专利名称：：一个棉纤维特异表达基因GhPRP5及其启动子的制作方法
技术领域：
：本发明涉及棉花基因。具体是一个纤维特异表达的编码富含脯氨酸蛋白(proline-richprotein)基因GhPRP5及其启动子的克隆及其表达活性与功能鉴定。
背景技术：
：棉花是我国重要的经济作物，与我国2亿农民的收入和1900万纺织工人的就业息息相关。随着纺织工业快速发展和人民生活水平不断提高，纺织工业及其相关产业对棉纤维品质的要求愈来愈高。我国皮棉总产量世界第一，单产量也居五大产棉国首位，但我国棉花纤维品质差，不能用作一些高附加值高质量纺织产品的生产原料。因此，我国每年需进口优质皮棉100多万吨，造成国产原棉的积压。纤维品质问题已成为制约我国棉花产业可持续发展的主要障碍之一。棉花遗传改良的最终目标是提高棉花纤维的产量和品质。棉纤维的产量和品质不仅受环境因素的影响，而且受相关基因特别是纤维特异表达基因的调控。目前，国内外除了利用常规育种手段外，还逐步运用遗传工程对棉纤维品质进行遗传改良。将优良的农艺性状，特别是纤维品质相关的优良性状引入棉花主栽品种，不仅可提高棉花产量和纤维品质，降低生产成本，而且可减轻对环境的不利影响。而该工作的开展首先依赖于对棉纤维发育相关基因及其调控元件的识别与分离。通过克隆纤维强度、细度和长度等关键功能基因和核心调控元件，分析纤维发育相关基因间的互作、基因的表达调控及表达产物的生物学功能，阐明纤维发育的分子机制，揭示棉纤维品质性状形成的遗传基础，为高效改良纤维品质提供理论依据和基因元件。在棉纤维的品质改良中，特异启动子是首选的基因工程元件，它决定基因表达强度、时间和纤维特异性。为了使外源基因在目标组织中得以充分表达，不同的性状需要不同的启动子。用于改良棉纤维品质的重要目标基因需要在棉纤维中特异表达，因而必须使用纤维特异性启动子驱动该基因的表达，达到改良纤维品质之目标。而且，外源目标基因的组织特异性表达也可避免外源基因对非目的组织生长发育的不利影响。应用棉纤维特异表达启动子，可在棉纤维发育的特定阶段表达外源基因，加速对纤维品质的重要指标如强度、细度、长度等的改良，还可以给纤维增添新的品质性状抗皱、抗縮、色泽等。已有的研究证明，克隆棉纤维特异表达启动子是遗传工程途径改良棉纤维的先决条件。因此，高特异性、高活性的启动子和功能基因的克隆与鉴定研究是棉纤维品质改良和分子育种的重要内容。据报道，美国、日本、澳大利亚和以色列等国家都已有大量的棉纤维发育基因及相应启动子的专利。富含脯氨酸的蛋白质(Proline-RichProteins,PRPs)代表一类富含脯氨酸(proline,Pro)和羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)的结构蛋白质，这类蛋白质在双子叶植物如大豆、胡萝卜和紫花苜蓿及单子叶植物如玉米和小麦等植物中广泛存在，而且被认为在建造围绕特定细胞型的初生壁结构方面起作用。这类蛋白质最普遍的特点就是Pro残基含量高，至少有两个连续的Pro排列在氨基酸链中。它们最先在胡萝卜贮藏根中被认为是外界伤害诱导的基因产物，后来的研究显示它们在很多植物中表达，参与植物发育的不同方面。例如，种子萌发，豆荚形成，早期结瘤等。PRP基因的表达还受伤害、真菌、乙烯、细胞培养、干旱和光照影响。
发明内容本发明的目的在于提供一个新的棉纤维特异的PRP基因(GhPRP5)及其启动子，分析揭示基因和启动子表达活性与功能，探索其对纤维发育调控的分子机制，进而应用该基因元件改良棉纤维品质，创造棉花优良品种。在最新的研究中，本发明人从棉纤维cDNA文库中分离了10，000多个棉花cDNAs，通过生物信息学分析，获得100多个可能编码细胞壁蛋白的基因。利用点杂交技术，从这些候选基因中初步筛选出15个纤维特异或高水平表达的细胞壁蛋白基因，并进一步利用Northernblotting杂交技术和定量RT-PCR技术双重验证这些候选基因的表达谱。对其中的一个棉纤维特异性基因，本发明人命名为GhPRP5。GhPRP5cDNA包含546bp的开放阅读框架，编码一个182氨基酸的蛋白质，其分子量为20.57KD，等电点(pl)为8.84，富含Pro(13.2%)，Lys(13.7%)，Glu(8.8%);BLASTN分析未发现与它同源性较高的基因序列，与其他序列之间只有3%_15%的同源性。BLASTP分析显示其与已有报道的植物PRP蛋白的同源性也较低，表明该蛋白是一个新的富含脯氨酸的蛋白质。