专利名称：一种结核分枝杆菌的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于感染性疾病检测技术领域，特别是涉及一种结核分枝杆菌的试剂盒， 同时，本发明还涉及一种结核分枝杆菌的试剂盒检测结核病感染中结核分枝杆菌的方法， 主要检测疑似病人的痰、血液和体液中的结核分枝杆菌或菌体抗原，适用于所有医院，包括 传染病和结核病医院等用于对结核分枝杆菌检测。
背景技术：
结核病是由结核分枝杆菌引起的、人兽共患的慢性消耗性传染病，给人类健康带 来严重威胁。据世界卫生组织(WHO)统计资料显示，全球目前有近三分之一的人感染结核 杆菌，活动性肺结核病人达2000万，每年有300万人死于结核病，每年新发病人数800 1000万。1993年，世界卫生组织宣布“全球结核病处于紧急状态”，把结核病列为重点控制 的传染病之一。我国是结核病高负担国家，现有活动性肺结核病人500万人，传染性肺结核 病人200万人，每年新增病例约130万人，因结核病死亡15万人之多(《全国结核病防治规 划Q001-2010年)》，国办发[2001]75号文件)。国务院已确定结核病为我国三大重点防 治传染病之一。我国结核病疫情的严重程度仅次于印度，位居世界第二。我国结核病疫情 呈三高一低，即患病率高、死亡率高、耐药率高，年递降率低。近年来由于HIV/AIDS流行、人 口流动、耐药结核菌逐年增加，结核病发病率开始上升，结核病疫情更加严重。运用新型检测方法对结核病进行早期检测与治疗具有十分重要的意义，目前国内 外结核已有的检测技术存在许多缺陷，缺乏特异、有效、快速、方便、廉价的检测技术和产 品，特别是一直缺乏对结核抗原的敏感早期检测手段。如传统的痰涂片法检测患者痰液中 的结核杆菌，痰结核菌培养需耗时6-8周，检测时间过长。过去PPD(结核菌素纯蛋白衍化 物)也常用于结核病的检测和流行病学调查，但是其特异性和敏感性均有一定局限性。又 如传统的血清学抗体检测不能检测早期病菌抗原，不能检测窗口期病人和潜伏感染病人等 缺陷。临床上对疑似感染结核的病人，由于缺乏有效的检测方法，常常采用先抗结核治疗， 再以治疗的效果为依据来进行检测，如此一来浪费了大量的人力物力，也可能造成对其他 疾病的误诊或是延误治疗。所以，探索新型检测方法对结核病进行早期检测研究用于结核 病快速、有效、方便、廉价的特异性检测，对于及时治疗结核病人和控制结核病传染疫情都 具有十分重要的意义
发明内容
发明的目的是在于提供了一种结核病及其结核分枝杆菌抗原的试剂盒，该试剂盒 对结核病及其结核分枝杆菌抗原的早期检测，可直接检测结核分枝杆菌或菌体抗原，比起 传统通过痰培养的检测方法，从过去的2-4周缩减为半天左右时间。该试剂盒它主要包括 兔抗结核分枝杆菌的多克隆抗体的制备，兔抗结核分枝杆菌的多克隆抗体包被96孔ELISA 板，生物素标记核酸适配子NK2的制备。对结核病检测的具体过程和步骤是利用一种能特 异性结合结核分枝杆菌H37Rv菌体抗原的单链DNA适配子作为探针，采用结核分枝杆菌H37Rv多克隆抗体包被孔板，生物素标记的该DNA适配子作为探针，类似夹心ELISA法，用于 检测痰液或体液中结核分枝杆菌或结核分枝杆菌抗原。发明的另一个目的是在于提供了一种结核分枝杆菌的试剂盒检测结核分枝杆菌 的方法，该方法将单链适配子与结核病的检测结合起来，从过去的2-4周缩减为半天左右 时间；而且试剂盒成本低，DNA单链适配子体外合成非常简单，而且价格低廉，方法操作简 单，对于结核病人痰培养阳性的检测灵敏度和精确度都很高。对结核分枝杆菌检测的方法 是利用一种能特异性结合结核分枝杆菌H37Rv菌体抗原的单链DNA适配子作为探针，采用 结核分枝杆菌H37Rv多克隆抗体包被孔板，生物素标记的该DNA适配子作为探针，类似夹心 ELISA法，用于检测痰液或体液中结核分枝杆菌或结核分枝杆菌抗原。