专利名称：去除水体中氨态氮、硝态氮和亚硝态氮的施氏假单胞菌yzn-001及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农业应用微生物技术领域，具体涉及一株去除水体中氨态氮、硝态氮 和亚硝态氮的施氏假单胞菌YZN-001的筛选及应用。
背景技术：
氮素是水体污染的一类重要污染物，包括来源于生活污水和农业废弃物的有机态 氮和氨氮、亚硝酸盐氮及硝硝酸盐氮等无机氮，主要以NH3、 NH4—、 N2 、 N20、 N0、 N02—、 N02、 N03—等 价态存在(郑平等，2004)，研究证明，除了分子态氮以外，所有氮素循环中间产物积累均会 对人类和环境产生不良影响。大量的氮化合物进入水体中将恶化水体质量，影响渔业发展 和危害人体健康，其危害主要表现在(l)氨氮要消耗水体的溶解氧；(2)游离氨可影响鱼 腮中氧的传递，引起鱼类大量死亡；(3)硝酸盐和亚硝酸盐可转化为亚硝胺，而亚硝胺是致 癌、致突变物质，对人体构成有潜在的威胁；(4)引起水体的"富营养化"，使水体变得腥臭 难闻，透明度下降，鱼类和其他生物大量死亡，富营养化在海水则形成"赤潮"(郑兴灿等， 1998)。 虽然目前我国在水污染防治方面做了很多工作，但是氮素仍是造成水体污染的主 要原因之一。调查表明(金相灿等，2000):我国大部分湖泊、水库已达到富营养化或超过富 营养化程度。其中富营养化的湖泊水库有江苏太湖、安徽巢湖等9个，重富营养化的有流花 湖、墨水湖、滇池、东山湖、南湖、玄武湖和麓湖等。而水体中含有的营养盐类元素氮、磷超标 是引起富营化的主要原因(Rffollety和Jlhatfield，2002 ;Amallin等，2004)。所以如何 经济、高效地去除水体中的氮素已成为水污染控制领域的研究重点和热点。
传统的脱氮方法主要有物理方法(增氧、换水、吸附过滤等)，化学方法(加过氧化 钙、生石灰、偶合剂)及生物方法(水生植物、硝化菌和光合细菌等微生物)。生物脱氮工艺 以其操作简单、投资少、成本低、不易造成环境污染，除氮效果也较好等多方面的优点，目前 在国内外水处理中被广泛应用(Rezaeeet al， 2008 ;孔庆鑫，2005)。 生物脱氮(biological nitrogen removal，BNR)方法是指通过微生物的硝化和反 硝化作用来脱除水体中的氮素污染(Prakasam and Loehr， 1972)。硝化作用是指硝化菌将 氨氮氧化成硝酸盐氮的过程，包括两个步骤第一步是由亚硝酸菌(Nitrosobacter)将氨 氮转化为亚硝酸盐，第二步是由硝酸菌(Nitrobacter)从将亚硝酸盐转化为硝酸盐。反硝 化作用是指反硝化细菌将硝态氮(盐)、亚硝态氮(盐)及其它氮氧化物转变为氮气或氮的 其它气态氧化物的生物学过程(Kim等，2005)。 然而，传统生物脱氮也有其自身难以克服的缺点一方面，亚硝酸细菌为化能自养 菌，生长速率缓慢，导致反应器启动时间长，增加了水处理成本，并且亚硝酸细菌对污水组 成成分、ra和温度等的改变都敏感(Meiberg和Harder ;1978)。另一方面，硝化过程是在好 氧环境中完成的，而反硝化是在缺氧过程中进行的。这使得整个脱氮过程必须经过好氧和 缺氧两个环节(Joo等，2005)。因此，人们努力探求新型、效果更好的脱氮微生物。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，获得一株能够去除水体中氨态氮、硝态 氮和亚硝态氮的，在好氧条件下能同步硝化或反硝化的细菌，该菌具有异养硝化菌和好氧 反硝化菌的特点，可以利用有机碳源，在高C/N比的污水中快速生长和脱氮，同时不产生或 很少产生N02-N及N20，并且能在不同的自然环境温度下生长。本发明通过实施，获得一株 能去除水体中氨态氮、硝态氮和亚硝态氮的施氏假单胞菌。
本发明通过以下技术方案实现 申请人:于2007年5月从中国湖北省武汉市华中农业大学种猪场粪池污泥中分离
得到一株对氨氮有高降解能力的菌株，其在好氧条件下对硝态氮及亚硝态氮都有很好的降
解能力。经形态观察，生理生化和16SrDNA鉴定(其16S rDNA比对鉴定的核苷酸序列见序列
表SEQ ID NO :1所示)，该编号为YZN-001菌株在分类学上属于施氏假单胞菌(Pseudomonas
