttccggaccgccagcgggcccgaatcgctgctg1920atcggcgccgttgccaaggacgtcctgacggtgcccctcaatctgccgcccggccgctct1980tacgaggccctgcgaaacgcatcgctggagtgcaactcccgcccgcgcgagaccggcgac2040gcagcggtggtggtgatgtctctccaggagcccgctcgcctcgagcgccgccccgatgcc2100cgcgccaccgatccggagtttgggctctttggcctgcccgatgaccccgccgtgcggcgc2160ggcattctcatcggcctcgcgatcgctctgctggtgctgctgttttcgctggtgatcgtg2220ctcgtctgcgcctgccggctcgcccgcgcagccaaggctgcgcgacgcgcccgcgccgcc2280acgttcgccaagagcaaccccgcgtacgagccgatgctcagcgtctgatcgccggcaccc2340cacgccgccccgaccccgctgtcccgcgtttacaataaacagttattcttaccaacgttg2400gtgcgcctgtcgcgtgtctattgcgagttaaaccgagtgccccacccaggcagggcgggg2460gttgggccgggccgcagccccggctgggtatatatccccgacgggcgactagagatacac2520tcgccccgcgcggctgctgcgagcgggcgaacatgcaagggccgacattggccgtgctgg2580gcgcgctgctcgccgttgcggtgagcttgcctacacccgcgccgcgggtgacggtatacg2640tcgacccgccggcgtacccgatgccgcgatacaactacactgaacgctggcacactaccg2700ggcccataccgtcgcccttcgcagacggccgcgagcagcccgtcgaggtgcgctacgcga2760cgagcgcggcggcgtgcgacatgctggcgctgatcgcagacccgcaggtggggcgcacgc2820tgtgggaagcggtacgccggcacgcgcgcgcgtacaacgccacggtcatatggtacaaga2880tcgagagcgggtgcgcccggccgctgtactacatggagtacaccgagtgcgagcccagga2940agcactttgggtactgccgctaccgcacacccccgttttgggacagcttcctggcgggct3000tcgcctaccccacggacgacgagctgggactgattatggcggcgcccgcgcggctcgtcg3060agggccagtaccgacgcgcgctgtacatcgacggcacggtcgcctatacagatttcatgg3120tttcgctgccggccggggactgctggttctcgaaactcggcgcggctcgcgggtacacct3180ttggcgcgtgcttcccggcccgggattacgagcaa3215<210>2<211>1941<212>DNA〈213〉牛传染性鼻气管炎(InfectiousBovineRhinotracheitis)〈220〉<221>gene〈222>(1)..(1941)〈223〉<400>2ggtacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggaca60ggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaa120acgcctggtatctttatagtcctgtcgggttttttgtgatgctcgtcaggggggcggagc180ctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggcctttt240gctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgccatg300cattagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagtt360ccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgccc420attgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacg480tcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatat540gccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgccca600gtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctat660taccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacg720gggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatca780acgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcg840tgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagcg900ctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc960ctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgag1020ggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgccc1080gtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctac1140cccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccag1200gagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttc1260gagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggc1320aacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggcc1380gacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggc1440agcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctg1500ctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaag1560cgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggac1620gagctgtacaagtccggactcagatctcgagctcaagcttcgaattctgcagtcgacggt1680accgcgggcccgggatccaccggatctagataactgatcataatcagccataccaca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技术领域：
，具体涉及一种gG和TK基因缺失的重组牛传染性鼻气管炎病毒、基因工程疫苗及应用。本发明制备的重组牛传染性鼻气管炎病毒毒株IBRVΔgG/ΔTK保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNoV200915，该毒株缺失了gG、TK基因，不含外源基因。本发明的中间毒株即重组牛传染性鼻气管炎病毒GAZH-2009-01，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNoV200910，该毒株缺失了gG、TK基因并含有报告基因EGFP。本发明还公开了重组牛传染性鼻气管炎病毒IBRVΔgG/ΔTK在牛传染性鼻气管炎的基因工程疫苗的制备上应用和防治牛传染性鼻气管炎病毒病上的应用。文档编号C12N7/01GK101818130SQ20091027335公开日2010年9月1日申请日期2009年12月24日优先权日2009年12月24日发明者付书林,刘正飞,张敏敏,郭爱珍,陈焕春申请人:华中农业大学