专利名称：棉花纤维特异表达的水孔蛋白家族基因GhPIP2;6的制作方法
技术领域：
本发明涉及棉花基因，具体是水孔蛋白(Aquaporin，AQP)家族的棉花新基因 GhPIP2 ；6的cDNA和基因组DNA全长序列的克隆鉴定及其编码蛋白的活性检测；并研究它 们在棉纤维发育过程中的表达及功能，进而应用于棉纤维品质改良。
背景技术：
水是植物所有活细胞的重要组成成分，对水分吸收和运输的严格调控是植物生长 和发育的基础。在植物体内水分的运输有3种途径质外体途径、共质体途径和跨膜运输 途径。跨膜运输途径是指水分跨过液泡膜和质膜的运输。水分的跨膜运输又可以分为两种 方式，1)通过磷脂双分子层的自由扩散运输；2)通过膜上的通道蛋白进行的被动运输。生 物膜上运输水分的通道蛋白统称为水孔蛋白(Aquaporin，AQP)。第一个水孔蛋白AQPl是 Agre研究小组在1988年从人红细胞质膜上分离出来的，随后，在植物、动物、酵母和细菌中 都发现有许多类似的运输水分的通道蛋白。水孔蛋白与1984年Gorin等从牛晶体纤维细胞膜中分离到的MIP蛋白(Major intrinsicprotein)具有很高的序列同源性和结构相似性，因此将它们同归于MIP家族， 分子质量在26 34kDa之间。水孔蛋白具有MIP家族结构的典型特征，序列亲水性分析 表明，水孔蛋白具有由5个短环(IoopA IoopE)相连的6个跨膜α -螺旋(Hl Η6)及 N末端和C末端。B环、D环、N末端和C末端始终面向细胞质这一侧，而A环、C环和E环 则位于另一侧。相对而言，水孔蛋白的N末端和C末端具有较大的可变性，而绝大多数水 孔蛋白的B环和E环上都存在一个高度保守的氨基酸序列天冬酰胺_脯氨酸_丙氨酸 (aspargine-proline-alanine, NPA)，被称之为NPA基序，这两个NPA基序直接参与了水通 道的形成。对于水孔蛋白的二级拓扑结构，人们提出了几种假设，其中被普遍接受并被证实 的是Jung等提出的“水漏模型”(Hourglass model)。在此模型中，B环E环各自形成半个 跨膜螺旋(HB和HE)，分别从膜的两侧折向膜内形成第七个跨膜螺旋，2个NPA基序位于该 螺旋的中心，与其它6个跨膜螺旋共同作用，形成一个可双向运输水分子的孔道。植物中水孔蛋白数目较多。例如，拟南芥中有35个，玉米和水稻中各有33个 水孔蛋白。根据其序列同源性，植物水孔蛋白可以分为4类质膜内在蛋白(Plasma membraneIntrinsic Proteins，PIP)，液泡月莫内在蛋白(Tonoplast Intrinsic Proteins, TIP)，类 N0D26 内在蛋白(Nodul in26-l ike Intrinsic Proteins，NIP)，小的碱性内在蛋白 (Small basic IntrinsicProteins, SIP) 0其中，质膜内在蛋白根据其序列同源性和活性 差异，又可分为PIPl和PIP2两个亚类，在爪蟾卵母细胞或酵母细胞中表达，大多数PIPl蛋 白的活性较低或没有活性，而PIP2蛋白的活性则明显高于PIPl蛋白。已有研究表明，4类 水孔蛋白均具有转运水分子的功能，同时还能转运一些小的中性分子，如C02、H202、尿素、硼 酸、硅酸等。它们参与了一系列重要的生理过程(例如，水分的吸收和运输、种子的成熟与 萌发、花粉的开裂和萌发、细胞伸长、逆境应答等)，在植物生长发育繁殖及逆境应答等过程 中都起着非常重要的作用。目前在棉花中仅报道了 8个水孔蛋白基因，大多在根中优势表达，参与水分的吸收和植物逆境应答反应，其它在胚珠中特异表达(GhAQPl)和纤维中优势 表达(GhPIPl-2和Gh γ TIP1)，但其功能和调控机制尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供一个在棉纤维中特异表达的水孔蛋白家族新基因GhPIP2 ； 6，分析其蛋白活性及其在酵母细胞中表达对宿主细胞形态的影响，以研究其功能，为解析 纤维细胞伸长的分子机制，改良棉纤维的品质提供新的理论基础。我们构建了棉花纤维的cDNA文库，从文库中随机挑出4000个cDNA克隆，经测序 和比较分析发现其中一些克隆含有水孔蛋白基因(GhPIP)的部分序列。