stutzeri)。申请人于2009年5月15日将该菌株送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典
型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO :M 209107。 如此同时，申请人公开了筛选能去除水体中的氨态氮、硝态氮和亚硝态氮的施氏
假单胞菌(Pseudomonas stutzeri) YZN-001的方法，它包括下列步骤 (1)从土壤中采集微生物样品放入异养硝化细菌液体培养基中富集1周，在培养
期间适时加入新鲜的异养硝化细菌液体培养基，吸取lmL富集培养液，加入50mL新鲜异养
硝化培养基中，于30°C 、 150r/min摇床中培养48h，检测氨氮的含量； (2)将氨氮降低的样品吸取lmL加入50mL新鲜异养硝化细菌液体培养基中，按步 骤(1)的培养方法重复操作两次，再次检测氨氮的含量； (3)将氨氮降低明显的样品分别稀释104、105、106，吸取0. lmL样品稀释液于异养
硝化固体培养基上涂布分离，3(TC培养72h，挑取单菌落，作为初筛菌； (4)将初筛菌株接种于新鲜异养硝化细菌液体培养基中，3(TC、150r/min摇床培
养72h，进行复筛； (5)将复筛得到的氨氮降低明显的菌落划线接种在异养硝化细菌固体培养基表 面，挑出单菌落纯化两次，得到能去除水体中氨态氮、硝态氮和亚硝态氮的施氏假单胞菌 (Pseudomonas stutzeri)YZN-001 ;
其中 异养硝化细菌液体培养基的组分配比为(NH4)2S040. 5g，琥珀酸钠5. 95g，维氏盐 溶液50mL，加水溶解补充至1L，调pH至7. 5 8. 0， 12rC湿热灭菌30分钟；
异养硝化细菌固体培养基的组分配比为(NH》^(^0.5g，琥珀酸钠5.95g，维氏盐 溶液50mL，琼脂2%，加水溶解补充至1L，调pH至7. 5 8. 0， 12rC湿热灭菌30min ;
维氏盐溶液的组分及其配比:K2HP04 5. 0g， MgS04 7H20 2. 5g， NaCl 2. 5g， FeS04 7H20 0. 05g， MnS04 4H20 0. 05g，溶解后加水定容至1L， 12TC湿热灭菌30min。
以下对本发明作进一步的描述 本发明所用的菌株分离筛选方法、降解力测定方法及所分离筛选得到的菌株的特 性如下 —、菌株分离筛选、降解力测定及相关培养基的制备
异养硝化细菌液体培养基组分配比(NH4)2S04 0. 5g，琥珀酸钠5. 95g，维氏盐溶液 50mL，加水溶解补充至1L，调pH至7. 5 8. 0 (固体培养基，加入2%琼脂)，12rC湿热灭菌 30分钟。 维氏盐溶液组分及配比K2HP04 5. Og， MgS04 7H20 2. 5g， NaCl 2. 5g， FeS04 7H20 0. 05g， MnS04 4H20 0. 05g，溶解后加水定容至1L。
二、施氏假单胞菌YZN-001株的分离和筛选 (1)从土壤中采集的样品放入异养硝化细菌液体培养基富集1周，期间适时加入 新鲜的异养硝化细菌液体培养基(配方同前)，吸取lmL富集培养液，加入50mL新鲜异养硝 化液体培养基中，3(TC、150r/min摇床培养48h。 (2)检测氨氮量将氨氮降低的样品重复步骤(1)的方法两次，然后将氨氮降低较 明显的样品分别稀释104、105、106，吸取0. lmL稀释液于异养硝化固体培养基上涂布分离， 3(TC培养72h，挑取单菌落，作为初筛菌。将初筛菌接种于新鲜异养硝化细菌液体培养基中， 3(TC、150r/min摇床培养72h，进行复筛。将氨氮降低最明显的菌落划线接种在异养硝化固 体培养基表面，挑出单菌落纯化两次，即得到所筛选菌株YZN-OOl。 将本发明筛选的菌株YZN-OOl的16S rDNA序列用通用引物(上游引物27F: 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';下游引物1492R :5' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')进行扩 增，并按常用的细菌16S rDNA测序方法检测(Alfreider A， Peters S， Tebbe CC， Rangger A， Insam H. Microbial communitydynamics during composting of organic matter as determined by 16S ribosomal DNA analysis. CompostSci Util. 2002， 303-312)，得到该 菌株的16S rDNA序列，扩增菌株的16S rDNA片段序列如序列表SEQ IDNO :1所示。
