利用环境压力提高芽胞杆菌发酵聚-γ-谷氨酸产量的方法

专利名称：利用环境压力提高芽胞杆菌发酵聚-γ-谷氨酸产量的方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用环境压力方法来提高芽胞杆 菌发酵聚-Y -谷氨酸产量的方法，该环境压力选择方法包括钾离子介导的渗透压力、热冲 击压力或pH压力等，以期获得提高聚-、-谷氨酸产量。
背景技术：
聚-Y -谷氨酸是由微生物合成的一种胞外高分子粘性物质，是由L-和D-谷氨 酸单体形成的同聚酰胺。聚-Y-谷氨酸具有水溶性、成膜性、可食用性、生物降解性，对 人类和环境无毒害作用，可以广泛地应用于医药、食品、轻化工、环保和农业等领域(参见 Buescher JM 禾口 Margaritis A. Crit Rev Biotechnol，2007，27 1—19.)。聚 谷氨 酸可增强菌体对多种环境压力的抗性(Oppermann-Sanio FB和Steinbuchel A. Naturwi ssenschaften,2002,89 :11_22.)。当生物体面临环境压力条件的胁迫时，合成具有保护 功能的代谢产物是其维持生存的重要策略。因此，通过环境压力来提高具有保护功能的代 谢产物的产量是一种重要的策略(Umakoshi H, Yoshimoto M. Shimanouchi T. Biotechnol Prog, 1998，14 =218-226)。几位学者发现培养基中高含量的NaCl可增强聚-、-谷氨酸的 合成，显示了 NaCl介导的高渗透压力可增强聚-Y-谷氨酸的合成(Hezayen FF等，Appl Microbiol Biotechnol,2000, 54319-325 ；Shimizu K等，Appl Environ Microbiol,2007, 73 =2378-2379) 但未见通过钾离子介导的渗透压力、热冲击压力和pH压力的选择和调整 来提高聚_ Y _谷氨酸产量的报道，因此通过多种环境压力方法来提高聚_ Y _谷氨酸的发 酵产量是一个新课题。

发明内容
本发明目的在于克服现有技术的缺陷，通过环境压力选择等措施提高聚_ Y _谷 氨酸产量。即在发酵过程中选择应用钾离子介导的渗透压力、热冲击压力和PH压力来达到 提高聚_ Y _谷氨酸发酵产物的产量。本发明的目的是这样实现的采用冷冻保藏的地衣芽胞杆菌或枯草芽胞杆菌(地衣芽胞杆菌WX-02，于2008年 4月28日送交中国湖北，武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号 为CCTCCM208065)为生产菌种发酵生产聚-Y _谷氨酸。在发酵过程中，采用钾离子介导的 渗透压力或/和热冲击压力或/和pH压力方法来提高聚-Y _谷氨酸产量。所述通过钾离 子介导的渗透压力提高聚_ Y _谷氨酸产量的方法，具体步骤为在发酵第0-18h，向培养基 中添加1-5 %的KC1或者K2S04 (优选条件为在发酵第0h，添加3 %的KC1)；所述通过热冲击 压力提高聚_ Y _谷氨酸产量的方法是在液体种子液制备好后，于42-55°C加热液体种子液 5-20min (优选热冲击压力条件为50°C热冲击15min)；所述通过pH压力提高聚-Y _谷氨酸 产量的方法是在在发酵第0-24h，调整发酵液pH至7. 5-9. 0 (优选条件为在发酵第0h，调整发酵液PH至8. 5)；所述采用钾离子介导的渗透压力方法和pH压力联用来提高聚-Y -谷 氨酸产量是在发酵第Oh，向发酵液中添加3%的氯化钾，调整发酵液pH至8. 5 ；采用钾离子 介导的渗透压力和热冲击压力联用提高聚_ Y _谷氨酸产量的方法，是在液体种子液制备 好后，于50°C加热液体种子液15min，在发酵第Oh，向发酵液中添加3%的氯化钾；采用热冲 击压力和PH压力联用提高聚-Y -谷氨酸产量的方法，是在液体种子液制备好后，于50°C 加热液体种子液15min，在发酵第Oh，调整发酵液pH至8. 5 ；采用钾离子介导的渗透压力、 热冲击压力和调整pH压力联用提高聚-Y -谷氨酸产量的方法，是在液体种子液制备好后， 于50°C加热液体种子液15min，在发酵第Oh，向发酵液中添加3%的氯化钾，同时调整发酵 液pH至8. 5。
