专利名称：一种甘蓝型油菜品种ssr指纹的快捷检测方法
技术领域：
本发明属于植物分子生物学领域，涉及一种甘蓝型油菜品种SSR指纹的快速检测 方法，具体而言是一种利用SSR标记进行甘蓝型油菜遗传多样性和品种真伪、杂种纯度的 快速检测、鉴定方法。
背景技术：
众所周知，与植物性状相关的遗传标记主要包括四种类型，即形态标记、细胞标 记、生化标记和分子标记。形态标记数目很少，且许多标记对植物育种利用来说是有害性 状，因而难以广泛应用。细胞标记通常仅能依靠染色体核型和带型的差异，因而数量也十分 有限，难以广泛应用。生化标记(也称为同工酶标记)以基因表达的产物为特征，因其在结 构上的多样性某种程度上能够准确反映植物DNA水平上的差异和遗传多样性，因而一直以 来得到一定程度上的发展和应用。但因基因的表达易受发育时期的影响，且易受环境条件 的影响，因此数量及应用上也存在明显的局限性。二十世纪八十年代以来，现代分子生物学 的形成与快速发展为人类开发新型植物标记奠定了坚实的理论基础，形成了检测基于DNA 水平上变异的技术方法，也就是分子标记技术。与形态、细胞、生化等标记技术相比，分子标 记更具有优越性检测对象是DNA片段，因此不受环境条件的限制，可用植物的任何发育时 期的任何组织进行分析；理论上数量无限多(遍及整个植物基因组)；表现为中性，既不影 响目标性状的表达，也与不利性状无必然的连锁；多态性高，通过引物或探针即可完成全基 因组分析；部分标记为共显性，可以鉴别基因型(纯合或杂合)。 迄今，科学工作者开发形成的分子标记技术包括有RFLP、 RAPD、 SCAR、 AFLP、 SSR、 ISSR、 EST、 SNP、 STS、 RBM、 SRAP、 TRAP等。SSR也称为微卫星标记，它是一种基于PCR扩增 的DNA标记技术。其原理是根据微卫星片段的两端互补序列设计引物，通过扩增及扩增产 物的凝胶分离，依据分离片段的有无和大小决定基因型并计算等位基因的频率。因其具有 数量丰富、共显性、重复性好、结果可靠等优点，已广泛用于植物遗传图谱的构建、遗传多样 性分析、植物品种真伪性检测及杂种纯度鉴定等方面。 油菜基因组中存在大量SSR标记位点。但研究工作者发现，并非所有SSR引物具 有同等检测效率，多数引物多态性检测效率一般，而有些引物检测效率极低。因此，通常的 做法是在进行资源多样性分析或品种真伪鉴定时，先随机挑选3至8份材料进行引物筛 选，然后利用筛选出的多态性较好的引物分析全部材料；在进行图谱构建和杂种纯度鉴定 分析时，先用双亲筛选出多态性好的引物，然后利用筛选出的引物分析分离群体或杂种&。 显然，这是一个十分繁琐且费时、费钱的过程。针对这些问题，本发明人收集了目前油菜上 开发并公布的SSR引物，重新进行了大量的引物筛选，改良并优化了现有油菜基因组DNA提 取方法，建立了一种快速、高效的甘蓝型油菜品种指纹检测方法，可用于商业用杂种纯度鉴 定、品种真伪检测和育种材料及种质资源的遗传多样性分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘蓝型油菜品种特异SSR指纹的高效、快速、简便的检 测方法。该方法可用于甘蓝型油菜遗传材料的多样性分析，品种真伪性鉴别和杂种纯度鉴 定方面。 为实现上述发明目的，本发明提供了如下技术方案 —种甘蓝型油菜品种SSR指纹的快捷检测方法，其步骤如下 A、采用CTAB小量法提取待测甘蓝型油菜样品基因组DNA ; B、采用如序列表SEQ ID NO :1-40所示的引物进行PCR扩增，所述的引物的核苷酸 序列如序列表SEQ ID NO :1-40所示; C、将步骤B的扩增产物用聚丙烯胺凝胶电泳分离，经显影、定影得到样品的指纹 图谱。 本发明的贡献还在于，对现有的从油菜幼嫩组织中提取基因组DNA的方法进行了 改良和优化，只需要一次纯化就可以得到用于指纹分析的DNA样品。其具体步骤(即上述 步骤A)如下将幼嫩植株或叶片放入研钵中加0. 75-1. Oml CTAB抽提缓冲液，立即用研磨 棒将其捣碎成匀浆，再移入2. OmL离心管中，然后在55°C _601:水浴45_60min，其间轻轻地