GhPRP5不含有规律的富含脯氨酸的重复序列，但含有一个富含脯氨酸的19肽(PCYFGGPPPPPYYWPYGRP)，此重复序列与已有的植物PRP蛋白中存在的脯氨酸重复基序(proline-richr印eats)是不同的，暗示新的功能单位蕴藏在这些蛋白质中。与目前报道的五大类PRP蛋白的脯氨酸重复基序有较大差异，表明该蛋白是一个新的植物PRP蛋白。利用定量RT-PCR技术对该基因在棉花不同组织中的表达谱进行了分析，结果表明GhPRP5基因在棉纤维细胞中特异表达，在棉花其它组织中表达非常微弱或几乎检测不到。进一步研究GhPRP5在棉纤维发育不同阶段的表达情况发现，该基因在棉纤维发育早期(开花后2天)开始表达，在开花后5天的棉纤维细胞中表达最强，在开花后IO天的棉纤维中表达量有所下降，而在纤维伸长后期(开花后15-20天)其表达维持在一个较低的水平。Northern杂交分析结果和RT-PCR分析结果是一致的。为进一步研究GhPRP5基因的组织特异性表达调控，本发明人分离了该基因的启动子。启动子分离采用基因组步移试剂盒(GenomeWalkerUniversalKit，BDBiosciencesClontech，Cat.No.638904)，首先建立棉花基因组步移文库，然后按照GhPRP5基因序列设计CP1和CP2引物，PCR扩增该棉花基因组步移文库，分离获得了GhPRP5基因的5'-上游序歹lj，该序列长度为2217bp。利用PlantCARE(http:〃bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析启动子中的顺式作用元件时发现，除存在真核生物典型启动子所具有的CAATbox,TATAbox夕卜，该启动子还含有其他一些顺式作用元件，如光应答元件(AAAACGTTTA，ATTAATTTTACA，ATTAAT，TTTCAAA)，脱落酸(ABA)应答元件(CACGTG)，乙烯应答元件(ATTTCAAA)，水杨酸(salicylicacid)应答元件(CCATCTTTTT)，赤霉素应答元件(TCTGTTG)，创伤应答(wound-responsive)元件(TCATTACGAA)，以及其它一些调控兀件(例如，Elicitor-responsiveelementAAACCAATT，theanaerobicinductionelementTGGTTT，MeJA—res。onsivenessCGTCA—motif,MYBbindingsiteinvolvedindrought-inducibilityCGGTCA，CAACTG，TAACTG)。因为拟南芥和烟草叶表皮毛与棉纤维(种皮毛)在起源、结构和遗传上都具有同源性，而且国内外一些研究者已经成功地利用了5这两个异源系统来检测棉纤维特异启动子的活性。因此，本发明也应用拟南芥和烟草来研究GhPRP5启动子活性。我们构建了GhPRP5启动子与GUS报告基因的融合表达载体，利用农杆菌介导的DNA转移技术将之导入拟南芥和烟草，获得转基因植株。对转基因拟南芥和烟草植株的组织化学染色结果显示，GhPRP5启动子驱动GUS基因在拟南芥叶表皮毛中特异表达，在烟草叶表皮毛中也有强烈的表达活性，证实了该启动子是棉纤维特异的，可用作基因工程改良棉纤维品质的基因调控元件。应用RNA干涉(RNAi)技术，研究了GhPRP5基因在棉纤维发育和品质性状形成中的功能。构建了GhPRP5的RNA干涉载体，并转化棉花，获得48株棉花转基因植株。PCR检测表明，外源DNA已导入棉花基因组。对这些转基因植株中GhPRP5基因的表达分析表明，GhPRP5的表达受到抑制。由于该基因的表达量显著降低，大多数棉花转基因植株的棉纤维细胞伸长缓慢，纤维长度变短，表明GhPRP5基因对棉纤维发育起重要作用。本发明的优点1、提供了一个新的棉纤维特异表达GhPRP5基因的全长cDNA序列，其基因序列和翻译的蛋白质序列与国际公共资料库Genbank中的相关序列只有不到15%同源性，它含有新的富含脯氨酸的重复序列。2、提供了一个新的棉纤维特异表达的GhPRP5启动子序列，分析了其含有的顺式作用元件以及在拟南芥和烟草表皮毛中特异表达，为纤维品质改良提供了特异的调控元件。3、该基因在棉纤维伸长期高水平表达，若抑制该基因表达，则棉纤维发育受阻，长度变短，说明该基因在棉纤维发育过程中起重要作用。本发明通过以下附图和实施进行进一步阐述，但并不限制本发明的范围。图1棉花候选细胞壁蛋白基因的点杂交。利用10dpa(10dayspostanthesis，表示开花后10天)棉纤维cDNA为探针，对186个候选细胞壁蛋白基因点杂交实验结果显示15个基因优势表达。