用a-P32PP-dCTP标 记GhPIP cDNA 3，-末端片段(0. 4kb)，以此为探针，筛选纤维cDNA文库，得到100多个阳 性克隆，经测序证实其中一些克隆含有GhPIP2 ；6基因的全长cDNA序列。GhPIP2 ；6基因的cDNA全长为1012bp，其开放阅读框为837bp，编码278个氨基酸， 蛋白分子量约为29. BkDa0经比较发现，GhPIP2 ；6蛋白具有水孔蛋白的典型结构和保守序 列，含有5个短环连接的6个α-跨膜螺旋和两个高度保守的“NPA”基序(图1)。与已知 的拟南芥和棉花水孔蛋白序列相比较，GhPIP2 ；6与PIP2类蛋白的同源性较高(序列相似 性76 94% )，与PIPl类蛋白的同源性次之，而与其它种类的水孔蛋白序列相似性较低。为获取GhPIP2 ；6基因的基因组DNA全长序列，本申请人在其开放阅读框(ORF)两 端设计一对引物(见表1)，以棉花基因组DNA为模板，在94°C -5min, 1个循环；94°C -lmin, 58°C -lmin,72°C -2min，32个循环的PCR反应条件下得到了一个IOlObp的产物。测序结果 显示该DNA序列为GhPIP2 ；6基因的DNA全长序列，与其cDNA序列比较分析发现该基因含 有两个内含子，长度为89和84bp，第一个内含子插入在编码Gly94密码子内，第二个内含子 插入在编码His239与Trp240的密码子之间(图2)。为验证GhPIP2 ；6基因编码的蛋白是否具有水通道活性，我们利用爪蟾卵母细胞 系统进行检测。先在体外转录合成GhPIP基因带帽结构的cRNA并定量，然后按每个细胞 50ngcRNA进行显微注射。注射后的卵母细胞在孵育液中静置培养2 3天，以使GhPIP2 蛋白在细胞内充分合成并整合到细胞膜上。检测蛋白活性时，将卵母细胞转移至高渗溶液 1/5ND96溶液中后，拍照记录细胞体积的变化。卵母细胞转入1/5ND96溶液后，因细胞内 外的渗透差，水分进入细胞而使其膨胀，体积变大。根据细胞体积变化的速率可计算细胞 膜的水导度，也即是GhPIP2蛋白的活性。如图3A所示，注射GhPIP2 cRNA的细胞快速膨 胀，体积明显增大；而注射水的对照细胞大小基本没有变化。表达GhPIP2蛋白的卵母细胞 转移到1/5 ND96溶液后3分钟内细胞半径变化如表2所示，对照细胞的体积变化很小，半 径差仅约5. 4 μ m，而表达GhPIP2蛋白的卵母细胞膨胀明显，在3min内即使细胞半径增 加了 21. 7 22. 8 μ m。细胞膨胀速率不同，说明细胞膜对水的透性存在差异，即水导度不 同。对照细胞的水导度Pf = 9. 82 士 5. 27μπιΛ(η = 30)，而表达GhPIP2 ；6的细胞水导度为 41. 03 士 8. 07 μ m/s (η = 30)，与对照相比，细胞水导度增加了约4. 2倍(图3Β)。用水孔蛋 白活性抑制剂HgCl2 (50 μ Μ)预处理上述卵母细胞0. 5h，则细胞膨胀速度明显下降(表2)， GhPIP2 ；6的水通道活性显著降低(图3B)。以上结果说明GhPIP2 ；6蛋白具有运输水分的 功能，能提高细胞膜对水的透性。为研究GhPIP2 ；6基因在棉花各组织/器官中的表达模式，用改良的CTAB/酸酚法提取棉花组织/器官的总RNA，分别做实时定量RT-PCR和Northern杂交，结果如图4A和 4B所示。两个实验结果均显示GhPIP2 ；6基因在纤维中特异表达，且Northern杂交结果显 示GhPIP2;6在6 12 DPA纤维中的表达量有明显差异。因此，我们又采集并提取了 3 20 DPA的纤维的总RNA，对这个基因在纤维发育过程中的表达情况作进一步详细的分析，实 时定量RT-PCR结果如图4C所示。GhPIP2 ；6在纤维发育过程中的表达模式基本一致，其转 录产物主要集中在3 12 DPA纤维中，在9 DPA纤维中表达量最高，在15 20 DPA纤维 中，表达量急剧下降到很低的水平。GhPIP2 ；6mRNA在伸长期的棉纤维中大量积累，表明这些基因产物在纤维细胞伸 长过程中可能起重要作用。