与现有技术相比，本发明具有如下突出特点(1)对聚-Y -谷氨酸的增产效果显著，通过热冲击压力、钾离子介导的渗透压力 和PH压力处理后，聚-γ -谷氨酸产量增产显著。(2)本发明的方法发酵操作简单，成本低，通过简单的加热处理，添加少量的钾离 子，调控发酵液PH值，易于操作，成本低廉。(3)本发明为聚-Y-谷氨酸的发酵生产提供了一系列新的方法，增产效果显著， 发酵操作简单，为聚-Y-谷氨酸的工业化生产奠定了基础。更详细的技术方案见《具体实施方式
。》


序列表SEQ ID NO 1是地衣芽胞杆菌WX-02的16S rRNA序列。图1 钾离子介导的渗透压力(1% KCl)对地衣芽胞杆菌WX-02菌体生长的影响。图2 热冲击压力(45°C，IOmin)对地衣芽胞杆菌WX-02菌体生长的影响。图3 :pH压力(pH7. 5)对地衣芽胞杆菌WX-02菌体生长的影响。图4 是本发明是本发明前期研究获得的地衣芽胞杆菌WX-02的16S rRNA序列的 系统发育树。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明进行详细说明，但所有实施例并不对本发明构成任何限 制。实施例1通过钾离子介导的渗透压力提高聚-Y-谷氨酸产量(1)用冷冻保藏的菌种地衣芽胞杆菌WX-02 (见《发明内容》中的CCTCC M208065) 为生产菌株，该菌株的相关信息如下地衣芽胞杆菌WX-02的鉴定1、菌株WX-02的形态学特点菌体形状为杆状，长2-3微米，宽0. 8-1微米。该菌株在固体培养基上生长，菌落 形态可发生变化生长在LB固体培养基，菌落表面粗糙，边缘褶皱，形状不规则；当LB培养 基中含有2%的L-谷氨酸钠时，菌落表面光滑，菌落圆形，形状规则，呈乳液状能拉丝。2、菌株WX-02的生理生化特点生理生化鉴定结果如表1所示。
表1地衣芽胞杆菌WX-02WX-02的生理生化特点 3、地衣芽胞杆菌WX-02的16S rRNA序列鉴定将本发明分离的地衣芽胞杆菌WX-02的16S rRNA序列(见序列表SEQ ID NO 1 所示，序列登录号ETO64336)与Genebank的核酸序列进行同源性比对(Blastn)，结果显 示本发明分离的地衣芽胞杆菌WX-02同Bacillus licheniformis strain DSM 13的相似 性达到99%。同相近种属模式菌株16S rRNA序列进行序列比对，并构建系统发育树，结果 如图4所示，本发明分离的地衣芽胞杆菌WX-02同Bacillus licheniformis位于同一个聚 类。根据形态特征、生理生化特性和16SrDNA序列分析方法，申请人将WX-02菌株鉴定为地 衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)。该菌株已于2009年4月28日送交湖北省武汉市 武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏，其保藏号为CCTCC M208065。(2)斜面菌种活化将冷冻保藏的地衣芽胞杆菌WX-02，接种到LB固体斜面(含蛋白胨10g/L、酵母浸 出物 5g/L、NaCl 10g/L、琼脂 15g/L、pH 7. 0)，37°C培养 24h，得到种子菌。(3)种子液培养将LB固体斜面活化的种子菌转接到含蛋白胨10g/L，酵母浸出物5g/L，NaCl 10g/ L, pH为7. 0的LB三角瓶液体种子培养基中，于37°C，200r/min下培养12h至对数生长中期。(4)摇瓶发酵培养按照以下组份配制发酵培养基谷氨酸钠40g/L，葡萄糖70g/L，柠檬酸钠8g/L，氯 化铵 8g/L, MnS04 H20 0. 01g/L, MgS04 7H20 0. 2g/L, K2HP040. 8g/L, ZnS04 7H20 0. 2g/L, CaCl2 2H20 0. 2g/L，pH 7. 0，补充蒸馏水至1L，在本实施例中该培养基配制150mL，将所述
5的发酵培养基分装250mL的三角瓶，每瓶装液量50mL，以121°C高压蒸汽灭菌维持30min， 冷却至37°C，按照1. 5ml的接种量接入种子液，摇床转速200r/min，发酵温度37°C，发酵至 48h结束发酵。(5)钾离子介导的渗透压力试验在发酵第0h，向发酵培养基中添加的氯化钾。(6)聚_ Y _谷氨酸的检测将上述发酵液离心除去菌体、收集上清液，取5mL发酵离心上清液，加3倍体积酒 精沉淀聚_ Y _谷氨酸，溶解产物，加等体积浓盐酸，密封于沸水浴中水解24h，水解后将水 解液加lOmol/L的NaOH中和定容，经0. 