将上述SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列提交给NCBI网站，获得登录号为FJ 869912，将其进行BLAST序列比对，发现其与多株施氏假单胞菌的序列同源性达到99% ，经 鉴定，确定本发明分离的菌株为一株施氏假单胞菌，其分类命名为Pseudomonas stutzeri YZN-OOl。 三、施氏假单胞菌菌株YZN-001的生物学特性 施氏假单胞菌菌株YZN-001株为革兰氏阴性菌，杆状，菌落淡黄色；接触酶、氧化 酶、产氨、淀粉水解及硝酸盐还原试验为阳性，甲基红、V. P、硫化氢、明胶液化、精氨酸脱羧、 赖氨酸脱羧、尿素水解及柠檬酸盐实验阳性，可以在6.5XNaCl固体培养基生长，葡萄糖、
蔗糖、木糖、乳糖、麦芽糖及甘露醇发酵产酸不产气，生长温度范围4-45t:，最适生长温度范
围25-37 。C。 四、菌株YZN-001对氨氮的降解性能及测试方法
1、对氨氮的降解和利用 (1)降解力测定将施氏假单胞菌YZN-001接种于异养硝化细菌培养基，经24h活 化后，接种于氨氮浓度约100mg/L的液体培养基，定时取样离心，测定上清液420nm处的吸 光值，对照标准曲线确定氨氮的降解率。 (2)不同温度下对氨氮的降解情况将经过24h活化后的施氏假单胞菌YZN-001
菌悬液按1^的接种量接入异养硝化细菌培养液，分别放在4t:，i(rc，2(rc，3(rc及37t:条
件下培养，定时取样离心后取上清液，于420nm处测定氨氮的量，确定不同温度下，施氏假 单胞菌YZN-001对氨氮的降解能力。
(3)对氨氮的降解和利用特性施氏假单胞菌YZN-001对氨氮降解的温度范围 为4-45°C，在4t:条件下，经过20d的培养，氨氮降解率达到90%以上，在最适温度范围 (20-37°C )，菌株YZN-001能在24h内将约100mg/L的氨氮降解95% 。同时测定培养液上 清液中的硝态氮和亚硝态氮，基本上没有这两种中间产物产生。
2 、对硝态氮和亚硝态氮的降解和利用 (1)对硝态氮和氨氮降解力测定分别用硝酸钾和亚硝酸钠代替异养硝化培养液 中的硫酸铵，使C/N比为10，灭菌后，接入经24h活化的施氏假单胞菌YZN-OOl，接种量3% ， 每隔一定时间取样，离心后取上清液于220nm和275nm处测定硝态氮的含量，于540nm处测 定亚硝态氮的含量，对照标准曲线确定硝态氮和亚硝态氮的降解率。 (2)降解情况施氏假单胞菌YZN-001可在以硝酸钾和亚硝酸钠为氮源的培养基 中生长。经过24h培养，可将初始浓度为282. 84mg/L的硝态氮和197. 82mg/L的亚硝态氮 分别降解为7. 76mg/L与Omg/L，降解率分别为97. 26%和100% 。在二者降解过程中均没有 检测到氨氮的积累，以硝态氮为氮源时，亚硝态氮的积累量最多只有0. 39mg/L。
五、施氏假单胞菌YZN-001的安全性测定 将施氏假单胞菌YZN-001转接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，24h离心去掉上清 液，用经过充分曝气的自来水将菌体稀释到6Xl(fcfu/mL，用来喂养生长15d的白鲢仔鱼， 开始16h连续观察，16h后每隔24h观察一次，详细记录鱼的健康和死亡情况，确定施氏假单 胞菌YZN-001的安全性。 六、施氏假单胞菌YZN-001对污水的处理能力测定 于生活污水和养殖废水中加入适量外加碳源柠檬酸钠，将经24h活化的施氏假单 胞菌YZN-001按5X的接种量接入废水中，室温(18-25°C)培养72h测定水体中氨氮的量， 结果显示施氏假单胞菌YZN-001对两种污水的去除率分别为83. 10%和61. 38%。
