专利名称：一种水生棒状杆菌的筛选方法及其在降解草甘膦废水中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水生棒状杆菌及其筛选方法，本发明还涉及该菌种在降解草甘膦
废水中的应用。
背景技术：
草甘膦的化学名称为N-膦羧甲基甘氨酸，属于氨基甲撑膦类含有羧酸基的化合 物。草甘膦废水具有浓度高、污染严重的特点，废水所含的污染物主要有甲醇、甲醛、草甘膦 以及盐类等。现今，我国草甘膦废水的处理也是一个急需解决的难题。若不进行处理任其 排入环境中，不可避免地会污染水源、传播疾病、危害人们的身心健康。 根据国内外废水处理现已采用的工艺及运行情况，当前的环境处理技术主要分 为(l)物理处理技术，包括活性炭处理、活性氧化铝吸附、加入CaCl2溶液使草甘膦以钙 盐的形式沉淀等，该处理技术主要用于去除水中难溶解的大颗粒污染物。在处理过程中没 有真正降解废水，只是进行了简单的吸附作用或物态的转化；并且处理过程中需要调节pH 值，在最适pH下才能达到最佳处理效果，操作过程复杂。(2)化学处理技术，如Fenton、氧 化_镁盐沉淀法、次氯酸钠氧化、铁炭微电解法等。虽然目前以Ti02及Fenton为代表热点 研究的高级氧化技术具有条件宽松，水污染处理相对简单等优势，但Fenton及Ti02氧化方 法及技术对有机物矿化不完全、技术还处于研究阶段，需要进一步开发。(3)生物处理技术， 是从自然界中选育菌株来处理废水的原始形式，即利用废水中的有毒污染物作为唯一碳源 或者主要碳源，从而对废水进行降解。生物处理技术优势体现在处理废水量大，转化率高； 操作管理简单、处理设备成本及运行费用低；无二次污染，对环境友好；该方法尤其对小分 子有机物有良好的降解效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选出能高效降解草甘膦废水的水生棒状杆菌的方法 并得到这种水生棒状杆菌； 本发明的另一个目的是将这种水生棒状杆菌用于降解草甘膦废水。
本发明的目的是这样实现的 水生棒状杆菌CTGU-CGL-001 (Corynebacterium aquaticum CTGU-CGL-001)，保藏 于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No :M 209203，保藏日期2009年9月16日。
水生棒状杆菌CTGU-CGL-001的筛选方法，包括以下步骤
a菌株的富集步骤 在容器中，加入草甘膦废水及以体积比计3倍于草甘膦废水的富集培养基，再加 入曝气静置24h的污泥，置于摇床中，3(TC恒温振荡培养3天；
b菌株的驯化步骤 在无菌条件下加入草甘膦废水、菌液以及无机盐培养基，草甘膦废水的体积逐渐递增，置于摇床中3(TC恒温振荡培养，4天为一个驯化周期，进行三个周期的驯化，每个驯 化周期结束后，测定每瓶培养液的COD值，计算出降解率，每组取平行样中草甘膦废水降解
率最高的培养液作为下一次驯化的接种源；
c菌株的纯化步骤 经过了三个周期的驯化，在无菌条件下，取废水降解率最高的培养液在含有草甘 膦废水的无机盐平板上涂布，废水与无机盐培养液体积比为3 : 2，3(TC恒温培养，挑取单 菌落，反复划线分离纯化，得到单一菌落。
所述富集培养基组成是单位g/L，蛋白胨，l.O ;葡萄糖，5.0 ;K2HP04，1.0 ;