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案—种结核病及其结核分枝杆菌抗原的试剂盒它包括兔抗结核分枝杆菌的多克隆 抗体，酶标板(购自海门市三和新华玻璃实验仪器厂)，生物素标记核酸适配子NK2，辣根过 氧化物酶标记的链霉亲和素(购自北京博奥生物技术有限公司)及其显色底物3’，3’，5， 5’ -四甲基联苯胺(TMB)(购自深圳达科为生物技术有限公司)。所述的兔抗结核分枝杆菌的多克隆抗体(或抗血清)的制备将结核分枝杆菌 H37Rv(来源于 ATCC 93009, Biochemical and Biophysical Research Communications 357(2007)743-748)加热 60 °C 30 分钟灭活，用 PBS 配成 lxl09CFU/ml (按 Img = IxlO7CFU 换算)，耳静脉注射入家兔，连续7天，每天注射一次，第7天注射后一周，心脏取血，IOOOrpm 离心分离血清，即为抗结核杆菌标准毒株H37Rv的抗血清。保存于-80°C。所述的核酸适配子NK2为本发明者通过SELEX筛选技术，通过筛选到的能特 异性结合结核分枝杆菌的DNA单链适配子，命名为NK2(具体步骤见发明专利申请号 200610019671. 8，发明人章晓联、陈凡)。所述的生物素标记核酸适配子NK2的制备将NK2序列送公司合成，公司合成生物 素标记NK2的5，端(命名为bio-NK2)。其序列为SEQIDN0. 1所示的核苷酸序列。并用无 菌双蒸水稀释为100nM，200nM，400nM的浓度，_20°C保存。一种结核分枝杆菌的试剂盒检测结核分枝杆菌的方法，利用试剂盒(本发明夹心 ELISA试剂盒)对结核分枝杆菌检测的具体过程和步骤如下1、将1 200兔抗结核分枝杆菌的抗血清(效价为1 1600，PBS稀释)包被96 孔酶标板，4度过夜。2、含有 5/10000 吐温-20 的磷酸盐缓冲液(PBS 溶液=NaCl 8g，KCl 0. 2g，Na2HPO4 1. 44g，KH2PO4 0. 24g,加去离子水溶解，定容至IOOOml，调pH至7. 4，15磅灭菌20min,置4°C 保存)，洗涤六遍。3,1% (g/ml)牛血清白蛋白(BSA) (PBS溶解)封闭96孔板，100 μ 1/孔，37度封 闭1小时。4、加入待检细菌或痰液或血液或体液，将待检细菌细菌(1000CFU/ml)溶于抗原 包被液即0. lmol/L、pH9. 6碳酸盐缓冲液。Na2CO3 2. 12g, NaHCO3 2. 52g，加去离子溶解后， 定容至500ml，调pH至9. 6，15磅灭菌2011^11，置41保存。100 μ 1/孔，37度孵育1小时。5、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍。6、加入 bio-NK2(400nM/孔，PBS 稀释)，37 度孵育 1 小时。
7、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍.8、加入加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-sti^ptoavidin) (1 1000， PBS稀释)，100 μ 1/孔，37度孵育1小时。9、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍.10、加入底物显色剂，显色2分钟，用2Μ浓硫酸中止显色。本发明中所用的底物TMB显色剂配方包括Α底物是TMB 20mg (固体)，先用无水 乙醇IOml溶解，充分振荡(试剂瓶要干净，干燥)，加双蒸水定容到IOOml，此即是A底物； B底物是取1水柠檬酸2. lg，无水Na2HP042. 82g，0. 75%的过氧化氢0. 6細1，双蒸水定容 至100ml (无须调pH值，应在4. 5-5. 0范围)，此即是B底物。使用时，A底物与B底物各取 5ml混勻。11、1小时内在Themo scientific Multskan mk3多功能酶标仪450nM下检测吸光 度。