更详细的技术方案见《具体实施方式
》所述。
序列表SEQ ID NO :1是本发明制备的施氏假单胞菌16SrDNA序列；序列表SEQ ID NO :3和3是扩增施氏假单胞菌16SrDNA序列的引物。 图1 :是本发明筛选的施氏假单胞菌YZN-001对氨氮的降解曲线。图中纵坐标为
氨氮，硝态氮，亚硝态氮浓度及0D6。。的值，横坐标为不同时间观察。 图2 :是本发明的假单胞菌YZN-001在20，30和37。C下对氨氮的降解曲线。图中 纵坐标为不同温度下氨氮的浓度，纵坐标为不同时间。 图3 :是本发明的假单胞菌YZN-001在l(TC下对氨氮的降解曲线。图中纵坐标为 氨氮的浓度，纵坐标为不同时间。 图4 :是本发明的假单胞菌YZN-001在4°C下对氨氮的降解曲线。图中纵坐标为氨 氮的浓度，纵坐标为不同时间。 图5 :是本发明的假单胞菌YZN-001对硝态氮的降解曲线。图中纵坐标为氨氮，硝 态氮，亚硝态氮浓度及0D6。。的值，横坐标为不同的时间。 图6 :是本发明的假单胞菌YZN-001对亚硝态氮的降解曲线。图中纵坐标为氨氮， 硝态氮，亚硝态氮浓度及0D6。。的值，横坐标为不同的时间。
具体实施例方式
实施例1、假单胞菌YZN-001菌株的分离、筛选与鉴定
—、菌株的分离筛选 1、培养基制备分离筛选用异养硝化细菌液体培养基组分及配比(NH4)2S040. 5g， 琥珀酸钠7. 12g，维氏盐溶液50mL，加水溶解并补充水分至1L，调培养基的pH值7. 5 8. 0 (异养硝化细菌固体培养基组分及配比同异养硝化细菌液体培养基，只是在该培养基中 添加2%重量的琼脂)，域12rC湿热灭菌30min。 其中维氏盐溶液组分及配比:K2HP04 5. 0g， MgS04 7H20 2. 5g， NaCl 2. 5g， FeS04 7H20 0. 05g， MnS04 4H20，0. 05g，溶解后加水定容至1L，于121"C下湿热灭菌30分钟。 2、菌株的选择性筛选和驯化从湖北省武汉市华中农业大学种猪场粪池排污口采 集污泥10g，加入内装lOOmL异养硝化液体培养基(配方见前述《发明内容》)三角瓶中富 集培养一周，期间实时加入新鲜的异养硝化液体培养液。吸取lmL富集培养液，加入50mL 新鲜异养硝化液体培养基中，30°C 、 150r/min摇床培养48h，检测氨氮量，将氨氮降低的样 品重复以上操作两次。然后将氨氮降低较明显而硝态氮和亚硝态氮积累少的样品分别稀释 104、105、106，吸取0. lmL稀释液于异养硝化固体培养基上涂布分离，3(TC培养72h，挑取单 菌落，作为初筛菌。将初筛菌接种于新鲜液体培养基中，30°C 、 150r/min摇床培养72h，进行 复筛。将氨氮降低最明显的菌落划线接种在异养硝化固体培养基表面，挑出单菌落纯化两 次，即得到所筛选菌株。
二、细菌菌株的鉴定 结合菌株的形态学特征、培养特征、生理生化特征及16S rDNA基因片段分析，参考 《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)、《常见细菌系统鉴定手册》、《微生物实验技术教程》和《污 染控制微生物工程》等文献，将细菌鉴定到种。鉴定本发明的菌株YZN-OOl为施氏假单胞菌 (Pseudomonas stutzeri)。 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YZN-001的保藏培养基为牛肉膏蛋白胨培 养基牛肉膏5. Og，蛋白胨10. Og， NaCl 5. Og，水1000mL，琼脂20g，调pH7. 2-7. 4。
分析、比较表明，施氏假单胞菌YZN-001菌株是一株在净化水质方面具有应用价 值的细菌，特别是能迅速降解氨氮、硝态氮和亚硝态氮。图1，图5和图6表示的是施氏假单 胞菌YZN-001菌株对氨氮，硝态氮和亚硝态氮的降解曲线图，在适宜的温度和通气条件下， 经过24h培养，施氏假单胞菌YZN-001对三者的降解率分别为95. 57% ， 97. 26%和100% 。