KH2P04， 1. 0 ;NaC1，2. 5g ;pH7. 0-7. 2。 所述的无机盐培养基组成是，单位g/L， KH2P04，0. 5 ;K2HP04，0. 5 ;MgS04 7H20， 0. 2 ;CaCl2，0. 1 ;NaCl，O. 2 ;Mn S04 *!120痕量；质量分数10%的FeS04溶液1滴；NH4N03， 1. 0g ; 废水加入作为微生物生长的唯一碳源；用质量分数为10X的Na0H溶液调节pH为7. 0 ;固体 培养基加质量分数为1. 5-2. 0%的琼脂。 培养温度最适温度为30°C ;培养方式好氧培养；培养底物浓度300mL L—1 ;pH 值范围最适pH为9.0。 水生棒状杆菌CTGU-CGL-001在降解草甘膦废水中的应用。 本发明提供的水生棒状杆菌的筛选方法及其在降解草甘膦废水中的应用，从自然 界的活性污泥中筛选到一株能降解草甘膦废水的好氧微生物，即在有氧条件下能矿化草甘 膦废水的微生物，然后经过选择性富集、驯化培养、筛选和纯化的过程，最终分离筛选出能 高效降解废水中高浓度有机物的菌株，得到了一种用于降解草甘膦废水的水生棒状杆菌。 本发明将此水生棒状杆菌应用于降解草甘膦废水，对预处理后的草甘膦废水矿化程度较 高，处理废水量大，处理设备成本及运行费用低，不产生二次污染，操作简单，应用广泛，最 高降解率达84. 22%。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是温度对菌株降解草甘膦废水的影响曲线图。 将菌悬液10mL接入滤液体积为15mL (培养液总体积为50mL) 、 pH为7. 0的25mL 无机盐培养液中，在不同的培养温度(15、20、25、30、35、40°C )下恒温振荡培养，每个温度 做两个平行样。培养四天后，测定培养液的COD，得出在不同温度条件下菌株降解废水的降 解曲线。 图2是pH对菌株降解草甘膦废水的影响曲线图。将菌悬液10mL接入滤液体积为15mL (培养液总体积为50mL)、无机盐培养液25mL 中，在不同的pH (4、5、6、7、8、9、 10、 11)下恒温振荡培养，每个pH做两个平行样。30°C培养 四天后，测定培养液的COD，得出在不同pH条件下菌株降解废水的降解曲线。
图3是底物浓度对菌株降解草甘膦废水的影响曲线图。 将菌悬液lOmL加入不同的滤液体积(5、 10、 15、20、25、30、35、40mL)，再接入液体 无机盐培养基，pH为7. 0下恒温振荡培养(培养液总体积为50mL)，每个底物浓度做两个平 行样。3(TC培养四天后，测定培养液的COD，得出在加入不同底物浓度下菌株降解废水的降解曲线。 图4是最优条件下草甘膦废水降解曲线(a)和空白实验(b)。 菌株降解草甘膦废水的最佳降解条件为温度3(TC、pH为9.0、当底物浓度为 300mL *L—工时，降解比较完全。所以设定温度3(TC、pH为9. 0、底物浓度底物浓度为300mL 'L一1 条件下，测定草甘膦生产药业废水的降解曲线。每隔10小时测定培养液C0D。草甘膦废水 降解率随时间的变化。
具体实施例方式
本发明提供的水生棒状杆菌CTGU-CGL-001(Corynebacterium aquaticumCTGU-CGL-001)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No :M209203， 保藏日期2009年9月16日。 水生棒状杆菌CTGU-CGL-001的制备方法
—、菌株的富集 a、在250mL的锥形瓶中，加入30mL富集培养基，草甘膦废水10mL，再加入曝气静置 24h的污泥10mL(共计50mL)，置于摇床中，3(TC恒温振荡培养3d。
b、菌株的驯化过程 在无菌条件下加入草甘膦废水、菌液以及无机盐培养基，草甘膦废水的体积由 10mL、 15mL逐渐递增到30mL，培养液总体积均为50mL，置于摇床中3(TC恒温振荡培养，4d为 一个驯化周期，进行三个周期的驯化。每个驯化周期结束后，测定每瓶培养液的COD值，计 算出降解率。每组取平行样中草甘膦废水降解率最高的培养液作为下一次驯化的接种源。
C、菌株的纯化与鉴定 经过了三个周期的驯化，在无菌条件下，取废水降解率最高的培养液在含有草甘 膦废水的无机盐平板(废水与无机盐培养液体积比为3 : 2)上涂布，3(TC恒温培养，挑取 单菌落，反复划线分离纯化，得到单一菌落。将所得到的菌株接种于牛肉膏蛋白胨平板上， 4t:冰箱保存。菌株的鉴定，采用形态和显微观察相结合的方法，根据文献进行特性鉴定。