图2Northern杂交分析GhPRP5的表达图中l-根，2-子叶，3-叶子，4-下胚轴，5-花瓣，6-花药，7-5dpa(daypostanthesis，开花天数)纤维，8-10dpa纤维，9-15dpa纤维，10-10dpa胚珠，ll_15dpa胚珠。图3荧光定量RT-PCR分析GhPRP5在棉花个组织中的表达图中l-根，2-下胚轴，3-子叶，4-花瓣，5-花药，6-纤维，7-胚珠。图4荧光定量RT-PCR分析GhPRP5在棉花发育阶段的表达图中l-2dpa(daypostanthesis,开花后天数)纤维;2-5dpa纤维;3-10dpa纤维;4-15dpa纤维;5-20dpa纤维。图5烟草叶柄GUS活性组织化学染色分析叶柄表皮毛均被染成蓝色，而其它组织细胞未被染色，表明在GhPRP5启动子的调控下GUS基因在表皮毛细胞中特异表达，从而证实该启动子在棉花中是纤维特异性的。图6拟南芥叶片等组织的GUS活性组织化学染色分析表皮毛均被染成蓝色，而其它组织细胞未被染色，表明在GhPRP5启动子的调控下GUS基因在表皮毛细胞中特异表达，从而证实该启动子在棉花中是纤维特异性的。图中A.10d拟南芥幼苗真叶；B.拟南芥成苗莲座叶；C.B图的放大；D.拟南芥成苗茎；E.花梗；F.花萼片。图7转基因棉花植株表型分析图中.A在培养室生长的转基因植株；B.转基因棉花植株的棉铃变小，纤维变短。具体实施例方式—个新的棉花PRP基因GhPRP5的克隆，表达及其启动子分离，表达分析1.棉花GhPRP5cDNA克隆鉴定从棉纤维cDNA文库中分离了10，000多个棉花cDNAs，通过生物信息学分析，获得180多个可能编码细胞壁蛋白的基因。利用点杂交技术(按李学宝，黄耿青，许文亮，王秀兰，汪虹，2005。棉花细胞壁蛋白基因分离鉴定与表达分析。华中师范大学学报(自然科学版)，39(4):509-513的方法进行)，从这些候选基因中初步筛选出15个纤维高水平表达的细胞壁蛋白基因，对每个序列重新测序比对，发现一个编码富含脯氨酸蛋白的基因，命名为GhPRP5。2.Northern杂交分析GhPRP5的表达(1)组织总RNA的提取(按LiXB，CaiL，ChengNH，LiuJW，2002.MolecularcharacterizationofthecottonGhTUBlgenethatpreferentiallyexpressedinfiber.PlantPhysiol.130:666-674进行)。(2)Northern杂交(按LiXB，CaiL，ChengNH，LiuJW，2002.MolecularcharacterizationofthecottonGhTUBlgenethatpreferentiallyexpressedinfiber.PlantPhysiol.130:666_674进行)。3.实时荧光定量RT-PCR分析GhPRP5基因的表达(1)组织总RNA的提取(按LiXB，CaiL，ChengNH，LiuJW，2002.MolecularcharacterizationofthecottonGhTUBlgenethatpreferentiallyexpressedinfiber.PlantPhysiol.130:666-674进行)。(2)实时荧光定量RT-PCR研究基因的表达(按照LiXB，FanXP，WangXL，CaiL，YangWC，2005.TheCottonACTINlgeneisfunctionallyexpressedinfibersandparticipatesinfiberelongation.PlantCell17:859-875进行)。首先，将棉花不同组织(根、下胚轴、子叶、花瓣、花药、开花后2天纤维、5天纤维、10天纤维和10天胚珠、15天纤维、20天纤维等)的总RNA(2iig/样)用SuperScriptTMIIRNaseH-ReverseTranscriptase(InvitrogenLifeTechnologies)反转录成cDNA;然后，以cDNA为模板，用基因特异的引物(GhPRP5RTPl和GhPRP5RTP2)和Real-timePCRMasterMix(T0Y0B0，Japan)进行定量PCR反应。棉花polyubiquitin基因(GhUBIl)作为RT-PCR反应的内标，目标基因每一个循环的扩增都被SYBR-Green荧光检测。