实施例2 :施氏假单胞菌YZN-001对氨氮的降解试验 降解实验培养基配方(NH4)2S04 0. 5g，琥珀酸钠5.95g，维氏盐溶液50mL，加水 溶解补充至1L， pH 7. 5 8. 0。维氏盐溶液:K2HP04 5. Og， MgS04 7H20 2. 5g， NaCl 2. 5g， FeS04 7H20 0. 05g， MnS04 4H20，0. 05g，溶解后加水定容至1L。将该培养液装入250mL三 角瓶，每瓶100mL， 121。C湿热灭菌30min。按1 %的接种量，接入经过24小时活化的YZN-001 菌株菌悬液，30°C 、 150r/min摇床培养36h，每隔6小时取样，10000r/min离心5min后测定 上清液在420nm处的吸光值，对照标准曲线计算出不同时间培养液中的氨氮含量，测定菌 株YZN-001对氨氮的降解率。
在上述条件下，菌株施氏假单胞菌YZN-001菌株可降解1000mg/L的氨氮，降解 的最适温度范围为25-37°C。在3(TC时，经过18h的培养，菌株YZN-001将初始浓度为 107. 02mg/L的氨氮降解为4. 16mg/L，降解率为96. 12%。典型的降解曲线见图1所示。同 时测定培养液中的硝态氮和亚硝态氮没有发现这两种物质产生，施氏假单胞菌YZN-001菌 株在对氨氮的降解过程中不积累硝酸盐和亚硝酸盐。 实施例3、施氏假单胞菌菌株YZN-001对硝态氮和亚硝态氮的降解试验
1、对硝态氮的降解 降解所用培养基配方为(以体积为IL计)KN03 2g，琥珀酸钠18. 7g，维氏盐溶液 50mL，加水溶解补充至1L，调pH至7. 5 8. 0， 121"C湿热灭菌30min。维氏盐溶液:K2HP04 5. 0g， MgS04 7H20 2. 5g， NaCl 2. 5g， FeS04 7H20 0. 05g， MnS04 4H20， 0. 05g，溶解后加水定 容至1L。将该培养液装入250mL三角瓶，每瓶lOOmL， 121。C湿热灭菌30分钟。按3%的接 种量接入经过24小时活化的YZN-001菌株菌悬液，30°C 、 150r/min摇床培养36h，每隔6小 时取样，10000r/min离心5min后测定上清液在220nm和275nm处的吸光值，对照标准曲线 计算出不同时间培养液中的硝态氮含量，测定施氏假单胞菌YZN-OOl菌株1对硝酸根氮的 降解率。 在上述培养条件下，施氏假单胞菌YZN-001菌株对硝酸根氮有很好的降解作用， 30°C 、 150r/min培养24小时后，施氏假单胞菌YZN-001菌株即将初始浓度为282. 84mg/L的 硝酸根氮降解为7.76mg/L，降解率达到97.26X。具体的降解曲线见图5所示。在测定过 程中同时测定氨氮和亚硝态氮的量，氨氮的积累最多不超过5. 5mg/L，而亚硝态氮的积累量 只有0. 39mg/L，并且最后被彻底降解。
2、对亚硝态氮的降解 降解所用培养基配方(以体积为1升计)NaN02 lg，琥珀酸钠13. 5g，维氏盐溶 液50mL，加水溶解补充至1L，pH 7. 5 8. 0。维氏盐溶液K2HP04 5. 0g， MgS04 7H20 2. 5g， NaCl 2. 5g， FeS04 7H20 0. 05g， MnS04 4H20，0. 05g，溶解后加水定容至1L。将该培养液装 入250mL三角瓶，每瓶lOOmL， 12rC湿热灭菌30分钟。按体积为3%的接种量接入经过24 小时活化的施氏假单胞菌YZN-001菌株菌悬液，3(TC、150r/min摇床培养36h，每隔6h取 样，10000r/min离心5min后测定上清液在540nm处的吸光值，对照标准曲线计算出不同时 间培养液中的亚硝态氮含量，测定施氏假单胞菌YZN-001菌株1对亚硝酸根氮的降解率。
