专利名称：：应用as-pcr检测牛尿苷酸合酶缺乏症的方法
技术领域：
：本发明属于动物疾病检测
技术领域：
，具体属于一种牛尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)检测
技术领域：
，涉及应用AS-PCR检测牛尿苷酸合酶缺乏症的方法。
背景技术：
：牛尿苷酸合酶缺乏症(Deficieneyofuridinemonophophatesynthase,DUMPS)是一种常染色体隐性遗传疾病，会造成母牛流产、死胎、整个牛群的繁殖力下降、产奶量下降等。由于人工授精技术的广泛应用，使DUMPS在全世界流传，直接影响了奶牛业的经济效益。DUMPS的病因主要是由于编码尿苷酸合酶的基因，在密码子405处存在C/T的突变，从而造成原编码精氨酸的密码子CGA转变为终止密码子TGA，因而转录产物最终只能翻译成一段C-末端缺失76个氨基酸催化亚基的短蛋白，该残缺蛋白不能催化乳清酸转化为鸟苷酸，故不能合成DNA、RNA所需的嘧啶核苷酸，导致胚胎在妊娠4060d死亡，死亡率高达100%[1][2]。美国等国家根据DUMPS的致病机制，建立了DUMPS的分子检测方法和育种方案，要求对荷斯坦种公牛必须进行隐性遗传疾病的检测。据报道美国大概有2%的荷斯坦奶牛携带DUMPS的致病基因[3]。我国荷斯坦种公牛主要从美国、加拿大、德国、以及澳大利亚和新西兰等国进口，包括进口的活牛和胚胎。以前我国对该疾病没有足够的认识和重视，引入了大量潜在的DUMPS携带者，同时引入的大量没有系谱资料的荷斯坦母牛，同样是潜在的携带者。这些引进的种公牛在我国的大量使用，使得我国的DUMPS携带者数目增加，由于没有自主产权的检测技术，因而无法公布母牛的检测结果，很难根据系谱推断DUMPS的传播途径。我国针对遗传性疾病展开的工作刚刚起步，在奶牛实际育种中开展的工作还不多，并且仅局限在实验室中[4]，我们应该在生产实践中及时检测出冷冻精液及母牛中DUMPS的携带者并予以淘汰，以减少经济效益的损失。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，寻找一种简便有效的用于牛尿苷酸合酶缺乏症的检测方法。实现本发明的技术路线如下所示本发明建立了一种快速、准确检测牛尿苷酸合酶缺乏症的AS-PCR方法，其具体步骤如下(1)引物设计根据GenBank提供的牛UMPS序列(登录号NC_007299)，根据AS-PCR的特性，利用生物学引物设计软件Premier5，设计了AS-PCR扩增引物。该引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。该引物序列详见具体实施方式中的实施例1。(2)AS-PCR:提取牛血样基因组DNA，根据PCR扩增可直接判断结果。若个体扩增出的目的片段为261bp(见SEQIDN0:1)，则为致病纯合子；若扩增出的目的片段为261bp和90bp，则为杂合子，即DUMPS疾病携带者；若扩增的目的片段为90bp(见SEQIDNO:2)，则为健康个体(见序列表SEQIDNO:1和2)。3与现有技术相比，本发明的积极效果是提供了一种快速准确筛选分型DUMPS的方法和特异性引物，直接应用于牛开展DUMPS的致病基因筛选，以利于DUMPS患病个体的早期淘汰。序列表SEQIDNO:l和SEQIDNO:2是本发明扩增的牛尿苷酸合酶缺乏症的目的片段，SEQIDNO:3-6是扩增牛尿苷酸合酶缺乏症基因UMPS的特异引物。图1:是本发明的技术流程图。图2:用血样DNA对UMPS基因进行AS-PCR扩增，琼脂糖检测电泳图。琼脂糖凝胶浓度为2%。图中编号说明如下l，2，3，4泳道为健康牛群基因型，扩增的产物长度为90bp;5为隐性携带者牛群基因型，扩增的产物长度为261bp和90bp;M为Markerl(600bp)。图3:是本发明扩增的牛尿苷酸合酶缺乏症的目的片段，图中下划线的序列是扩增的261bp片段和90bp片段的共用区。具体实施例方式下面结合实施实例并对照附图对本发明作进一步详细说明。实施例1:牛尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)基因型鉴定1、奶牛血样的采集及处理取奶牛血样约10mL，加入0.5mol/L的EDTA500yL(使终浓度为25mmol/L)抗凝，4t:离心(8000rpm)10min，弃上层清，分离白细胞，加入蒸馏水，摇匀，使红细胞破裂，离心10min，弃上层清液。