上下摇动，取出离心管冷却至室温，再加等体积的体积比为25 : 24 : i的苯酚氯仿
异戊醇或用等体积的体积比为24 : 1的氯仿异戊醇充分混匀10-20min， 12000r/min离 心12-15min，转移上清液到另一个2. OmL离心管中，在装有上清液的离心管中加入60ul 5mmol/LNH4AC，然后再加入2倍体积的预先冰冻的无水乙醇或异丙醇沉淀DNA，在-2(TC放 置l-2hrs或过夜，用枪头挑出或10000r/min离心3min沉淀DNA，再用含10mM NH4Ac 70% 乙醇氨浸泡DNA 5hrs，除去乙醇溶液，在室温下或通风橱中干燥DNA，再加300 y 1 TE缓冲 溶液或300 ii 1 ddH20溶解DNA， -2(TC保存备用；
其中 CTAB抽提缓冲液成份为2% CTAB， 1. 4M NaCl，20mM EDTA，0.2% P巯基乙醇， lOOmMTris-HCl， pH 8. O，加水定容至1L ;TE缓冲溶液配制方法如下500ml TE缓冲液中含10mM Tris-HCl和ImM EDTA-Na2，pH 8. 0， 121。C灭菌后室温保存。
这些引物的具体序列见表1。
表l本发明的引物序列
4引物对代薛正向引物序列反向引物序列
1ACGAAGTGGGTTAGTAGGCG (序列1)GAAGCCTTTCTCCACCATTG (序列2)
2TTGAAGTAGTTGGAGTAATTGGAGG (序列3)CAGCAGCCACAACCTTACG (序列4)
3AATTTAAACCTCATTTTCTTC (序列5)ACCTCCATTGTGTCTGAT (序列6)
4CGGCTTGTAAACCTTG (序列40)GACTCGAAAATCACTAACAC (序列7)
5CTGCACATTTGAAATTGGTC (序列8)AAATCAACGCTTACCCACT (序列9)
6ATTCATCTCCTGCTCGCTTAG (序列10)AAACCCAAACCAAAGTAAGAA (序列11)
7CTAGGCTAAGGAAGATTGTCA (序列12)TAGTTTCTl'CCTCCTGCTATC (序列13)
8ATTGGTCTCTTAACCCGC (序列14)TTCTCGAATCCCTCGAA (序列15)
9TACAGGTTCCTTGCGATG (序列16)ATGGACGAGACAACATGG (序列17)
10AGGCGAGTTTACGAGGAT (序列18)ACCTGCACCAGTCATTTG (序列19)
11GAGACGATGCAAAGATCG (序列20)TGCAGACACATTCGAACA (序列21)
12CATTCACAGGACCAGAGC (序列22)CAAAGCCAAGACAACCAT (序列23)
13CGGTCAGATTCCAACAGA (序列24)GCCATCTCAGAGACGACA (序列25)
14TCCCAACAAAAGAGTCCA (序列26) CAGCGAACCGAGTCTAAA (序列27)
15TTGTGTTTTGCCTTCTGA (序列28)TTTGCGCACAAACAATAA (序列29)
16CGTTGGCAAAAAGCCTACTC (序列30)CTCAGGGACGTCGTAAGAGC (序列31)
17TTGCTTCCAGAGATCTGGTTC (序列32)TGCGACTACTAAATTGTCGTGTT(序列33)
18GCGATCTCCTCAGGCATAGT (序列34)CCACGCAAGCTGAAACATAA (序列35)
19CCGGCTTGGTTCGATACTTA (序列36)TTGCGAATCTTTAAGGGACG (序列37)
20CACACCCTTACCACGTTCCT (序列38)GCAACAAAGCATACTTCGCA (序列39) 其中，基因组DNA提取方法如下 选取待测甘蓝型油菜材料幼嫩植株(或叶片)，采用CTAB小样法并稍作改进，提 取基因组总DNA见文献Doyle J J， Doyle J L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus，1990，12 :1315。 PCR反应体系见文献沈金雄等.甘蓝型油菜SSR、 ISSR标记的遗传多样性及其 与杂种表现的关系.中国农业科学，2004，37(4) :477-483。所得扩增产物冷藏保存备用。