检测结果是结核病及其结核杆菌阳性的0D450值均大于设定的临界值(cutoff值)，而 正常健康人及阴性样品的0D450值均小于临界值(cutoff值)，cutoff值=0. IX阳性对 照的平均0D450值+阴性对照的平均0D450值。说明本试剂盒的检测结果能有效的鉴别出 结核病、以及结核分支杆菌与其他菌株间的不同。本试剂盒对结核病及其结核杆菌检测的特异性鉴定用上述夹心ELISA方法，封闭孔板后加入多种不同细菌结核杆菌标准毒株 H37Rv(来源于 ATCC 93009, Biochemical and Biophysical Research Communications 357(2007)743-748),卡介苗 BCG(来源于 Biochemical and Biophysical Research Communications ；357 (2007) 743-748)、鸟分支杆菌 M2 (M. avium,来源于 ATCC25^1，Clin Chem Lab Med. 2009. 47(4) :405-11)、耻垢分支杆菌(Μ. smegmatis，来源于 ATCC 19420， Clin Chem Lab Med. 2009. 47 (4) :405-11)、藤黄微球菌 Micrococcus luteus 来源于 ATCC 9341, Int J Syst Evol Microbiol. 2003. 53 (Pt 4) :995-7.)、绿脓杆菌 Bacillus aeruginosus(来源于 ATC(^9213、J Dairy Sci. 2009. 92(8) :3659-66)、金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus (来源于 ATCC 49775, Infect Immun. 1995. 63(10) :4121-9)、金黄 色葡萄球菌耐药株Resistant Staphylococcus aureus(来源于ATCC 33591、Appl Biochem Biotechnol. 2009)、白色葡萄球菌 Staphylococcus albus (来源于 ATCC 7469、Biochem J. 1963. % (2) :213-25.)、鼠伤寒沙门菌 Salmonella typhimurium C5(来源于 Eur J Immunol. 2009,39 :1-12 ；Vaccine. 2009,27 :6712-6722)，甲型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi A，来源于 ATCC 9150, Br Med J. 1965. 2(5454) :152-3)、乙型副伤寒沙门菌 (Salmonella paratyphi B，来源于ATCC 2659，J Ethnopharmaco 1. 1998. 62(3) :251-4)。经 反复洗涤，未结合的细菌被洗去，结合在板上的结核分枝杆菌再用生物素标记的适配子NK2 捕获，再经洗涤六次后，结合上的生物素标记的适配子NK2与加辣根过氧化物酶标记的链 霉亲和素结合，最后加入底物显色，显色终止后，在酶标仪450nm的吸收波长上测其OD值。 检测结果表明本试剂盒能有效的鉴别出结核分枝杆菌与其他菌株间的不同。实验数据见图 1-4。核酸适配子检测技术灵敏度的检测结核病人样本来源于武汉市医疗救治中心住院病人。年龄25 65岁，系2008年 6月至2009年3月住院病人。临床有低热、盗汗、咳嗽等症状，血像升高，痰涂片抗酸染色阳性，经TB抗体和胸片确诊为肺结核。健康志愿者(年龄18 52岁)痰涂片抗酸染色阴 性。用上述夹心ELISA方法，封闭后加入不同结核病人痰液(用生理盐水1 10稀释)和 非结核病人或正常人痰液对照，经反复洗涤，未结合的痰液细菌被洗去，结合在板上的结核 分枝杆菌再用生物素标记的适配子NK2捕获，再经洗涤六次后，加辣根过氧化物酶标记的 链霉亲和素，最后加入底物显色，显色终止后，在酶标仪450nm的吸收波长上测其OD值。