本发明的施氏假单胞菌YZN-001对亚硝态氮也有很好的降解作用，3(TC、150r/ min培养18h后，YZN-001菌株即将初始浓度为197. 82mg/L的亚硝酸根氮降解为0，降解率 达到100%。具体的降解曲线见图6所示。在测定过程中同时测定氨氮和硝态氮的量，氨氮 的积累最多不超过4. 5mg/L，在初始时间内检测到有硝态氮的积累，这可能是由于亚硝酸钠 在放置过程被氧化为硝态氮的缘故，但是随着培养时间的延长，硝态氮与亚硝态一样基本 被降解完全。 实施例4、施氏假单胞菌YZN-001的安全性测定 试验用鱼苗为白鲢，来自湖北省荆州市中国水产科学研究院长江水产研究所，鱼 龄为15d，体长lcm左右。取容积为10L的白色塑料盆，放入经曝气3d以上的自来水6L，水 温保持在23士rC，pH6. 8 7. 5。于每个塑料盆中放入40条左右的白鲢仔鱼，每天喂养从 池塘里打捞的轮虫，上午九点与下午四点各一次。暂养两天后，待仔鱼对环境已经适应良好，调整缸中鱼的数目，使每缸中鱼苗均为35条。 菌株为本发明分离的施氏假单胞菌YZN-001菌株，菌悬液的制备用牛肉膏蛋白胨 培养基，其具体配方为牛肉膏5g，蛋白胨10g， NaCl 5g， pH7. 2，加水定容道1L。取250mL 的三角瓶，每瓶装入lOOmL的牛肉膏蛋白胨培养基，按1X的接种量接种经活化的YZN-001 菌悬液，培养24h后，6000r/min离心5分钟，倒掉上清液用充分曝气的自来水将实验菌株 做成菌悬液，体积100mL，浓度6X108cfu/mL左右，每株菌设三个平行。将细菌菌悬液接入 塑料盆，使水样含菌体的终浓度为1X107cfu/mL;另设CK组不加实验菌作为空白对照。试 验时间一周，前16h作连续观察，16h后每隔24h观察一次，详细记录鱼的健康和死亡情况。 经观察发现YZN-001与对照组没有明显的差异，表明其对白鲢仔鱼没有毒害作用，从而说 明对白鲢成鱼也没有毒害作用，可以作为有益菌在水循环中应用。具体结果见表1。
表1本发明分离的施氏假单胞菌YZN-001对白鲢仔鱼安全性实验
菌株编号 实验鱼尾数
不同时间鱼的存活情况 ld 2d 3d 4d 5d 6d 7d
积累存活率(％) 与对照组差异
3535353535353535100
CK (对照)353535353433333394. 28
353535353535343497.14
353535353434333394. 28
YZN-0013535353535353535扁
353535343434343291.43
不显著 实施例5、施氏假单胞菌YZN-001对生活污水和养殖废水氨氮的去除能力测定
试验所用生活污水取之武汉南湖排污口，测定其氨氮浓度为67. 16mg/L， p朋.0-6. 8 ;养殖废水取之华中农业大学猪场排污口，氨氮浓度为175. 38mg/L， p朋.5_7. 0。
将取得的生活污水和养殖废水按以下处理分组第一组，不加柠檬酸钠也不加分 离菌株作为空白对照；第二组，加柠檬酸钠，不加分离菌株；第三组，不加柠檬酸钠，但是加 入分离菌株；第四组，即加柠檬酸钠，也加入分离菌株。250mL三角瓶中装入100mL污水，接 种量5%，每组处理3个重复。 菌株YZN-001单独加入污水的脱氮效果不是很理想，但当同时加入外加碳源柠檬 酸钠后，脱氮效果明显增强，72h室温培养，能将氨氮浓度分别为67. 16mg/L和175. 38mg/ L的生活污水和养殖废水分别降至11. 35mg/L和67. 38mg/L，降解率分别为83. 10 %和 61. 38%，菌株YZN-001对生活污水和养殖废水的去除效果见表2和表3。
表2施氏假单胞菌YZN-001对生活污水处理效果
9处理氨氮浓度(mg/L) 0h 72 h去除率(％)
污水67. 16±L 1265. 39 ±0. 382. 63
污水+柠檬酸钠67. 16±1.1263. 17±3. 135. 94
污水+YZN-00167. 16±1.1259. 74±0. 3811.04
污水+柠檬酸钠
67. 16±1. 1211.35±3. 1383. 10
+YZN-001 表3施氏假单胞菌YZN-001对养殖废水处理效果
氨氮浓度(mg/L)去除率(％)
处理
0 h 72 h
污水175. 38±4. 66173. 41 ±5.191. 12
污水+拧檬酸钠175. 38 ±4. 66167. 90±4. 304. 26
污水+YZN-001175. 38±4. 66151.15±6.6713.81
污水+柠檬酸钠
175. 38土4. 6667. 38±2. 0561.58