扩增产物进行电泳分离、银染及显影见文献陆光远等.应用于油菜研究的简便 银染AFLP标记技术的构建.华中农业大学学报，2001，20 :413-415。显影后观察、记载材 料的扩增指纹。 更具体的技术方案由以下所述
1、基因组DNA提取方法 选取待测材料幼嫩植株(或叶片)，采用CTAB小样法并稍作改进，提取基因组总 DNA:将植株(或叶片)放入研钵中加0.75-1. Oml CTAB抽提缓冲液(成份为2% CTAB， 1. 4M NaCl，20mM EDTA，O. 2% P巯基乙醇，100mM Tris-HCl，pH 8. 0，加水定容至1L)，立即用研磨 棒将其捣碎成匀浆，再移入2. OmL离心管中。在55°C -6(TC水浴45-60min，其间轻轻地上下
摇动。取出离心管冷却至室温，再加等体积苯酚氯仿异戊醇(体积比为25 : 24 : i)
或者用等体积的氯仿异戊醇(体积比为24 : 1)充分混匀10-20min，12000r/min离心 12-15min，小心转移上清液到另一个新的2.0mL离心管中。在装有上清液的离心管中加入 60ul 5mmol/LNH4AC，然后再加入约2倍体积的预先冰冻的无水乙醇(或异丙醇)沉淀DNA， 在-2(TC放置l-2hrs或过夜。用枪头轻轻挑出或10000r/min离心3min沉淀DNA，再用70%
5乙醇氨(70%乙醇中含10mM NH4Ac)浸泡DNA 5hrs，除去乙醇溶液，在室温下或通风橱中干 燥DNA，再加300 ii 1 TE缓冲溶液(500ml TE缓冲液中含10mM Tris-HCl和ImM EDTA_Na2， pH 8. 0， 121。C灭菌后室温保存)或者300 ii 1 ddH20溶解DNA， -2(TC保存以用于指纹分析。
2、PCR扩增
PCR反应体系如下 10 ii 1体系中含IX扩增缓冲液，2mmol/L MgCl2，0. 2,1/L dNTPs，O. 5U Taq酶， 2. 5mmol/L上下游引物，50ng/ml DNA模板，用(1朋20(双蒸水)稀释至10iU。
PCR热循环程序为 反应在普通PCR仪上进行。热循环程序为，94t:预变性2min，1个循环；94。C变 性lmin，60。C复性30s，72。C延伸45s， 10个循环，每个循环复性温度降低0. 5°C ;94。C变性 lmin，55。C复性30s，72。C延伸45s，30个循环；1(TC保存。所得扩增产物冷藏保存备用。
3、扩增产物的电泳分离、银染及显影技术 用洗涤剂和自来水将玻璃板彻底洗净，晾干，用无水乙醇擦洗干净。在长玻璃板 上用裁成小块的滤纸均匀涂抹2ml硅化液(AMRESCO)。在短玻璃板上均匀涂lml反硅化液 (95%乙醇，5%冰乙酸，2111反硅化剂)，5min后用沾有无水乙醇的滤纸轻轻洗擦以除去多 余的硅化液和反硅化液。将玻璃装配好并以边条(0.4mm)隔开，装配好电泳系统。准备就 绪后用注射器将配制好变性凝胶液(50ml，含6X丙烯酰胺，7mol/L尿素，0. 5XTBE缓冲液， 灌胶前加入300ii1 10%过硫酸铵和30111 TEMED并迅速混匀)从底板中间小孔缓缓注入， 注意不要有气泡，最后于上部插入梳子并加压保护，凝聚2h后即可电泳。
将胶板底板取下，擦净并将其垂直固定于底座上，上槽加0. 5XTBE缓冲液500ml， 下槽加同样浓度的电泳缓冲液500ml，将梳子拔出，接通电源100-120W电泳预热30min。预 热完成后，将梳齿朝下插入梳子，并冲洗点样孔。在步骤(3)得到的扩增产物中加入等体 积的上样缓冲液(98X去离子甲酰胺，10mmol/L EDTA，O. 005%二甲苯青FF，O. 005%溴酚 蓝)，95。C变性3-5min后立即冰浴冷却，上样2 yl (97孔)，70-90W电泳1. 5h，当二甲苯青 FF于1/3 1/2胶板时中止电泳。电泳所用仪器为Sequi-Gen sequencingcell (Bio-Rad， USA)。 