实 验数据见图5。本发明试剂盒与常规的抗酸染色、PPD检测结核抗体检测的比较在武汉市医疗救治中心检验科取感染期结核病人的痰液和血液，取感染期结核病 人的痰液，用本夹心ELISA方法检测这些病人的痰液，同上法，封闭后加入不同结核病人痰 液(用生理盐水1 10稀释)和非结核病人或正常人痰液对照，经洗涤六次，未结合的痰 液细菌被洗去，结合在板上的结核分枝杆菌再用生物素标记的适配子NK2捕获，再经洗涤 六次后，加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，最后加入底物显色，显色终止后，在酶标仪 450nm的吸收波长上测其OD值。同时一部分样品在武汉市医疗救治中心检验科做常规的抗 酸染色，PPD检测和血清学抗体检测，报告的阳性与阴性结果与本试剂盒检测的阳性与阴性 结果有很好的正相关符合率，实验数据见表一，表二和表三。本发明的优点是核酸适配子体外容易合成，且能特异性与结核分枝杆菌H37Rv结合，而不与其他 细菌结合，同时对于结核病人痰抗酸染色阳性的痰液，都能表现出OD值都在设定的临界值 (cutoff值)以上。cutoff值=0. 1 X阳性对照的平均0D450值+阴性对照的平均0D450 值。而对于阴性的，OD值都在cutoff值以下，说明核酸适配子检测有较高的灵敏性。可直 接检测疑似病人的痰、血液和体液中的结核分枝杆菌或菌体抗原，比起传统通过痰培养的 检测方法，从过去的2-4周缩减为半天左右时间，且价格低廉，方法操作简单，对于结核病 人痰培养阳性的检测灵敏度和精确度都很高。因此，对于核酸适配子在结核的检测方面，在 临床上有很大的应用前景。
图1本发明试剂盒中不同浓度的核酸适配子检测技术特异性的鉴定不同浓度的适配子分别与细菌结合，400nM浓度的适配子与细菌结合时，非特异性 反应最低，确定与结核杆菌H37Rv结合的NK2适配子的最佳浓度为400nM。图2本发明试剂盒中核酸适配子与不同浓度的细菌检测技术特异性的鉴定400nM浓度的NK2适配子与不同浓度的细菌反应，与结核杆菌标准株H37Rv的结合 OD值最高，有很高的特异性。图3本发明试剂盒中核酸适配子与不同革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌检测特异 性的鉴定同法分别检测毒性结核分枝杆菌标准珠H37RV、卡介苗(BCG)、鼠伤寒沙门菌 C5 (Salmonella typhimurium C5)、甲型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi Α)、乙型副 伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),而才药 性金黄色葡萄球菌(Resistant Staphylococcus aureus)，在1 X 103CFU/mL的菌液浓度下, 有显著差别。说明本试剂盒能有效的鉴别出结核与其他菌株间的不同。
图4本发明试剂盒中对不同分支杆菌细菌检测特异性的鉴定同法分别检测毒性结核分枝杆菌H37RV、卡介苗BCG、鸟分支杆菌 (M. aviumATCC25291) (M2)、耻垢分支杆菌(M. smegmatis ATCC19420)，在 1 X 103CFU/mL 浓 度下，检出H37RV与鸟分支杆菌级耻垢分支杆菌间有显著差别，而与BCG间差异不明显，可 能由于多抗的非特异性导致BCG与之结合。说明本试剂盒能有效的鉴别出结核分枝杆菌与 其他分支菌菌株间的不同。图5本发明试剂盒与常规结核病痰液抗酸染色检测相比灵敏性的鉴定结核病人痰液抗酸染色阳性的，都能与400 μ M浓度的ΝΚ2适配子反应，且有很高 的OD值。说明本试剂盒与常规结核抗酸染色检测相比有很好的正相关性，但时间大大缩短。