重复两次后，在沉淀中加入1XSETlmL和10%十二烷基硫酸钠(SDS，终浓度为0.5%)，再缓慢加入蛋白酶K(终浓度为50100iig/mL)，置于55。C水浴锅消化810h，4。C冰箱中保存备用。2、从奶牛血样中提取NDA(1)取消化后的试样，加入等体积的平衡酚(pH8.0)，缓慢颠倒离心管10min，4°C离心(8000rpm)10min。(2)小心吸取含有DNA的上清液，移至另一离心管中，再次加入平衡酚，重复上述操作。(3)吸取的上清液中加入等体积的平衡酚/氯仿/异戊醇(体积比为25:24:1)，缓慢颠倒离心管10min，4。C离心(8000rpm)10min。(4)吸取上清液后加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24:1)，缓慢颠倒离心管10min，4。C8000rpm离心10min。(5)吸取上清液，加入1/10体积3mol/LNaAC及2倍体积的无水乙醇，迅速转动离心管，可见白色的絮状物，即DNA，于-20"放置30min。(6)取出冷冻后的样品，于10000rpm转速离心58min，去掉上层乙醇，加入70X的乙醇lmL洗涤沉淀，离心(80000rpm)58min。(7)加入70%的乙醇重复洗涤一次，离心(80000rpm)58min。(8)弃去乙醇，在室温下挥发残留乙醇，加入适量的TE溶解DNA。(9)将DNA样稀释成一定的浓度，存放于-2(TC冰箱保存备用。3、引物设计根据牛尿苷酸合酶缺乏症基因UMPS序列(登录号NC_007299)，利用生物学引物设计软件Premier5，设计AS-PCR扩增引物。该引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下突变型(产物长度为261bp):反向引物3'端倒数第三位引入错配；IF:5'ATGGGAGAAGGGGATAGGAG3'(见序列表SEQIDNO:3)，IR:5'TCTGGTTTCATGCTTACGCA3'(见序列表SEQIDNO:4);野生型(产物长度为90bp):正向引物3'倒数第三位引入错配；2F:5'ATTGGTTTTATTTCTGGCTACC3'(见序列表SEQIDNO:5)，2R:5'AGGCTTACCTCCTGCTTCTA3'(见序列表SEQIDNO:6)。4、AS-PCR扩增PCR反应总体积为20iiL(见表1)。扩增程序是94。C预热lOmin—94。C变性45s—63.3°C45s—72延伸45s(从第二步94"变性到第四步72延伸进行35个循环)，72。C延伸10min—15°ClOmin。表1PCR反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>1F/1R与2F/2R扩增出的PCR产物，分别取3iiL混合，2X琼脂糖凝胶电泳(IOOV，电泳20min)，EB(溴化乙锭)染色后，在凝胶成像系统观察条带。5、DUMPS基因型结果判定牛尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)基因型鉴定结果如图2所示，在基因UMPS的AS-PCR产物电泳图谱中，若个体扩增出的目的片段为261bp，则为致病纯合子；若扩增出的目的片段为261bp和90bp，则为杂合子，即DUMPS疾病携带者；若扩增的目的片段为90bp，则为健康个体。参考文献[l]Schober，S.，Simon，D.，Schwenger，B.SequencesofthecDNAencodingbovineuridinemonophosphatesynthase.Gene，1992，124:307—308.[2]Schwenger，B.，Schober，S.，Simon，D.DUMPScattlecarryapointmutationintheuridinemonophosphatesynthasegene.Genomics,1993，16:241—244[3]Shanks,R.D.，Dombrowski，D.B.，Harpestad，G.W.，Robinson,J丄InheritanceofUMPsynthaseindairycattle.J.Hered，1984，75:337-340.