电泳完成后，小心剥下胶板，将其浸入12L固定液(10%冰乙酸)，轻轻摇动20 30min或至指示剂消失为止，然后用去离子水漂洗胶板2次，每次不少于10min，然后转至 1.2L染色液中(含O. 1% AgN03，0.056% HCHO)染色，轻轻摇动30min。取出胶板，在去离 子水中迅速漂洗10s，立即转入到1.2L预冷(4-10。C )的显影液(含3% Na2C03，0.056% HCHO， 2mg/LNa2S203 5H20)中，轻轻摇动至带型清晰可见，迅速取出放入固定液(10%冰乙 酸)中停止显影，然后用自来水漂洗5min，室温下自然晾干，观察、记载谱带类型。
与背景技术相比，本发明具有的显著特点和优点是PCR扩增中所用的20对引物 是发明人进行大量实验的基础上筛选出来的，它们多态性丰富(附图l)，带型稳定，均匀分 布在油菜基因组中，且特异性指纹谱带大小在50-400bp之间。因此，在需要进行甘蓝型油 菜遗传材料的多样性分析(附图1)、品种真伪性鉴别或杂种纯度鉴定(附图2、3)时，可直 接应用这些引物。显然，其利用有利于降低油菜品种指纹分析成本；建立了科学、准确、客 观、实用的油菜材料鉴定技术体系，为保护油菜育种产权、新品种登记、鉴别和检测油菜品 种的真伪性、杂交制种纯度等提供了技术保障。
6
通过以下实施例将更具体地对本发明进行说明，但是，所述实施例仅是为了说明 本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。
图1 :用引物CB10587扩增52份油菜资源图谱。 图2 :用引物BRAS067A检测的华杂7号杂交制种纯度(1)。图中P1P2为双亲的图 谱，其他为杂种的图谱。箭头所指示的三条带均有的为真杂种，仅有母本带型的为伪杂种。
图3 :用引物BRAS067A检测华杂7号杂交制种纯度(2)。图中全部为杂种的图谱。
箭头所指示的三条带均有的为真杂种，仅有母本带型的为伪杂种。
具体实施例方式实施例1 :鉴定甘蓝型油菜品种X是否为已知品种A
鉴定操作流程如下
(l)DNA提取 用培养皿发芽甘蓝型油菜品种A(已知的品种)和X(未知的品种)种子5-7天，取 幼嫩植株用改良的CTAB小样法提取基因组总DNA :将幼嫩植株用朋20清洗干净并吸干水分 后，放入研钵中加0. 75-1. OmlCTAB抽提缓冲液(成份为2% CTAB， 1. 4M NaCl，20mM EDTA， 0.2% P巯基乙醇，100mM Tris-HCl，pH 8. O，加水定容至1L)，立即用研磨棒将其捣碎成匀 浆，再移入2. OmL离心管中。在55°C-60"水浴45-60111111，其间轻轻地上下摇动。取出离
心管冷却至室温，再加等体积苯酚氯仿异戊醇(体积比为25 : 24 : i)或者用等体积
的氯仿:异戊醇(体积比为24 : 1)充分混匀10-20min， 12000r/min离心12-15min，小心 转移上清液到另一个新的2.0mL离心管中。在装有上清液的离心管中加入60ul 5mmol/L MVVC，然后再加入约2倍体积的预先冰冻的无水乙醇(或异丙醇)沉淀DNA，在-201:放置 l-2hrs或过夜。用枪头轻轻挑出或10000r/min离心3min沉淀DNA，再用70%乙醇氨(70% 乙醇中含10mM NH4Ac)浸泡DNA 5hrs，除去乙醇溶液，在室温下或通风橱中干燥DNA，再加 300 ii 1 TE缓冲溶液(500ml TE缓冲液中含10mMTris-HCl和lmM EDTA_Na2，pH 8. 0， 121°C 灭菌后室温保存)或者300 ii 1 ddH20溶解DNA， -2(TC保存。
(2)引物合成 合成了如序列表SEQ ID NO :1_40所示的20对引物。本实施例的引物合成由上海 生工生物工程技术有限公司完成，用1. 5ml离心管包装，每管2 0D。
(3) PCR扩增 以品种A和X叶片基因组总DNA为模板，用20对引物分别对它们进行PCR扩增。
PCR反应体系如下 10 ii 1体系中含IX扩增缓冲液，2mmol/L MgCl2，0. 2mmol/L d證s，O. 5U Taq酶， 2. 5mmol/L上下游引物，50ng/ml DNA模板，用(1朋20(双蒸水)稀释至10iU。