为进一步研究GhPIP2基因(蛋白)的功能，GhPIP2;6基因的 编码序列(ORF)被重组到酵母表达载体PREP-5N质粒中，随后用重组质粒转化裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)细胞。在 pREP 质粒中，GhPIP2 ；6 的表达受到 nmt-Ι 启动 子的调控。nmt-Ι启动子的活性受外源VB1的抑制，即当培养基中缺乏VB1 (诱导培养基) 时，启动下游基因的表达，而当培养基中存在VB1时(非诱导培养基)，启动子下游基因不表 达。对包含pREP-GhPIP2 ；6质粒的酵母在诱导或非诱导培养基中培养一段时间后的细胞形 态进行观察分析，实验结果如图6和表3所示。对照酵母细胞(包含PREP-5N空质粒)无 论在非诱导还是在诱导培养基中，形态基本没有差异(图5a和5b)。GhPIP2 ；6转基因酵母 (包含pREP-GhPIP2 ；6质粒)在非诱导培养基中形态与对照类似(图5c)，而在诱导培养基 中细胞长度显著比在非诱导条件下长得多(图5d)。从转基因酵母中随机选取5个细胞系 进行培养，测量其在非诱导和诱导条件下的细胞长度，统计分析结果显示GhPIP2 ；6转基因 酵母在诱导条件下与在非诱导条件下的细胞长度有显著的差异，对照细胞在两种条件下长 度没有明显的差异(如表3所示)。GhPIP2 ；6的表达可使细胞伸长1. 30 1. 47倍。以上 实验结果表明，GhPIP2 ；6基因在裂殖酵母中异源表达可以显著改变细胞的形态，促使细胞 纵向伸长。HgCl2是水孔蛋白活性抑制剂，它能阻断水孔蛋白介导的水分运输。为研究水孔 蛋白是否在纤维发育过程中起重要作用，本申请人用低浓度的HgCl2 (O 50 μ M)短时间 (0. 5 2h)处理开花后1天的棉花离体胚珠，再在正常条件下培养10 12天，结果发现纤 维长度显著下降，经过HgCl2处理的纤维其长度是对照的52. 4 69. 7% (图6)，这表明水 孔蛋白参与了纤维的发育尤其是纤维的伸长。本发明的优点1、提供了一个棉花新基因GhPIP2 ；6的全长cDNA序列及其编码的蛋白质序列，并 通过非洲爪蟾卵母细胞系统检测了蛋白活性，发现这个基因的编码蛋白具有强的水通道活 性，证明它们属于水孔蛋白家族。2、提供了 GhPIP2 ；6基因的全长DNA序列，该基因由三个外显子和两个内含子组 成。3、GhPIP2 ；6的转录产物在处于伸长期的棉纤维细胞中大量积累，而且GhPIP2 ；6 基因的表达能显著促使酵母细胞纵向伸长，水孔蛋白活性抑制剂HgCl2能显著抑制纤维的 伸长，这些实验结果表明GhPIP2 ；6参与了棉纤维的发育，在纤维伸长过程中起重要作用。本发明通过以下附图和实施进行进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
图l.GhPIP2 ；6蛋白结构分析及与棉花已知PIP蛋白的序列比较。图中黑色阴影中的字母表示GhPIPl和GhPIP2中可替换的氨基酸残基，灰色阴影 中的表示GhPIPl与GhPIP2两类白中的差异氨基酸残基。6个方框所在的区域指六个跨膜 螺旋(Hl H6)，加粗的字母则表示MIP家族的典型序列。箭头所指的位置是GhPIP2;6基 因的内含子插入的位置。已知棉花PIP蛋白在GenBank内的Accession号码如下=GhPIPl ； 1 (ABK60194) ；GhPIPl-2(ABR68794) ；GhPIPl ；3 (ABD63904) ；GhPIP2 ； 1 (ABK60195)； GhPIP2 ；2(ABK60195) ；GhPIP2 ;3 (ACB42440) ；GhPIP2 ；4 (ACB42441)。图2. GhPIP2 ；6的基因结构。黑色方框表示外显子，线段表示5’ -和3’ -端非编码区及内含子。线段下的数字 指内含子的大小，而线段上的氨基酸及数字指内含子在基因中插入的位点。ATG，起始密码 子；TGA和TAA，终止密码子。图3. GhPIP2 ；6蛋白活性分析。A、表达GhPIP2蛋白的爪蟾卵母细胞转移到高渗溶液5分钟前后体积变化；B、表达GhPIP2蛋白的卵母细胞的质膜水导度及HgCl2对GhPIP2蛋白活性的抑制。 