+YZN-001 序列表 〈110〉华中农业大学 〈120〉去除水体中氨态氮、硝态氮和亚硝态氮的施氏假单胞菌YZN-001及应用 〈130〉 〈141>2009-12-03 〈160>3 〈170〉Patentln version 3. 1 〈210>1 〈211>1481 〈212>DNA 〈213〉施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri) 〈220〉 〈221〉gene 〈222〉 (1) (1481) 〈223〉 〈400>1 aggttcaact ctgcgcggtc teccatgtca gtcgagcgga tgagtggagc ttgctccatg 60
attcagcggcgg3Cgggtg3gtaatgccta ggaatctgcc tggtagtggg ggacaacgtt120tcg朋3gg朋cgctaataccgcatacgtcc tacgggagaa agtgggggat cttcggacct180cacgctatcagatgagccteggtcggatta gctagttggt gaggteaagg ctcaccaagg240cgacgatccgteactggtctg3g3ggatg3 tC3gtC3C3C tgg朋Ctg3g 3C3CggtCC3300gactcctecggg￡lggC￡lgC￡lgtggggaata ttggacaatg ggcgaaagcc tgatccagcc360atgccgcgtgtgtg3卿3ggtcttcggat tgtaaagcac tttaagttgg gaggaagggc420teccttgctgttttgacgtt accaacagaa taagcaccgg ctaacttcgt480gccagcagccgcggt朋tecgaagggtgca agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc540gcgcgtaggtggttcgttaagttggatgtg aaagccccgg gctcaacctg ggaactgcat600cc朋朋ctggcgagctegagtetggcagag ggtggtggaa tttcctgtgt agcggtgaaa660tgcgtegatetegg朋gg朋caccagtggc g朋ggcgacc acctgggcte atectgac3c720tgaggtgcga朋gcgtgggg3gc朋3C3gg attegatecc ctggtegtcc acgccgte朋780cgatgtcgactegccgttgggatccttgag atcttegtgg cgcagctaac gcatteagtc840gaccgcctggggagtecggccgc朋ggtte 3朋ctca朋t g朋ttgacgg gggcccgcac■朋gCggtggElgtggagcatgtggttteatt cg朋gc朋cg cg朋g朋cct teccaggcct960tgacatgcagagaactttccagagatggat tggtgccttc gggaactctg acacaggtgc1020tgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgte acgagcgcaa1080cccttgtccttagttaccagcacgtteagg tgggcactct aaggagactg ccggtgacaa11403CCgg3gg朋ggtggggEltgacgtcaagtc atcatggccc ttecggcctg ggctacacac1200gtgctecaatggtcggt織朋gggttgcc朋gccgcgag gtggagctea tcccate朋31260ccgatcgtegtccggatcgcagtctgc朋c tcgactgcgt g朋gtcgg朋tcgctegt朋1320tcgtgaatcag朋tgtcacggtgaatecgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca1380ccatgggagtgggttgctccagaagtegct agtcteacct tcggggggac ggttaccacg1440gagtgattcatgactggggtg朋gtcgt朋c朋gaggccc g1481〈210>2〈211>20〈212>DNA〈213>施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)〈220〉〈221>primer_bind〈222〉 (1) (20)〈223〉〈400>2agagtttgatcctggctcag20〈210>3〈211>20〈212>DNA〈213>施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)〈220〉