PCR热循环程序为 反应在PTC-225型PCR仪上进行。热循环程序为，94。C预变性2min， 1个循环；94。C 变性lmin，60。C复性30s，72。C延伸45s， 10个循环，每个循环复性温度降低0. 5°C ;94。C变 性lmin，55。C复性30s，72。C延伸45s，30个循环；10。C保存。
(4)电泳检测
7
用洗涤剂和自来水将玻璃板彻底洗净，晾干，用无水乙醇擦洗干净。在长玻璃板上 用裁成小块的滤纸均匀涂抹2ml硅化液(AMRESCO公司出品)。在短玻璃板上均匀涂1ml反 硅化液(95%乙醇，5%冰乙酸，2111反硅化剂)，5min后用沾有无水乙醇的滤纸轻轻洗擦以 除去多余的硅化液和反硅化液。将玻璃装配好并以边条(0. 4mm)隔开，装配好电泳系统。准 备就绪后用注射器将配制好变性凝胶液(50ml，含6X丙烯酰胺，7mol/L尿素，0.5XTBE缓 冲液，灌胶前加入300ii1 10%过硫酸铵和30111 TEMED并迅速混匀)从底板中间小孔缓缓 注入，注意不要有气泡，最后于上部插入梳子并加压保护，凝聚2h后即可电泳。
将胶板底板取下，擦净并将其垂直固定于底座上，上槽加0. 5XTBE缓冲液500ml， 下槽加同样浓度的电泳缓冲液500ml，将梳子拔出，接通电源100-120W电泳预热30min。预 热完成后，将梳齿朝下插入梳子，并冲洗点样孔。在步骤(3)得到的扩增产物中加入等体 积的上样缓冲液(98X去离子甲酰胺，10mmol/L EDTA，O. 005%二甲苯青FF，O. 005%溴酚 蓝)，95。C变性3-5min后立即冰浴冷却，上样2 yl (97孔)，70-90W电泳1. 5h，当二甲苯青 FF于1/3 1/2胶板时中止电泳。电泳所用仪器为Sequi-Gen sequencingcell (Bio-Rad， USA)。 电泳完成后，小心剥下胶板，将其浸入1. 2L固定液(10%冰乙酸)，轻轻摇动20 30min或至指示剂消失为止，然后用去离子水漂洗胶板2次，每次不少于10min，然后转至 1.2L染色液中(含O. l%AgN03，0.056% HCHO)染色，轻轻摇动30min。取出胶板，在去离 子水中迅速漂洗10s，立即转入到1.2L预冷(4-10。C )的显影液(含3% Na2C03，0.056% HCH0，2mg/L Na2S203 5H20)中，轻轻摇动至带型清晰可见，迅速取出放入固定液(10%冰乙 酸)中停止显影，然后用自来水漂洗5min，室温下自然晾干，检测谱带类型。
结果分析若品种X的20对引物扩增出的多态性带型与品种A完全相同，说明品 种X就是品种A。 实施例2 :鉴定油菜杂交品种R的制种纯度
鉴定操作流程如下
(l)DNA提取 随机选取油菜品种R杂交种子IOO粒以上，同时选取品种R的双亲种子，用培养皿 发芽5-7天，杂交种子分单株、双亲可以混合多个单株用改良的CTAB小样法，分别提取基因 组DNA :将幼嫩植株用dH20清洗干净并吸干水分后，放入研钵中加0. 75-1. Oml CTAB抽提 缓冲液(成份为2% CTAB，1.4M NaCl，20mM EDTA，0.2% P巯基乙醇，lOOmM Tris-HCl， pH 8. 0，加水定容至1L)，立即用研磨棒将其捣碎成匀浆，再移入2. OmL离心管中。在55°C _60°C 水浴45-60min，其间轻轻地上下摇动。取出离心管冷却至室温，再加等体积苯酚氯仿异
戊醇(体积比为25 : 24 : i)或者用等体积的氯仿异戊醇(体积比为24 : i)充分混
匀10-20min， 12000r/min离心12-15min，小心转移上清液到另一个新的2. OmL离心管中。 在装有上清液的离心管中加入60ul 5mmol/LNH4AC，然后再加入约2倍体积的预先冰冻的无 水乙醇(或异丙醇)沉淀DNA，在-2(TC放置l-2hrs或过夜。用枪头轻轻挑出或lOOOOr/ min离心3min沉淀DNA，再用70%乙醇氨(70%乙醇中含10mM NH4Ac)浸泡DNA 5hrs，除去 乙醇溶液，在室温下或通风橱中干燥DNA，再加300 ii 1 TE缓冲溶液(500ml TE缓冲液中含 10mM Tris-HCl和lmM EDTA_Na2， pH 8. 0， 12TC灭菌后室温保存)或者300 ii 1 ddH20溶解 DNA， -20。C保存。[ooeo](2)引物合成 合成了如序列表SEQ ID NO :1_40所示的20对引物。本实施例的引物合成由上海生工生物工程技术有限公司完成，用1. 5ml离心管包装，每管2 OD。