GhPIP2 ；6 cRNA的爪蟾卵母细胞在转移到1/5 ND96高渗溶液之前，先转移到含50 μ mol/L HgCl2的孵育液中预处理30分钟，再检测细胞的水导度。“**”指经过生物统计学分析，注 射了 GhPIP2 cRNA的卵母细胞的水导度与对照有极显著差异(P值<0.01) ；“++”代表经过 HgCl2预处理的细胞水导度与未经处理的细胞水导度有极显著差异(P值< 0. 01)。图4. GhPIP2 ；6基因的表达分析。A、实时荧光定量RT-PCR分析GhPIP2 ；6基因在棉花不同组织/器官中的差异表达 (R，根；C,子叶；L,叶片；H,下胚轴；P,花瓣；A,花药；0，胚珠；F,纤维)；B、Northern杂交分析GhPIP2 ；6基因在棉花各组织/器官中的差异表达(R，根； C，子叶；L，叶；H，下胚轴；P，花瓣；A，花药；0，开花后10天的胚珠；F6 F12，分别指开花后 6，8，10，12 天纤维)；C、实时荧光定量RT-PCR分析GhPIP2 ；6基因在纤维发育过程中的表达(3f 20f， 指开花后3 20天纤维)。图5.过量表达GhPIP2 ；6基因的裂殖酵母细胞形态分析。(a和b)在非诱导(a)或诱导(b)培养基上生长的包含pREP5N空质粒的对照酵母 细胞；(c和d)在非诱导(c)或诱导(d)培养基上生长的包含pREP_GhPIP2 ；6质粒的酵 母细胞。图6. HgCl2显著抑制棉纤维细胞伸长，导致纤维长度变短。a、用含有不同浓度的HgCl2 (0 50 μ Μ)的BT培养基处理开花后1天的棉花离体 胚珠0. 5小时后，再在不含HgCl2的BT培养基中培养12天后的棉花胚珠；b、用含有50 μ M HgCl2的BT培养基处理开花后1天的棉花离体胚珠不同时间后 (0 2小时)，再在不含HgCl2的BT培养基中培养10天后的棉花胚珠；C、经过不同浓度的HgCl2 (0 50 μ Μ)处理0. 5小时后再培养12天的离体胚珠纤 维的长度；
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表3多个不同转GhPIP2 ；6基因的酵母细胞系和对照酵母细胞系的细胞长度统计 分析。d、经过50 μ M的HgCl2处理不同时间(0 2小时)后再培养10天的离体胚珠纤 维的长度。表1 GhPIP2 ；6基因RT-PCR引物及GhPIP2 ；6基因全长DNA序列克隆引物 表2表达GhPIP2蛋白的爪蟾卵母细胞转移到高渗溶液后半径的变化 (1)棉纤维 cDNA 文库的构建(按 Li XB 等，2002，Molecular characterization of the cottonGhTUBl gene that is preferentially expressed in fiber. Plant Physiol 130 666-674中的方法进行)。(2)从棉纤维cDNA文库中随机挑出1000个cDNA克隆，经测序和比较分析发现 其中一些克隆含有水孔蛋白基因(GhPIP)的部分序列。用α-P32PP-dCTP标记GhPIP cDNA 3’ -末端片段(0. 4kb)，以此为探针，筛选纤维cDNA文库中2X IOP5p克隆，得到十多个阳性 克隆，经测序发现其中3个克隆含有GhPIP2 ；6基因的全长cDNA序列。2、GhPIP2 ；6基因的DNA全长序列的克隆在GhPIP2 ；6基因ORF两端设计一对引物(见表1)，以棉花⑶NA为模板，在94°C _5 分钟，1个循环；94°C -1分钟，580C -1分钟，720C _2分钟，32个循环的PCR反应条件下得到 了一个约Ikb的DNA片段，将该片段插入到PBS-T载体中。利用PBS质粒上的T3和T7启 动子对目的DNA片段进行测序。再用DNAstar软件分析所得的序列，与基因cDNA序列进行 比较，分析内含子的大小和插入位置。3、GhPIP2蛋白活性检测(1)爪蟾卵母细胞预处理低温麻醉爪蟾后，手术方式取出适量卵巢的卵页，并缝 合爪蟾下腹部；用镊子将卵页分成小块，再用滴管取至50ml离心管中；用无钙ND96溶液冲 洗数遍后，加入2mg/ml的胶原酶室温消化1小时；弃上清，取出卵母细胞至孵育液中培养备用。(2)显微注射体外转录合成基因的cRNA(按Ambion公司的体外转录试剂盒 mMACHINESP6 Kit的说明书操作)；将cRNA浓度调至1 μ g/μ 1 ；在实体显微镜下，用显微注 射仪向每个卵母细胞注射50nl的cRNA，对照注射50nl的RNase-free水；(3)GhPIP2蛋白合成将注射后的卵母细胞转移至新鲜的ND96溶液中，19°C静置 培养2 3天，GhPIP蛋白即在卵母细胞内合成并整合到卵细胞膜上。(4)卵细胞膜水导度检测将培养2 3天后的卵母细胞转移至1/5ND96溶液 中，在实体显微镜下每隔30秒拍照一次，记录卵母细胞体积的变化。再根据