22um的微孔滤膜过滤，测定聚-Y _谷氨酸的含量由 高压液相色谱仪(HPLC)完成，色谱柱Agilent 1100，流动相为100mmol/L KH2P04加5. 0% 甲醇(用磷酸调PH值至2. 5)过滤，超声波除气，紫外检测波长为210nm，流速为lmL/min， 谷氨酸作为定量的标准物。按照下列公示计算聚-Y-谷氨酸浓度=水解后谷氨酸浓度X 129/147。在发酵第0h，向发酵培养基中添加的氯化钾，菌体生长情况如图1所示，表明 添加的氯化钾后，菌体在短时间内生长缓慢，延迟期延长，添加的氯化钾对菌体而 言，在短期内是一种渗透压力胁迫作用，发酵结束后两组产量对比如下表2 表2、钾离子介导的渗透压力对聚_ Y _谷氨酸发酵的影响 表2结果显示与对照组相比，在发酵第0h，通过的氯化钾介导的渗透压力方 法，聚1-谷氨酸产量较对照组增产36%。实施例2通过钾离子介导的渗透压力提高聚_ Y _谷氨酸产量(1)本实施例采用的原始菌种同实施例1 (1)。(2)斜面菌种活化同实施例1⑵。(3)种子液培养同实施例1 (3)。(4)摇瓶发酵培养同实施例1⑷。(5)钾离子介导的渗透压力在发酵第0h，向发酵培养基中添加5%的氯化钾，发酵48h。(6) M-y-谷氨酸的检测同实施例1 (6)。以不施加渗透压力的处理作为对照，发酵结束后两组产量对比如下表3 表3、氯化钾介导的渗透压力对聚_ Y _谷氨酸发酵的影响 表3结果显示与对照组相比，在发酵0h，向发酵培养基中添加5%的氯化钾， 聚-Y-谷氨酸产量较对照组增产89%。实施例3通过钾离子介导的渗透压力提高聚_ Y _谷氨酸产量(1)原始菌种同实施例1 (1)。(2)斜面菌种活化同实施例1 (2)。(3)种子液培养同实施例1 (3)。(4)摇瓶发酵培养同实施例1⑷。(5)钾离子介导的渗透压冲击在发酵第0h，向发酵培养基中添加3%的氯化钾，发酵48h。(G)M-Y-谷氨酸的检测同实施例1 (6)。以不施加渗透压力的处理作为对照，发酵结束后两组产量对比如下表4 表4、氯化钾介导的渗透压力对聚_ Y _谷氨酸发酵的影响 表4结果显示与对照组相比，在发酵第0h，向发酵培养基中添加3%的氯化钾， 聚-Y-谷氨酸产量较对照组增产106%。实施例4通过钾离子介导的渗透压力提高聚_ Y _谷氨酸产量(1)原始菌种同实施例1 (1)。(2)斜面菌种活化同实施例1 (2)。(3)种子液培养同实施例1 (3)。(4)摇瓶发酵培养同实施例1⑷。(5)钾离子介导的渗透压力在发酵第18h，向发酵培养基中添加3%的氯化钾，发酵48h。(6) M-Y-谷氨酸的检测同实施例1 (6)。以不施加渗透压力的处理作为对照，发酵结束后两组产量对比如表5 表5、氯化钾介导的渗透压力对聚_ Y _谷氨酸发酵的影响 表5结果显示与对照组相比，在发酵第18h，向发酵培养基中添加3%的氯化钾， 聚-Y-谷氨酸产量较对照组增产15%。实施例5通过钾离子介导的渗透压力提高聚_ Y _谷氨酸产量(1)原始菌种同实施例1 (1)。(2)斜面菌种活化同实施例1 (2)。(3)种子液培养同实施例1 (3)。(4)摇瓶发酵培养同实施例1⑷。(5)钾离子介导的渗透压力在发酵第0h，向发酵培养基中添加的硫酸钾，发酵48h。(6)聚_ Y _谷氨酸的检测同实施例1 (6)。以不施加渗透压力的处理作为对照，发酵结束后两组产量对比如下表6 表6、硫酸钾介导的渗透压力对聚_ Y _谷氨酸发酵的影响 表6结果显示与对照组相比，在发酵第0h，向发酵培养基中添加的硫酸钾， 聚-Y-谷氨酸产量较对照组增产23%。实施例6通过钾离子介导的渗透压力提高聚_ Y _谷氨酸产量(1)原始菌种同实施例1 (1)。(2)斜面菌种活化同实施例1 (2)。(3)种子液培养同实施例1 (3)。(4)摇瓶发酵培养同实施例1⑷。(5)钾离子介导的渗透压力在发酵第18h，向发酵培养基中添加3%的硫酸钾，发酵48h。(6) M-Y-谷氨酸的检测同实施例1 (6)。以不施加渗透压力的处理作为对照，发酵结束后两组产量对比如下表7 表7、硫酸钾介导的渗透压力对聚_ Y _谷氨酸发酵的影响 表7结果显示与对照组相比，在发酵第18h，向发酵培养基中添加3%的硫酸钾， 聚-Y-谷氨酸产量较对照组增产31 %。实施例7通过钾离子介导的渗透压力提高聚_ Y _谷氨酸产量(1)原始菌种为枯草芽胞杆菌CCTCC M202048(聚-Y-谷氨酸产生菌及生产 聚-Y-谷氨酸的方法，专利申请号=03118908. 3 ；专利
发明者冀志霞, 舒芹, 陈守文, 雍阳春, 魏雪团 申请人:华中农业大学