纵坐标(0D450nm)代表适配子、抗体夹心ELISA法检测出病人的0D450值；横坐标 代表抗酸染色的指数(anti-acid staining index)，表示如下-在显微镜IOX100倍的视野下，观察50个视野，看到的细菌总个数为0.士 在显微镜IOX 100倍的视野下，观察50个视野，看到的细菌总个数为1 9个+ 在显微镜IOX 100倍的视野下，观察50个视野，看到的细菌总个数为10 99 个++ 在显微镜10X100倍的视野下，观察50个视野，每个视野看到的细菌个数为 1 9个+++ 在显微镜IOX 100倍的视野下，观察50个视野，每个视野看到的细菌个数为 10 99个++++ 在显微镜10 X 100倍的视野下，观察50个视野，每个视野看到的细菌个数为 > 100 个。
具体实施例方式实施例1 一种结核分枝杆菌的试剂盒，它包括兔抗结核分枝杆菌的多克隆抗体，96孔 ELISA板，生物素标记核酸适配子NK2，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素及其底物显色 剂。制备过程如下1.所述的兔抗结核分枝杆菌的多克隆抗体的制备将结核分枝杆菌H37Rv(来 源 于 ATCC 93009, Biochemical and Biophysical Research Communications 357(2007)743-748)加热 60°C 30 分钟灭活，用 PBS 配成 lxl09CFU/ml (按 Img = IxlO7CFU 换算)，耳静脉注射入家兔，连续7天，每天注射一次，第7天注射后一周，心脏取血，IOOOrpm 离心分离血清，即为抗结核杆菌标准毒株H37Rv的抗血清。保存于-80°C。2.所述的的核酸适配子NK2为本发明者通过SELEX筛选技术，通过筛选到的能 特异性结合结核分枝杆菌的DNA单链适配子，命名为NK2(具体步骤见发明专利申请号 200610019671. 8，发明人章晓联、陈凡)。所述的生物素标记核酸适配子NK2的制备将NK2序列送公司合成，公司合成生物 素标记NK2的5，端(命名为bio-NK2)。其序列为SEQIDN0. 1所示的核苷酸序列。并用无 菌双蒸水稀释为400nM的浓度，-20°C保存。
3.把不同种的细菌分别在合适的培养基中培养，其中结核杆菌标准毒株H37Rv， 卡介苗在罗氏培养基中培养，其他细菌在LB培养基中培养，然后在使用当天，用生理盐水 调成不同的浓度。本发明中所用的LB培养基的制备发法为配制IL的用量蛋白胨IOg酵母抽提物 5g NaCl IOg调pH值至7. 0-7. 2.分装后于121摄氏度灭菌15min。本发明中所用结核杆菌的改良罗氏培养基的制备发法为味精(谷氨酸钠95%以 上)7. 2g ；磷酸二氢钾2. 4g ；硫酸镁0. 24g ；柠檬酸镁0. 6g ；甘油12mL ；蒸馏水600mL ；马铃 薯淀粉30g ；全卵液IOOOmL ；2%孔雀绿20mL.制备法各盐类成分溶解后，加马铃薯淀粉， 混勻，沸水锅内煮沸30 40min (其间不时摇动，防凝块)，呈糊状，待冷后，加入经消毒纱布 过滤的新鲜全卵液IOOOmL,混勻。加2%孔雀绿20mL，混勻，分装试管(18mmX 180mm)。每 一试管加培养基7mL，培养基斜面高度为培养基占试管底部的三分之二处为宜，置血清凝固 器内凝固。凝固器内温度至90°C时，放入分装试管，以摆放两层为宜。待凝固器内温度达 85 90°C，计时，凝固1 1. 后取出，放冷，无菌试验后放4°C冰箱备用，一个月内使用。4.利用抗结核杆菌标准毒株H37Rv的抗血清包被ELISA板，湿盒，4°C孵育过夜。 本发明中所用包被缓冲液(ΡΗ9· 6,0. 05Μ碳酸盐缓冲液):Na2C03 1. 59克，NaHC03 2. 93克 加蒸馏水至1000ml，使用前配置。第二天弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBST (含0.5%吐温-20的PBS)，洗4次， 然后加入(g/ml)牛血清白蛋白，每孔100μ1，37 ，封闭一个小时。