二 、培养该菌种采用的培养基 富集培养基(g/L):蛋白胨，1. 0 ;葡萄糖，5. 0 ;K2HP04， 1. 0 ;KH2P04， 1. 0 ;NaCl， 2. 5g ;pH7. 0-7. 2。 无机盐培养基(g/L) :KH2P04，0. 5 ;K2HP04，0. 5 ;MgS04 7H20， 0. 2 ;CaCl2，0. 1 ;NaCl，
0. 2 ;MnS04 *H20痕量；质量分数10%的FeS04溶液1滴；NH4N03， 1. 0g ;废水按一定体积(10、 15、30mL)加入作为微生物生长的唯一碳源；用质量分数为10X的Na0H溶液调节pH为7. 0 ; 固体培养基加质量分数为1. 5-2. 0%的琼脂。 牛肉膏蛋白胨培养基(g/L):牛肉膏，5.0 ;蛋白胨，10 ;NaC1，2.5 ;pH7.0 ;琼脂
1. 5-2. 0% ;固体培养基加质量分数为1. 5-2. 0%的琼脂。
三、菌种的培养条件 培养温度最适温度为30°C ;
培养方式好氧培养；
培养底物浓度300mL L—1 ;
pH值范围最适pH为9. 0。
四、该菌种的形态及生理生化特征 该菌在牛肉膏蛋白胨平板上生长，菌落乳白色，圆整，表面光滑湿润，不透明，无特 殊气味； 生理生化特征显微观察菌体呈杆状，革兰阴性，细胞单生，不运动，无鞭毛。 利用API细菌鉴定系统，用API Coryne试条鉴定该菌种为水生棒状杆菌属。 API Coryne试条试验结果如下NIT呈阳性；PYZ呈阳性；PYRA呈阴性；PAL呈阳
性；aGLU呈阳性;P GUR、 P GUR呈阴性;P NAG呈阴性；ESC呈阳性；URE呈阴性；GEL呈阳性;
GLU、 RIB、 XYL、 MAN、 MAL、 LAC、 SAC、 GLYG均呈阴性。 水生棒状杆菌CTGU-CGL-001在降解草甘膦废水中的应用 草甘膦废水预处理 将草甘膦废水原水稀释5倍并加入一定量的CaCl2溶液，浓度为634g/L，使得草甘
膦以钙盐的形式沉淀，充分反应后过滤，取草甘膦废水滤液进行生物降解。 实施例1无菌条件下在250mL的锥形瓶中，加入5mL草甘膦废水，10mL菌液，及无机盐培养 基(共计50mL)，置于摇床中，3(TC恒温振荡培养4天。4天后，菌株对草甘膦废水降解率达 26. 59%。
实施例2无菌条件下在250mL的锥形瓶中，加入10mL草甘膦废水，10mL菌液，及无机盐培养 基(共计50mL)，置于摇床中，3(TC恒温振荡培养4天。4天后，菌株对草甘膦废水降解率达 57. 04%。
实施例3无菌条件下在250mL的锥形瓶中，加入15mL草甘膦废水，10mL菌液，及无机盐培养 基(共计50mL)，置于摇床中，3(TC恒温振荡培养4天。4天后，菌株对草甘膦废水降解率达 84. 22%。
实施例4无菌条件下在250mL的锥形瓶中，加入20mL草甘膦废水，10mL菌液，及无机盐培养 基(共计50mL)，置于摇床中，3(TC恒温振荡培养4天。4天后，菌株对草甘膦废水降解率达 67. 55%。
实施例5无菌条件下在250mL的锥形瓶中，加入25mL草甘膦废水，10mL菌液，及无机盐培养 基(共计50mL)，置于摇床中，3(TC恒温振荡培养4天。4天后，菌株对草甘膦废水降解率达 59. 58%。
实施例6无菌条件下在250mL的锥形瓶中，加入30mL草甘膦废水，10mL菌液，及无机盐培养 基(共计50mL)，置于摇床中，3(TC恒温振荡培养4天。4天后，菌株对草甘膦废水降解率达 53. 08%。