(3) PCR扩增 先用双亲基因组DNA筛选20对引物，选用可区分双亲的l对引物分别对杂种巳各单株基因组DNA模板进行PCR扩增。
PCR反应体系如下 10 ii 1体系中含IX扩增缓冲液，2mmol/L MgCl2，0. 2,1/L dNTPs，O. 5U Taq酶，2. 5mmol/L上下游引物，50ng/ml DNA模板，用(1朋20(双蒸水)稀释至10iU。
PCR热循环程序为 反应在PTC-225型PCR仪上进行。热循环程序为，94。C预变性2min， 1个循环；94°C变性lmin，60。C复性30s，72。C延伸45s， 10个循环，每个循环复性温度降低0. 5°C ;94。C变性lmin，55。C复性30s，72。C延伸45s，30个循环；10。C保存。
(4)电泳检测 用洗涤剂和自来水将玻璃板彻底洗净，晾干，用无水乙醇擦洗干净。在长玻璃板上用裁成小块的滤纸均匀涂抹2ml硅化液(AMRESCO)。在短玻璃板上均匀涂lml反硅化液(95%乙醇，5%冰乙酸，2111反硅化剂)，5min后用沾有无水乙醇的滤纸轻轻洗擦以除去多余的硅化液和反硅化液。将玻璃装配好并以边条(0.4mm)隔开，装配好电泳系统。准备就绪后用注射器将配制好变性凝胶液(50ml，含6X丙烯酰胺，7mol/L尿素，0. 5XTBE缓冲液，灌胶前加入300ii1 10%过硫酸铵和30111 TEMED并迅速混匀)从底板中间小孔缓缓注入，注意不要有气泡，最后于上部插入梳子并加压保护，凝聚2h后即可电泳。
将胶板底板取下，擦净并将其垂直固定于底座上，上槽加0. 5XTBE缓冲液500ml，下槽加同样浓度的电泳缓冲液500ml，将梳子拔出，接通电源100-120W电泳预热30min。预热完成后，将梳齿朝下插入梳子，并冲洗点样孔。在步骤(3)得到的扩增产物中加入等体积的上样缓冲液(98X去离子甲酰胺，10mmol/L EDTA，O. 005%二甲苯青FF，O. 005%溴酚蓝)，95。C变性3-5min后立即冰浴冷却，上样2 yl (97孔)，70-90W电泳1. 5h，当二甲苯青FF于1/3 1/2胶板时中止电泳。电泳所用仪器为Sequi-Gen sequencingcell (Bio-Rad，USA)。 电泳完成后，小心剥下胶板，将其浸入1. 2L固定液(10%冰乙酸)，轻轻摇动20 30min或至指示剂消失为止，然后用去离子水漂洗胶板2次，每次不少于10min，然后转至1.2L染色液中(含O. l%AgN03，0.056% HCHO)染色，轻轻摇动30min。取出胶板，在去离子水中迅速漂洗10s，立即转入到1.2L预冷(4-10。C )的显影液(含3% Na2C03，0.056%HCH0，2mg/L Na2S203 5H20)中，轻轻摇动至带型清晰可见，迅速取出放入固定液(10%冰乙酸)中停止显影，然后用自来水漂洗5min，室温下自然晾干，检测谱带类型。
结果分析统计杂交种中与双亲指纹相同的样本数量，除以检测杂种样本总数即可得到油菜杂交品种R的制种纯度。
〈110〉华中农业大学 〈120〉 一种甘蓝型油菜SSR指纹的快捷鉴定方法
〈130〉
〈141>2009-12-10〈160>40〈170〉Patentln version3. 1〈210>1<211>20〈212>DNA〈213〉甘蓝型油菜(Brassican即us)〈220〉<221>primer_bind〈222〉 (1) . (20)〈223〉〈400>13Cga;agtggg ttagteggcg20〈210>2〈211>20〈212>DNA<213>甘蓝型油菜(Brassican即us)〈220〉〈221>primer—bind〈222〉 (1) (20)<223>〈400>2gaagcctttc tccaccattg20〈210>3〈211>25〈212>DNA〈213>甘蓝型油菜(Brassican即us)〈220〉〈221>primer_bind〈222〉 (1) . (25)〈223>〈400>3ttg朋gtegt tggagt朋ttggagg 25