公式Pf =V。[d(V/VQ)/dt]/[SQXVw(0Smin-0Sm。ut)]，计算细胞膜的水导度，其中，V0 = 9X10_4cm3，S0 = 0. 045cm2, V0, S0为卵母细胞初始体积和表面积；V为变量，指t时刻时卵母细胞的体积；VW =18cm7mol，为水的摩尔体积；Osmin = 220mosm/kg，指细胞内的渗透压，Osmout = 44mosm/ kg，指细胞外的渗透压。4、实时荧光定量RT-PCR(1)棉花各组织总RNA的提取(按蒋建雄、张天真，2003，利用CTAB/酸酚法提取棉 花组织总RNA0棉花学报，15 166-167进行)；(2)逆转录按M-MLV逆转录酶(Promega公司)的使用说明书操作；(3)实时荧光定量PCR:按荧光定量PCR试剂盒(Τ0Υ0Β0)的使用说明书操作。以 棉花持家基因GhUBI作为内参，根据公式Y= 10Δ__5Χ100%计算基因表达的相对值。Ct 是指基因扩增产物最初能被荧光检测到的循环数，ACt是指目的基因与内参基因GhUBI循 环数的差值，即ACt = CtGhUBI-CtGhPIPs。为了得到最佳的实验效果，PCR扩增条件及引 物效率都以目的基因的cDNA为模扳进行优化。该实验中每个组织采集3次样品，分别提取 RNA,每个样品的RNA重复3次实时定量RT-PCR实验，最后统计9次实验结果，计算其平均 值和标准差。5、Northern 杂交总RNA的电泳和转膜及杂交均按《分子克隆》介绍的方法进行(主编，第三版)。 杂交探针的合成是以基因cDNA的3’端约0. 2kb的序列作为杂交探针模板，按随机引物标 记 DNA 试剂盒(Random Primer DNA labeling Kit, Takara)的操作说明进行的。6、酵母转化、培养及形态观察根据分子克隆技术，在GhPIP2 ;6基因开放阅读框(ORF)两端引物加上Nde I 和Sal I酶切位点的回文序列，用于PCR扩增基因ORF片段。用相应的内切酶酶切该目 的DNA片段后，重组到pREP-5N质粒中。酵母转化、培养及形态观察均按Li L等，2007， Molecularcharacterization of cotton GhTUA9 gene specifically expressed in fiber and involved in cell elongation. J Exp Bot，58 :3227_3238 中的方法进行。7、棉花离体胚珠培养及HgCl2处理采集开花后1天的棉铃，用体积浓度70%乙醇表面杀菌1分钟，无菌水冲洗3 4 次后，在无菌条件下，将棉铃中的胚珠剥离出来，置于适量BT培养基中，按比例加入一定量 的无菌ImM HgCl2，静置0. 5 2小时后取出，用BT培养基清洗2次，再置于适量BT培养基 中，30°C，黑暗条件下静置培养10 12天。棉花水孔蛋白家族基因GhPIP2 ；6，其特征在于该基因的全长cDNA核苷酸序列如 下GGGCACGAGT CAAAAAAGCT TCCAACATTT TGAAGAAACA AAGAATCAAA CATGTCGAAG 60GMGTGAGTG MGAAGGGGT GAGCCGAAAG GACTATGTGG ATCCTCCACC GGCACCGCTC 120ATCGACGTGG CTGAGATCAA GCTTTGGTCT TTTTACAGAG CTCTCATCGC CGAATTCATC 180GCTACTCTCC TCTTCCTATA CGTCACCATA GCCACCGTCA TCGGCCACAA GAAACMCAC 240GATGCATGCG ATGGTGTTGG TCTTTTGGGC ATTGCTTGGG CTTTTGGTGG CATGATTTTC 300ATTCTTGTTT ACTGCACCGC CGGTATCTCA GGTGGTCACA TTAACCCGGC GGTGACATTT 360GGGTTGTTTT TGGCTAGGAA GGTGTCGTTA ATAAGGGCGG TGGCTTACAT GGTAGCTCM 420