弃掉孔中的液体， 每孔加300μ 1 PBST，洗4次，然后每孔加入不同浓度(5X104CFU/ml，5Xl(fCFU/ml)的不同 细菌100 μ 1，每种细菌的每个浓度设9个复孔，同时设一个不加细菌的阴性对照孔，37°C， 孵育2个小时。弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBST，洗4次，然后加入不同浓度的核酸适 配子(100ηΜ，200ηΜ，400ηΜ)，由于每种细菌的每个浓度设9个复孔，因此每种细菌的每个浓 度的3个复孔加一个浓度的适配子，每孔100 μ 1，37°C，孵育1个小时.弃掉孔中的液体，每 孔加300 μ 1 PBST,洗4次，然后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，370C，孵育半个小 时。弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBST，洗5次，然后加入底物TMB显色10分钟，然后用 2Μ的H2SO4终止反应。在酶标仪上，用450nm的滤光片读取OD值。本发明中所用的底物显色配方A底物是TMB 20mg(固体)，先用无水乙醇IOml 溶解，充分振荡(试剂瓶要干净，干燥)，加双蒸水定容到100ml，此即是A底物；B底物是取 1水柠檬酸2. lg，无水Na2HP042. 82g，0. 75%的过氧化氢0. 6細1，双蒸水定容至100ml (无 须调PH值，应在4. 5-5. 0范围)，此即是B底物。使用时，A底物与B底物各取5ml混勻。结果见图1-5 图1结果说明本发明试剂盒诊断不同浓度的适配子分别与细菌结 合，结果显示400nM浓度的适配子与细菌结合时，非特异性反应最低(OD45tl < 0. 2)，确定本 发明试剂盒中与结核杆菌H37Rv结合的NK2适配子的最佳浓度为400nM。图2结果，本发明试剂盒对不同浓度的结核杆菌诊断特异性的鉴定400nM浓度的 NK2与5x103CFU，5X1 O4CFU的结核杆菌标准株H37Rv的结合OD值均最高(OD45tl > 0. 2)，均 显著高于对其他细菌的结合，说明本发明试剂盒有很高的特异性。图3结果，本发明试剂盒对不同细菌诊断特异性的鉴定。400nM浓度的NK2与 IxlO3CFU的结核杆菌标准株H37Rv的结合OD值最高(OD45tl > 0. 3)，均显著高于对BCG，以 及其他细菌的结合，说明本发明试剂盒能有效的鉴别出结核分枝杆菌与其他细菌菌株间的不同。说明本发明试剂盒有很高的特异性。图4结果，本发明试剂盒对其它不同分支杆菌诊断特异性的鉴定。本发明试剂 盒对结核杆菌标准株H37Rv的结合OD值最高，显著高于对其他分支杆菌(如鸟分支杆菌 (M. avium ATCC25291) (M2)、耻垢分支杆菌(M. smegmatisATCC19420)。说明本发明试剂盒能 有效的鉴别出结核分枝杆菌与其他分支菌菌株间的不同。说明本发明试剂盒有很高的特异 性。实施例2 一种结核分枝杆菌的试剂盒检测结核病的方法，分别取不同结核病人的痰液，非 结核病人和正常人的的痰液，用本试剂盒对结核病人等样品进行检测，试剂盒对结核病检 测的具体过程取抗结核杆菌标准毒株H37Rv的抗血清(1 200)包被ELISA板中，每孔100 μ 1， 湿盒，4°C孵育过夜，第二天弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBST (含0. 5 %吐温-20的 PBS)，洗4次，然后加入(g/ml)牛血清白蛋白，每孔100μ1，37 ，封闭一个小时。弃掉 孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBST，洗4次，然后每孔加入100 μ 1稀释的待检痰液样品(用 生理盐水1 10稀释)，同时设一个不加痰液的阴性对照孔，37°C，孵育2个小时。