11
〈221>primer_bind 〈222>(1). . (20) 〈223〉 <400>3 aaggaggtga tccagccgca
权利要求
一种能去除水体中的氨态氮、硝态氮和亚硝态氮的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YZN-001，其特征是，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NOM 209107。
2. —种筛选能去除水体中的氨态氮、硝态氮和亚硝态氮的施氏假单胞菌 (Pseudomonasstutzeri) YZN-001 ，它包括下列步骤(1) 从土壤中采集微生物样品放入异养硝化细菌液体培养基中富集培养1周，在培养 期间适时加入新鲜的异养硝化细菌液体培养基，吸取lmL富集培养液，加入50mL新鲜异养 硝化细菌液体培养基中，于3(TC下，150r/min摇床培养48h，检测氨氮的含量；(2) 将氨态氮降低的样品吸取lmL加入50mL新鲜异养硝化细菌液体培养基中，按步骤 (1)的培养方法重复操作两次，再次检测氨态氮的含量；(3) 将氨态氮降低明显的样品分别稀释104、105、106，吸取0. lmL样品稀释液于异养硝 化固体培养基上涂布分离，于3(TC下培养72h，挑取单菌落，作为初筛菌株；(4) 将初筛菌株接种于新鲜异养硝化细菌液体培养基中，于3(TC下，150r/min摇床培 养72h，进行复筛；(5) 将复筛得到的氨氮降低明显的菌落划线接种于异养硝化细菌固体培养基表面，挑 出单菌落纯化两次，得到保藏号为CCTCC N0:M 209107的能去除水体中氨态氮、硝态氮和 亚硝态氮的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri) YZN-001 ;其中所述异养硝化细菌液体培养基的组分配比为(NH4)2S04 0. 5g，琥珀酸钠5. 95g，维氏盐 溶液50mL，加水溶解并补充至1L，调培养基的pH至7. 5 8. 0 ;异养硝化细菌固体培养基的组分配比为(NH4)2S04 0. 5g，琥珀酸钠5.95g，维氏盐溶液 50ml，琼脂2X，加水溶解并补充至1L，调培养基的pH至7. 5 0 ;维氏盐溶液的组分及其配比K2HP04 5. 0g， MgS04 7H20 2. 5g， NaCl 2. 5g， FeS04 7H20 0. 05g， MnS04 4H20 0. 05g，溶解后加水定容至1L。
3. 权利要求1所述的微生物在去除水体中氨态氮、硝态氮和亚硝态氮中的应用。
全文摘要
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一株对氨态氮、硝态氮及亚硝态氮具有降解作用的施氏假单胞菌YZN-001的分离筛选及应用。本发明筛选的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YZN-001已保藏在中国典型培养物保藏中心(保藏号为CCTCC NOM 209107)。该菌株能在20～37℃范围内有效降解水体中氨态氮、硝态氮及亚硝态氮，对鲢鱼没有毒害作用，在常温下对污水中的氨态氮有很好的降解作用，接种本发明的微生物后，72h对生活污水和养殖废水中氨态氮的降解率分别达到83.10％和61.38％。
文档编号C12R1/38GK101705202SQ20091027304
公开日2010年5月12日 申请日期2009年12月3日 优先权日2009年12月3日
发明者何进, 刘子铎, 吴鹏霞, 喻子牛, 孙明, 张吉斌, 郝勃 申请人:华中农业大学