100071]TGTTTGGGTG CTATTTGTGG TGTTGGGTTA GTTAAGGCAT TCATGAAGAG TGAATACAAC480
0072]TCCCTTGGCG GCGGTGTTAA CACGGTGGCG ACTGGTTATA ACAAAGGGAC TGCTTTGGGA540
0073]GCTGAGATTA TTGGGACATT CGTGCTTGTT TACACTGTTT TTTCAGCTAC TGACCCTAM600
0074]AGAAGTGCCC GTGATTCACA TGTACCCGTG TTGGCTCCAC TTCCTATAGG ATTTGCAGTG660
0075]TTCATGGTTC ATTTGGCTAC TATTCCTATC ACCGGAACTG GTATTAACCC TGCTAGAAGC720
0076]TTCGGCGCCG CCGTTATTTA CAACAACGAC AAGGCTTGGG ATGACCACTG GATATTCTGG780
0077]GTTGGACCAA TGGTGGGAGC ACTTGCGGCG GCGGCATATC ATCAGTACAT CCTTAGAGCG840
0078]GCGGCTATTA AGGCTTTGGG ATCTTTCCGG AGCAACCCCA GCAATTAAAA GCTMAAAGA900
0079]GMGAAMCC ACAATATGTT TGTCTCATTG TGTTTATAAT GTTTCTTCAT TGTTGGTTCC960
0080]TGTGTGTGTA TTGTATTATG ATTGATGATT ATTAATTCAG ACCTTTTTAT TT1012
0081]所述的一个棉花水孔蛋白家族基因GhPIP2 ；6，其特征在于与该基因的第52 888 核苷酸对应的编码氨基酸序列如下
0082]MetSerLysGluValSerGluGluGlyValSerArgLysAspTyrValAsp0083]1510150084]ProProProAlaProLeulieAspValAlaGlulieLysLeuTrpSerPhe0085]2025300086]TyrArgAlaLeulieAlaGluPhelieAlaThrLeuLeuPheLeuTyrVal0087]354045500088]ThrlieAlaThrVallieGlyHisLysLysGlnHisAspAlaCysAspGly0089]5560650090]ValGlyLeuLeuGlylieAlaTrpAlaPheGlyGlyMetliePhelieLeu0091]707580850092]ValTyrCysThrAlaGlylieSerGlyGlyHislieAsnProAlaValThr0093]90951000094]PheGlyLeuPheLeuAlaArgLysValSerLeulieArgAlaValAlaTyr0095]1051101150096]MetValAlaGlnCysLeuGlyAlalieCysGlyValGlyLeuValLysAla0097]1201251301350098]PheMetLysSerGluTyrAsnSerLeuGlyGlyGlyValAsnThrValAla0099]1401451500100]ThrGlyTyrAsnLysGlyThrAlaLeuGlyAlaGlulielieGlyThrPhe0101]1551601651700102]ValLeuValTyrThrValPheSerAlaThrAspProLysArgSerAlaArg0103]1751801850104]AspSerHisValProValLeuAlaProLeuProlieGlyPheAlaValPhe0105]1901952000106]MetValHisLeuAlaThrlieProlieThrGlyThrGlylieAsnProAla0107]2052102152200108]ArgSerPheGlyAlaAlaVallieTyrAsnAsnAspLysAlaTrpAspAsp