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〈223>〈400>39gc朋caaagc atecttcgca20〈210>40〈211>16〈212>DNA〈213〉甘蓝型油菜(Brassica,n即us)〈220〉〈221>primer_bind〈222〉 (1) . (16)〈223〉〈400>40cggcttgtaa accttg1权利要求
一种甘蓝型油菜品种SSR指纹的快捷检测方法，其特征在于步骤如下A、采用CTAB小量法提取待测甘蓝型油菜样品基因组DNA；B、采用如序列表SEQ ID NO1-40所示的引物进行PCR扩增，所述的引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1-40所示；C、将步骤B的扩增产物用聚丙烯胺凝胶电泳分离，经显影、定影得到样品的指纹图谱；其中步骤A所述的方法如下将幼嫩植株或叶片放入研钵中加0.75-1.0ml CTAB抽提缓冲液，立即用研磨棒将其捣碎成匀浆，再移入2.0mL离心管中，然后在55℃-60℃水浴45-60min，其间轻轻地上下摇动，取出离心管冷却至室温，再加等体积的体积比为25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇或用等体积的体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇充分混匀10-20min，12000r/min离心12-15min，转移上清液到另一个2.0mL离心管中，在装有上清液的离心管中加入60ul5mmol/L NH4AC，然后再加入2倍体积的预先冰冻的无水乙醇或异丙醇沉淀DNA，在-20℃放置1-2hrs或过夜，用枪头挑出或10000r/min离心3min沉淀DNA，再用含10mM NH4Ac 70％乙醇氨浸泡DNA 5hrs，除去乙醇溶液，在室温下或通风橱中干燥DNA，再加300μl TE缓冲溶液或300μl ddH2O溶解DNA，-20℃保存备用；其中CTAB抽提缓冲液成份为2％CTAB，1.4M NaCl，20mM EDTA，0.2％β巯基乙醇，100mM Tris-HCl，pH 8.0，加水定容至1L；TE缓冲溶液配制方法如下500ml TE缓冲液中含10mM Tris-HCl和1mM EDTA-Na2，pH 8.0，121℃灭菌后室温保存。
2. 适用于甘蓝型油菜品种DNA指纹识别的引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1-40所示。
3. 权利要求3所示的引物在甘蓝型油菜品种DNA指纹识别中的应用。
全文摘要
本发明属于油菜技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜品种SSR指纹的快捷检测方法。其特征在于步骤如下A、采用CTAB小量法提取待测甘蓝型油菜样品基因组DNA；B、采用如序列表SEQ ID NO1-40所示的引物进行PCR扩增，所述的引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1-40所示；C、将步骤B的扩增产物用聚丙烯胺凝胶电泳分离，经显影、定影得到样品的指纹图谱。本发明的引物特异性强，灵敏度高，能有效用于油菜真伪品种的DNA指纹快速检测。
文档编号C12N15/11GK101768639SQ20091027321
公开日2010年7月7日 申请日期2009年12月15日 优先权日2009年12月15日
发明者傅廷栋, 文静, 易斌, 李兴华, 杨军, 沈金雄, 涂金星, 马朝芝 申请人:华中农业大学