每个基因的表达水平相对值按公式Y二10ACt/3.57X100X计算(其中ACt=CtGhUBIl-CtGhPRP5，3.57是利用GhUBIl制备的标准曲线y=-0.28x+9.87中斜率的倒数，表示基因表达相差10倍的PCR循环数)。重复3次，统计分析实验结果。4.启动子的分离(1)按照GenomeWalkerUniversalKit(BDBiosciencesClontech，Cat.7No.638904)的方法，用CP1和CP2引物从棉花基因组步移文库中分离了GhPRP5基因5'-上游区932bp片段；再进一步按照GenomeWalkingKit(Takara，codeD316)的方法，用引物Spl，Sp2，Sp3分离了932bp片段的上游序列，长1285bp。上述两个片段合计长度为2217bp。(2)以棉花基因组DNA为模板，在2217bp片段的5'端和3'端分别设计引物Flpl和Flp2，PCR扩增出整个2217bp长度的片段。本项目所用引物见下表1:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>5.启动子的表达分析启动子的顺式作用元件按照DlantCARE(htto:〃bioinformatics.osb.u咖t.be/webtools/olantcare/html/)进行，结果见表2。构建GhPRP5promoter:GUS融合表达载体，电击法分别转化农杆菌GV3101和LBA4404，然后分别转化拟南芥和烟草。GUS活性的组织化学染色分析按照LiXB，CaiL，ChengNH，LiuJW，2002.MolecularcharacterizationofthecottonGhTUBlgenethatpreferentiallyexpressedinfiber.PlantPhysiol.130:666-674介绍的方法进行。6.GhPRP5功能分析构建了GhPRP5的RNA干涉(RNAi)表达载体，转化棉花，通过1年多的转化实验，共获得48株转基因棉花植株。将这些转基因植株移栽到大田，生长发育至开花结实，然后分析转基因植株中GhPRP5基因表达的抑制程度和纤维品质及其它农艺性状。结果分析表明，GhPRP5的表达受到显著抑制。由于该基因的表达量显著降低，大多数棉花转基因植株的棉纤维细胞伸长缓慢，纤维长度变短，表明GhPRP5基因对棉纤维发育起重要作用。表2GhPRP5启动子中含有的顺式作用元件<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>661TTGTATTTACAAAATTGTTTGATAAMAAAAMAMAAMMAAMAMAA基因的编码区(0RF)从起始密码子ATG到终止密码子TAA(l-549bp)。2.GhPRP5基因编码区翻译的蛋白质序列如下1MGEKVTMVLKVDLQCRRCYKKVKQVLCKFPQIRDQIYDEKANTVTIKVVCCDPEKMRGK61IRCKGGDSIKSIEIKPPPKPKDPENSEKEPEKKTEKPTESEKKSEKPKETPPKSPAKQAS121PPEGFCCTDCYHGHRGGPCYFGGPPPPPYYWPYGRPVYVNWGGCGGSTYCYCFEENPQCS181VM3.GhPRP5基因上游启动子序列(包括5'端未翻译区和启动子片段)如下1TCAAATTGCAGCAGGCGACCATGGGTTTTGGCTTAGATCTTCATGAAGATCGATGGAATT61GGTGAGGTCTCATTTCATTATATCTTGAGAGAGGGAAATGGCTTGGCGGGTGCATTGGTT121AAAGGGGGAATTTTTCGAACCAGCTTATTCAAAGCATGGTGGTAGCAGATGTCAGGGTTT9181TTTTTTCTTTTCCTGTTGGGTTTATTTTATATGTTAACAGTGGAATTTTGTTTAATTTTA241GAGTTAAAAATTATCATATATTTTAATTCACATTTAAAAAAAAAGATATATAATAACTTT301TTAGATCCCACCACACCTCTAGTCTGATAAGATTCAAACTAACACCACAATATTTTAAAA361TATATTTTCTTAATTTAATTTTATAAAGATCCAAAAAAGATAAATTACAATATAGTTCAC421ACTAAAATAGTGTTGCTTTTATTTTGATCACTTTAATTTTTTTTGTCAATTTAGTCACCA481CTAAAATGATCACTTAATTATTAAACCTTTAACGAATTGCTTAGTGGACTAACAAAAAAA541GAGAAAAAAATATTTTTTAATCCCTTTAAAAATTACAAATTTTTTAAGTCAATCTCTTAA601ATTTCCATCAAAAACCCATATAAAATAGCATAAAAAAATGTTAAATCCAACCTTCAATAT661GCTTCCACTGTCGTCTTCTCCTTCGTTCCCCCTTCCATCTCAACATTGAGGTAAATTTTT721AATTACCCATGTTTTCCCATTTGTTTATTTTTCAACTAAATAATTTAGTTGCACTTGTTT781TTTAAATGCCCCATAATTATTCATGTTCTCTCATTTATGAATTTTCCAACTAAATAGTTT841AGTTCCACTAGTTTTTCAAATGTACCATAATTATTCATCTTTTTCTAATTATCTATTTTC901CAACCAAAGTCMGGGGAGTTTGGTTGGATGGAAGGAAGAAGTAMAAATAGAAAGAAAA961TAMTTTTGAGTTCGCTTGATAGGGAAGACMATGMAGGAAAGMAATTATGAMAGCG1021GTCATTTTTTATCCTATTGTATAAAAATTAATTCTTTCAAATTGGAATGATTATAGAAGT1081GTATGCTTATTCAAATTATGTATTTTTTAAATATTTTTTTCTTTTTCATTTTCCAACTCT1141ACGAATTMTAGAAGAMCAGAAAATTATTTTTCTTTCTATTTAATCATTTTTTTACTAA1201GCACGACTATAMAGAGAAAMAGAAATTCTATCTTTTCAATATTTTTTCACTCCATCAA1261GTMAACCTTAATTTTAGTCCACCATCCATTGCTGAGCCAGCTGAGAAAATAATACAAGT1321AAATACTAGTACAACCMCAMCAAGGAAAGGGACCGAGCAAGTTTGATGCGGCTTTGGG1381TATGGACTAATATCTTCGAATCAGATGCTGCGGATTAGATGAGATGGTACTATTACTGGC1441CACAAATGGTGATGAAMATAGACCTTTAGTTACTGGCTGTAAGAGTGCCGACAGTAGTT1501AACATCGATGAGATGACAATTTCACCACAAGTTTGATACATCGACGAGATGACAATTTTA1561AGCTTACCAAATGGTTMCATTTATTTATATATGGTAGGGATATTTGGCGAGGAATACCG1621TATGCCATATATTGCGACAGGAGCAAATGTATTTCMATCTATTTTCCACTGTTATACAT1681ATGCAATGATAACTGATAAATGAGCCMCTGAATGMTTAAATTATGAACCCATTACGAA1741AACGTGTMAATTAATTGGTTTAGCCTTGCMTGAATCCATCTTTGTATACATTGTACAA1801ACATCGTGCTTMATTACATCAATATCCCTACTTGATATGGCTAAGACTTGAATCCGTCA1861ACGTTTTMCTMACTTCAGGGTGTTGCATGGTTGACGAAGACATGGAAGACTTGAACAT1921GGMATAGACAMCGCCGCACGATTCGAGCCACTTGGCCCTGGGACACGTGTACGATTGG1981TCCAATGCCGCATTACACCAATCAATMCCACATGGCTTAATTTTGATGTGATGTGCCAA2041TAACGCCTGCACATGGATAGTGCATGTAGGACTAATGCATTTATTTCGAAACCTTAAACC2101ACTACTAGGCAGCTTACCTGCCTGCCTTAACTTTATAAGGCTCTTGGCTCCAAAATTATT2161TCTTCATTTCACCGGTTTGCAACTTTTCTTTTCAGTTTCAACATATAACA.GCTTGAG。