225230235His Trp lie Phe Trp Val Gly Pro Met Val Gly Ala Leu Ala Ala Ala Ala240245 250255Tyr His Gln Tyr lie Leu Arg Ala Ala Ala lie Lys Ala Leu Gly Ser Phe260265270Arg Ser Asn Pro Ser Asn275278棉花水孔蛋白家族基因GhPIP2 ；6，其特征在于该基因的基因组DNA全长核苷酸序 列如下(斜体下划线标记的序列为内含子核苷酸序列)ATGTCGAAGG AAGTGAGTGA AGAAGGGGTG AGCCGAAAGG ACTATGTGGA TCCTCCACCG 60GCACCGCTCA TCGACGTGGC TGAGATCAAG CTTTGGTCTT TTTACAGAGC TCTCATCGCC 120GMTTCATCG CTACTCTCCT CTTCCTATAC GTCACCATAG CCACCGTCAT CGGCCACAAG 180AMCAACACG ATGCATGCGA TGGTGTTGGT CTTTTGGGCA TTGCTTGGGC TTTTGGTGGC 240ATGATTTTCA TTCTTGTTTA CTGCACCGCC GGTATCTCAG gtactctccc ccccccaaaa 300
aaaaacagtg acttcattaa tatagccaat tagccatttt tgttgaattt tggttgtttt 360
0123]acgacgcaa GTGGTCACATTMCCCGGCGGTGACATTTGG GTTGTTTTTG GCTAGGAAGG4200124]TGTCGTTAATMGGGCGGTGGCTTACATGGTAGCTCAATGTTTGGGTGCTATTTGTGGTG4800125]TTGGGTTAGTTAAGGCATTCATGAAGAGTGAATACAACTCCCTTGGCGGCGGTGTTAACA5400126]CGGTGGCGACTGGTTATAACMAGGGACTGCTTTGGGAGCTGAGATTATTGGGACATTCG6000127]TGCTTGTTTACACTGTTTTTTCAGCTACTGACCCTAAAAGAAGTGCCCGTGATTCACATG6600128]TACCCGTGTTGGCTCCACTTCCTATAGGATTTGCAGTGTTCATGGTTCATTTGGCTACTA7200129]TTCCTATCACCGGAACTGGTATTAACCCTGCTAGMGCTTCGGCGCCGCCGTTATTTACA7800130]ACM0GACM GGCTTGGGAT GAOCAC gtaa gcttctcttt ctaaaaaaaatttcagtgtt840tttttgttca tttagtttgt gaaactaaca aaaatggcga caatgaacag TGGATATTCT 900GGGTTGGACC MTGGTGGGA GCACTTGCGG CGGCGGCATA TCATCAGTAC ATCCTTAGAG 960CGGCGGCTAT TMGGCTTTG GGATCTTTCC GGAGCMCCC CAGCMTTM1010
1权利要求