弃掉孔 中的液体，每孔加300 μ 1 PBST，洗4次，然后加入400ηΜ浓度的适配子，每孔100μ 1，37°C， 孵育1个小时.弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBST，洗4次，然后加入辣根过氧化物酶标 记的链霉亲和素，37°C，孵育半个小时。弃掉孔中的液体，每孔加300 μ 1 PBST，洗5次，然后 加入底物TMB显色10分钟，然后用2Μ的H2SO4终止反应。在酶标仪上，用450nm的滤光片 读取OD值。同时所有样品在武汉市医疗救治中心检验科分别进行抗酸染色、PPD和血清学 抗体的常规检测，报告的阳性与阴性结果与本试剂盒检测的阳性与阴性结果有很好的正相 关符合率，结果见图5，和表一，二，三。图5结果表明本发明试剂盒方法与常规抗酸染色方法相比有很好的正相关性。凡 结核病人痰液抗酸染色阳性的，都能与400 μ M浓度的ΝΚ2适配子反应，且有很高的OD值。表一本发明试剂盒与常规PPD检测的比较血液样本由武汉市医疗救助中心提供，58份血液样本均为结核病人血清样本。在 适配子、抗体夹心ELISA法中设定cutoff值为0. 05。cutoff值=0. IX阳性对照的平均 0D450值+阴性对照平均的0D450值。0D450 > 0. 05为阳性(+)；0D450 < 0. 05为阴性㈠。本发明试剂盒与常规PPD检测相比敏感性45/49 = 91. 84% ；总符合率:49/58 = 84. 48%。
夹心法(cutoff: 0.05) PPD- total+45550
-448
total49958 表二本发明试剂盒与常规血清学抗体检测的比较
血液样本由武汉市医疗救助中心提供，58份血液样本均为结核病人血清样本。 本发明试剂盒即适配子、抗体夹心ELISA法与常规血清学抗体(TBAb)检测比较，敏感性 48/50 = 96%;总符合率50/58 = 86. 21 %。在适配子、抗体夹心ELISA法中设定cutoff 值 为0. 05。cutoff值=0. 1 X阳性对照的平均0D450值+阴性对照平均的0D450值。0D450 > 0. 05 为阳性(+) ；0D450 < 0. 05 为阴性(-)。
夹心法(cutoff: 0.05)
TBAb - total
+ -+48654 - 2 2 4
total50858表三本发明试剂盒与常规抗酸染色检测的比较痰液样本由武汉市医疗救助中心提供，84份痰液样本均为结核病人痰液样本。本发明试剂盒即适配子、抗体夹心ELISA法与常规抗酸染色检测间的比较，特异 性100% ；总符合率47. 62%。在适配子、抗体夹心ELISA法中设定cutoff值为0.05。cutoff值=0. IX阳性对 照的平均0D450值+阴性对照平均的0D450值。0D450 > 0. 05为阳性(+) ；0D450 < 0. 05 为阴性(_)。
夹心法(cutoff: 0.05)
抗酸 --- total
+ -+14014
-442670
total582684SEQUENCE LISTING<110>武汉大学<120> 一种结核分枝杆菌的试剂盒及其检测方法<130> 一种结核分枝杆菌的试剂盒及其检测方法<160>1<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工合成<400>1
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权利要求