实施例7 无菌条件下在250mL的锥形瓶中，加入35mL草甘膦废水，10mL菌液，及无机盐培养 基(共计50mL)，置于摇床中，3(TC恒温振荡培养4天。4天后，菌株对草甘膦废水降解率达28. 17%。 本发明中采用的草甘膦废水采自湖北宜昌某草甘膦生产集团。其废水主要理化性 质为:深黄色、臭鸡蛋气味、碱性、BOD 73. 2mg L—、COD 95800. OOmg L-、
所述污泥采自采取①三峡大学求索溪的池塘污泥；②宜昌草甘膦生产集团污水 处理厂次生池污泥；③更正为宜昌草甘膦生产集团污水处理厂终生池污泥；④宜昌草甘膦 生产集团污水处理厂排污口污泥，作为原始的菌液。将废水和四处污泥曝气静置24小时。
权利要求
水生棒状杆菌CTGU-CGL-001(Corynebacterium aquaticum CTGU-CGL-001)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NoM 209203，保藏日期2009年9月16日。
2. 权利要求1所述的水生棒状杆菌CTGU-CGL-001的筛选方法，其特征在于包括以下 步骤a菌株的富集步骤在容器中，加入草甘膦废水及以体积比计3倍于草甘膦废水的富集培养基，再加入曝 气静置24h的污泥，置于摇床中，3(TC恒温振荡培养3天； b菌株的驯化步骤在无菌条件下加入草甘膦废水、菌液以及无机盐培养基，草甘膦废水的体积逐渐递增， 置于摇床中3(TC恒温振荡培养，4天为一个驯化周期，进行三个周期的驯化，每个驯化周期 结束后，测定每瓶培养液的COD值，计算出降解率，每组取平行样中草甘膦废水降解率最高 的培养液作为下一次驯化的接种源；c菌株的纯化步骤经过了三个周期的驯化，在无菌条件下，取废水降解率最高的培养液在含有草甘膦废 水的无机盐平板上涂布，废水与无机盐培养液体积比为3 : 2，3(TC恒温培养，挑取单菌落， 反复划线分离纯化，得到单一菌落。
3. 如权利要求2所述的水生棒状杆菌CTGU-CGL-001的筛选方法，其特征在于所述 富集培养基组成是单位g/L，蛋白胨，1.0 ;葡萄糖，5.0 ;K2HP04，1.0 ;KH2P04，1.0 ;NaCl， 2. 5g ;pH7. 0-7. 2。
4. 如权利要求2所述的水生棒状杆菌CTGU-CGL-001的筛选方法，其特征在于所述 的无机盐培养基组成是，单位g/L， KH2P04，0. 5 ;K2HP04，0. 5 ;MgS04 7H20，0. 2 ;CaCl2，0. 1 ; NaCl，O. 2 ;MnS04 H20痕量；质量分数10%的FeS04溶液1滴；NH4N03， 1. 0g ;废水加入作为 微生物生长的唯一碳源；用质量分数为10X的Na0H溶液调节pH为7. 0 ;固体培养基加质量 分数为1.5-2.0%的琼脂。
5. 如权利要求2所述的水生棒状杆菌CTGU-CGL-001的筛选方法，其特征在于培养温 度最适温度为30°C ;培养方式好氧培养；培养底物浓度300mL L—1 ;pH值范围最适pH 为9.0。
6. 如权利要求1所述的水生棒状杆菌CTGU-CGL-001在降解草甘膦废水中的应用。
全文摘要
一种水生棒状杆菌的筛选方法及其在降解草甘膦废水中的应用，即以草甘膦废水为唯一碳源，通过选择性富集、驯化培养、划线分离和纯化，从自然界活性污泥中分离得到能高效降解草甘膦废水的工程菌。经形态、培养特征及生理生化实验结果观察，鉴定出水生棒状杆菌对草甘膦废水有很高降解效果。本发明的工程菌可应用于处理草甘膦废水及城市生活污水中有机污染物的净化处理。所述水生棒状杆菌最适生长条件温度为30℃，pH为7.0，底物浓度为300ml·l-1。工程菌处于最适生长条件下，其对草甘膦废水降解率最高可达84.22％，矿化程度较高，处理设备成本低，操作简单，应用广泛。
文档编号C12N1/20GK101709284SQ200910272949
公开日2010年5月19日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者梅朋森, 王晓星, 黄应平 申请人:三峡大学