[4]李艳华等.中国荷斯坦牛脊椎畸形综合征的研究现状与展望.中国奶牛2008，6:27-29。序列表〈110〉华中农业大学〈120〉应用AS-PCR检测牛尿苷酸合酶缺乏症的方法〈130〉〈141>2009-12-01〈160>6〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>261〈212>DNA〈213>牛(Bosprimigenius)〈400>13tggg卿3gggg￡itegg￡igttettttegggtcttegtgg3gc3ggtetgtagattcate60tcteagattecctgtttegatetgagttcaatgtgacatg3g朋朋tecatccataagac120agcagagtttcttacgtttggtgtggttaactgctgtcttgtcatctgttgattecattc180cattcaggtgca朋tggctg朋g朋cattctg朋tttgtgattggttttetttctggctc240ccgagteagc3tga朋cc3ga261〈210>2〈211>90〈212>DNA〈213>牛(Bosprimigenius)〈220〉〈221〉gene〈222〉(1)(90)〈223〉〈400>2attggttttetttctggctcccgagteagcatgaaaccagaatttcttcacttgactcca60ggagttcagttegaagcaggaggteagcct90〈210>3〈211>20〈212>DNA〈213>牛(Bosprimigenius)〈220〉〈221>primer_bind<222>(1).(20)〈223〉〈400>3Eltggg卿Elgggg￡lt￡lgg￡lg〈210〉4〈211>20〈212>DNA〈213〉牛(Bosprimigenius)<220>〈221>primer—bind〈222〉(1)..(20)<223>〈400>4tctggtttcatgcttacgca<210>5〈211>22<212>DNA〈213〉牛(Bosprimigenius)〈220〉<221>primer—bind〈222〉(1)(22)〈223〉〈400>5attggttttatttctggctacc〈210>6〈211>20〈212〉DNA〈213>牛(Bosprimigenius)〈220〉C0112]〈221〉primer一bind〈222〉(1)(20)〈223〉〈400〉6aggcttacctcctgcttcta说明书5/5页20202220权利要求应用AS-PCR检测牛尿苷酸合酶缺乏症的方法的特异性引物，其特征在于，所述引物序列如下所示基因UMPS的扩增引物突变型反向引物3’端倒数第三位引入错配，扩增产物长度为261bp，1F5′ATGGGAGAAGGGGATAGGAG3′，1R5′TCTGGTTTCATGCTTACGCA3′；野生型正向引物3’倒数第三位引入错配产物，扩增产物长度为90bp；2F5′ATTGGTTTTATTTCTGGCTACC3′，2R5′AGGCTTACCTCCTGCTTCTA3′。2.权利要求1所述的引物在AS-PCR检测牛尿苷酸合酶缺乏症中的应用。全文摘要本发明属于动物疾病检测
技术领域：
，具体涉及应用AS-PCR检测牛尿苷酸合酶缺乏症的方法。制备了一种用于牛尿苷酸合酶缺乏症检测方法的特异性PCR引物，它包括UMPS基因扩增引物突变型反向引物3’端倒数第三位引入错配，扩增产物长度为261bp；1F5’ATGGGAGAAGGGGATAGGAG3’，1R5’TCTGGTTTCATGCTTACGCA3’；野生型正向引物3’倒数第三位引入错配产物，长度90bp；2F5’ATTGGTTTTATTTCTGGCTACC3’，2R5’AGGCTTACCTCCTGCTTCTA3’。本发明制备的牛尿苷酸合酶缺乏症的方法的特异性引物，可直接应用于开展牛尿苷酸合酶缺乏症的致病基因的筛选，以利于对患病个体进行早期淘汰。文档编号C12Q1/68GK101705306SQ20091027295公开日2010年5月12日申请日期2009年12月1日优先权日2009年12月1日发明者何年华,刘耘,吴世钦,周傲,宴帮富,张淑君,杨利国,梁爱心,滑国华,熊家军,王成,黄长梅申请人:华中农业大学