1.一种结核分枝杆菌的试剂盒，该试剂盒包括抗结核分枝杆菌的多克隆抗体，酶标 板，生物素标记核酸适配子NK2，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素及其显色底物；所述的生物素标记核酸适配子NK2的制备将NK2序列合成，合成生物素标记NK2的5， 端为bio-NK2，并用无菌双蒸水稀释为100nM，200nM，400nM的浓度，_20°C保存；所述的抗结核分枝杆菌的多克隆抗体的制备将结核分枝杆菌H37Rv加热60°C 30分 钟灭活，用PBS配成lxl09CFU/ml，按Img = IxlO7CFU换算，耳静脉注射入家兔，连续7天， 每天注射一次，第7天注射后一周，心脏取血，IOOOrpm离心分离血清，即为抗结核杆菌标准 毒株H37Rv的抗血清，保存于_80°C。
2.权利要求1所述的一种结核分枝杆菌的试剂盒检测结核分枝杆菌的方法，其步骤是A、将1 200兔抗结核分枝杆菌的抗血清，PBS稀释，包被96孔酶标板，4度过夜；B、含有5/10000吐温-20的磷酸盐缓冲液，PBS溶液NaCl8g，KCl 0. 2g, Na2HPO4 1. 44g，KH2PO4 0. 24g,加去离子水溶解，定容至IOOOml，调pH至7. 4，15磅灭菌20min,置4°C 保存，洗涤六遍；CU% g/ml牛血清白蛋白，PBS溶解，封闭96孔板，100 μ 1/孔，37度封闭1小时；D、加入待检样品，如痰液或血液或体液或细菌，将待检细菌1000CFU/ml溶于抗原包被 液即0. lmol/L、pH9. 6碳酸盐缓冲液，Na2CO3 2. 12g，NaHCO3 2. 52g，加去离子溶解后，定容 至500ml，调pH至9. 6，15磅灭菌20min，置4°C保存，100 μ 1/孔，37度孵育1小时；Ε、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍；F、加入bio-NK2,400nM/孔，PBS稀释，37度孵育1小时;G、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍；H、加入加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，1 1000，PBS稀释，100μ 1/孔，37度孵 育1小时；J、含有5/10000吐温-20的PBS，洗涤六遍；K、加入底物显色剂，显色2分钟，用2Μ浓硫酸中止显色；LU小时内在多功能酶标仪450ηΜ下检测吸光度；所述的底物显色剂配方包括Α底物是TMB 20mg，先用无水乙醇IOml溶解，充分振荡， 加双蒸水定容到IOOrnl ；B底物是取1水柠檬酸2. lg，无水Na2HP04 2. 82g，0. 75%的过氧 化氢0. 6細1，双蒸水定容至100ml，A底物与B底物各取5ml混勻。
3.权利要求1所述的一种结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于所述的生物素标记核 酸适配子NK2，其序列为SEQIDN0. 1所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种结核分枝杆菌的试剂盒及其检测方法。包括兔抗结核分枝杆菌的多克隆抗体，酶标孔板，生物素标记单链DNA适配子，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素及其显色底物。利用该试剂盒，将多克隆抗体包被酶标孔板，加入结核分枝杆菌或待检痰液及对照样品，经反复洗涤，未结合的细菌被洗去，再用生物素标记的单链DNA适配子捕获，加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，加入底物显色，显色终止后，在酶标仪的吸收波长上测其OD值。本发明主要检测结核分枝杆菌，或痰、血液和体液中的结核分枝杆菌或菌体抗原，适用于所有医院。检测速度快，方便安全，省时效率高，而且价格低廉，检测灵敏度和精确度都很高，应用前景广阔。
文档编号C12Q1/68GK102081092SQ20091027304
公开日2011年6月1日 申请日期2009年11月30日 优先权日2009年11月30日
发明者章晓联 申请人:武汉大学