权利要求一个棉纤维特异表达基因GhPRP5，该基因的cDNA序列包括开放阅读框和3’端未翻译区如下1ATGGGGGAGAAGGTGACGATAATGGTGCTGAAGGTCGACCTTCAGTGTAGACGCTGCTAC61AAGAAGGTGAAGCAAGTACTTTGCAAATTCCCTCAAATACGAGACCAGATATACGACGAG121AAGGCCAACACGGTGACAATCAAGGTAGTTTGCTGCGATCCAGAGAAGATGAGGGGCAAG181ATACGTTGCAAGGGTGGCGATTCCATCAAGAGCATTGAGATCAAACCACCTCCAAAGCCC241AAGGACCCCGAGAATTCTGAGAAGGAACCTGAAAAGAAAACAGAGAAGCCTACAGAGTCC301GAGAAGAAGTCTGAAAAGCCCAAAGAAACACCACCAAAGTCACCGGCGAAACAGGCTTCT361CCTCCGGAAGGCTTTTGTTGCACGGATTGTTATCATGGTCATCGTGGTGGCCCTTGCTAC421TTTGGTGGACCACCTCCGCCCCCATACTATTGGCCTTATGGTAGGCCAGTTTATGTTAAC481TGGGGCGGCTGCGGCGGAAGCACCTACTGTTATTGTTTTGAAGAAAACCCACAATGCTCA541GTCATGTAAGTTGTAGCATGGCACATGTGGGACGCTCATAATAAAGTTATTTTACGTTTC601TCCCTTGAATTATTGTCATTCAGTTAAAATACAACGTTGAATGTTTTCATGTTTTATACA661TTGTATTTACAAAATTGTTTGATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA基因的编码区从起始密码子ATG到终止密码子TAA(1-549bp)。2.如权利要求1所述的一个棉纤维特异表达基因GhPRP5，其特征在于，GhPRP5基因编码区翻译的蛋白质序列如下1MGEKVTMVLKVDLQCRRCYKKVKQVLCKFPQIRDQIYDEKANTVTIKVVCCDPEKMRGK61IRCKGGDSIKSIEIKPPPKPKDPENSEKEPEKKTEKPTESEKKSEKPKETPPKSPAKQAS121PPEGFCCTDCYHGHRGGPCYFGGPPPPPYYWPYGRPVYVNWGGCGGSTYCYCFEENPQCS181VM3.如权利要求1所述的一个棉纤维特异表达基因GhPRP5，其特征在于，GhPRP5基因上游启动子序列包括5'端未翻译区和启动子片段如下1TCAAATTGCAGCAGGCGACCATGGGTTTTGGCTTAGATCTTCATGAAGATCGATGGAATT61GGTGAGGTCTCATTTCATTATATCTTGAGAGAGGGAAATGGCTTGGCGGGTGCATTGGTT121AAAGGGGGAATTTTTCGAACCAGCTTATTCAAAGCATGGTGGTAGCAGATGTCAGGGTTT181TTTTTTCTTTTCCTGTTGGGTTTATTTTATATGTTAACAGTGGAATTTTGTTTAATTTTA241GAGTTAAAAATTATCATATATTTTAATTCACATTTAAAAAAAAAGATATATAATAACTTT301TTAGATCCCACCACACCTCTAGTCTGATAAGATTCAAACTAACACCACAATATTTTAAAA361TATATTTTCTTAATTTAATTTTATAAAGATCCAAAAAAGATAAATTACAATATAGTTCAC421ACTAAAATAGTGTTGCTTTTATTTTGATCACTTTAATTTTTTTTGTCAATTTAGTCACCA481CTAAAATGATCACTTAATTATTAAACCTTTAACGAATTGCTTAGTGGACTAACAAAAAAA541GAGAAAAAAATATTTTTTAATCCCTTTAAAAATTACAAATTTTTTAAGTCAATCTCTTAA601ATTTCCATCAAAAACCCATATAAAATAGCATAAAAAAATGTTAAATCCAACCTTCAATAT661GCTTCCACTGTCGTCTTCTCCTTCGTTCCCCCTTCCATCTCAACATTGAGGTAAATTTTT721AATTACCCATGTTTTCCCATTTGTTTATTTTTCAACTAAATAATTTAGTTGCACTTGTTT781TTTAAATGCCCCATAATTATTCATGTTCTCTCATTTATGAATTTTCCAACTAAATAGTTT841AGTTCCACTAGTTTTTCAAATGTACCATAATTATTCATCTTTTTCTAATTATCTATTTTC901CAACCAAAGTCAAGGGGAGTTTGGTTGGATGGAAGGAAGAAGTAAAAAATAGAAAGAAAA961TAAATTTTGAGTTCGCTTGATAGGGAAGACAAATGAAAGGAAAGAAAATTATGAAAAGCG1021GTCATTTTTTATCCTATTGTATAAAAATTAATTCTTTCAAATTGGAATGATTATAGAAGT1081GTATGCTTATTCAAATTATGTATTTTTTAAATATTTTTTTCTTTTTCATTTTCCAACTCT1141ACGAATTAATAGAAGAAACAGAAAATTATTTTTCTTTCTATTTAATCATTTTTTTACTAA1201GCACGACTATAAAAGAGAAAAAAGAAATTCTATCTTTTCAATATTTTTTCACTCCATCAA1261GTAAAACCTTAATTTTAGTCCACCATCCATTGCTGAGCCAGCTGAGAAAATAATACAAGT1321AAATACTAGTACAACCAACAAACAAGGAAAGGGACCGAGCAAGTTTGATGCGGCTTTGGG1381TATGGACTAATATCTTCGAATCAGATGCTGCGGATTAGATGAGATGGTACTATTACTGGC1441CACAAATGGTGATGAAAAATAGACCTTTAGTTACTGGCTGTAAGAGTGCCGACAGTAGTT1501AACATCGATGAGATGACAATTTCACCACAAGTTTGATACATCGACGAGATGACAATTTTA1561AGCTTACCAAATGGTTAACATTTATTTATATATGGTAGGGATATTTGGCGAGGAATACCG1621TATGCCATATATTGCGACAGGAGCAAATGTATTTCAAATCTATTTTCCACTGTTATACAT1681ATGCAATGATAACTGATAAATGAGCCAACTGAATGAATTAAATTATGAACCCATTACGAA1741AACGTGTAAAATTAATTGGTTTAGCCTTGCAATGAATCCATCTTTGTATACATTGTACAA1801ACATCGTGCTTAAATTACATCAATATCCCTACTTGATATGGCTAAGACTTGAATCCGTCA1861ACGTTTTAACTAAACTTCAGGGTGTTGCATGGTTGACGAAGACATGGAAGACTTGAACAT1921GGAAATAGACAAACGCCGCACGATTCGAGCCACTTGGCCCTGGGACACGTGTACGATTGG1981TCCAATGCCGCATTACACCAATCAATAACCACATGGCTTAATTTTGATGTGATGTGCCAA2041TAACGCCTGCACATGGATAGTGCATGTAGGACTAATGCATTTATTTCGAAACCTTAAACC2101ACTACTAGGCAGCTTACCTGCCTGCCTTAACTTTATAAGGCTCTTGGCTCCAAAATTATT2161TCTTCATTTCACCGGTTTGCAACTTTTCTTTTCAGTTTCAACATATAACAGCTTGAG。全文摘要一个棉花纤维特异表达基因GhPRP5，其cDNA包含546bp的开放阅读框架，编码一个182个氨基酸的富含脯氨酸的蛋白质，分子量为20.57KD，等电点为8.84。GhPRP5含有一个富含脯氨酸的19肽重复序列，与已有的植物五大类PRP蛋白中存在的“脯氨酸重复基序”不同，表明它是一种新的PRP蛋白。GhPRP5基因在开花后5-10天的棉纤维细胞中高水平表达，抑制其表达则导致纤维伸长迟缓，表明该基因对棉纤维极性生长有重要作用。采用基因组步移法分离了该基因的5’-上游启动子序列。该启动子在烟草和拟南芥叶表皮毛中具有特异性表达活性，证实该启动子是棉纤维特异性的。分离的GhPRP5基因及其启动子为棉纤维品质改良和分子育种提供了基因元件。文档编号C12N15/29GK101717776SQ20091027329公开日2010年6月2日申请日期2009年12月16日优先权日2009年12月16日发明者李学宝,武彦枫,王秀兰,许文亮,黄耿青,龚思颖申请人:华中师范大学