棉花水孔蛋白家族基因GhPIP2；6，其特征在于该基因的全长cDNA核苷酸序列如下GGGCACGAGT CAAAAAAGCT TCCAACATTT TGAAGAAACA AAGAATCAAA CATGTCGAAG 60GAAGTGAGTG AAGAAGGGGT GAGCCGAAAG GACTATGTGG ATCCTCCACC GGCACCGCTC 120ATCGACGTGG CTGAGATCAA GCTTTGGTCT TTTTACAGAG CTCTCATCGC CGAATTCATC 180GCTACTCTCC TCTTCCTATA CGTCACCATA GCCACCGTCA TCGGCCACAA GAAACAACAC 240GATGCATGCG ATGGTGTTGG TCTTTTGGGC ATTGCTTGGG CTTTTGGTGG CATGATTTTC 300ATTCTTGTTT ACTGCACCGC CGGTATCTCA GGTGGTCACA TTAACCCGGC GGTGACATTT 360GGGTTGTTTT TGGCTAGGAA GGTGTCGTTA ATAAGGGCGG TGGCTTACAT GGTAGCTCAA 420TGTTTGGGTG CTATTTGTGG TGTTGGGTTA GTTAAGGCAT TCATGAAGAG TGAATACAAC 480TCCCTTGGCG GCGGTGTTAA CACGGTGGCG ACTGGTTATA ACAAAGGGAC TGCTTTGGGA 540GCTGAGATTA TTGGGACATT CGTGCTTGTT TACACTGTTT TTTCAGCTAC TGACCCTAAA 600AGAAGTGCCC GTGATTCACA TGTACCCGTG TTGGCTCCAC TTCCTATAGG ATTTGCAGTG 660TTCATGGTTC ATTTGGCTAC TATTCCTATC ACCGGAACTG GTATTAACCC TGCTAGAAGC 720TTCGGCGCCG CCGTTATTTA CAACAACGAC AAGGCTTGGG ATGACCACTG GATATTCTGG 780GTTGGACCAA TGGTGGGAGC ACTTGCGGCG GCGGCATATC ATCAGTACAT CCTTAGAGCG 840GCGGCTATTA AGGCTTTGGG ATCTTTCCGG AGCAACCCCA GCAATTAAAA GCTAAAAAGA 900GAAGAAAACC ACAATATGTT TGTCTCATTG TGTTTATAAT GTTTCTTCAT TGTTGGTTCC 960TGTGTGTGTA TTGTATTATG ATTGATGATT ATTAATTCAG ACCTTTTTAT TT1012
2.按照权利要求1所述的一个棉花水孔蛋白家族基因GhPIP2 ;6，其特征在于与该基因的第52 888核苷酸对应的编码氨基酸序列如下Met Ser Lys Glu Val Ser Glu Glu Gly Val Ser Arg Lys Asp1510Pro Pro Pro Ala Pro Leu lie Asp Val AlaTyr 35 ThrPro Ala 20Arg Ala Leu lieLeu lie Asp Val 25Glu Phe lie AlaGlu lieAla 40 lielie Ala Thr Val 55Leu Leu Gly lieGly HisVal Gly 70Val Tyr Cys ThrLys 60 AlaLysThr 45 GlnLeuLys 30 LeuTyr Val Asp 15Leu Trp Ser PhePhe Leu Tyr Val 50Cys Asp GlyPhe Gly Leu 105 AlaAla 90Phe Leu Ala ArgAla Trp 75Gly lie Ser GlyHis Asp Ala 65Met lie Phe liePhe Gly Gly 80His lie Asn ProMet 120 PheVal 125 MetLys 110 AlaValGly 95 SerLeu 85 ThrLysGln Cys Leu Gly 130Ser Glu Tyr Asn Ser 140lie CysLeu Gly 145Leu lie Arg 115 GlyGly GlyVal 135Gly ValAla Val 100Ala Val Ala Tyr Leu Val Lys AlaAsn 150Thr Val Ala
3.按照权利要求l所述的棉花水孔蛋白家族基因GhPIP2；6，其特征在于该基因的基因组DNA全长核苷酸序列如下(斜体下划线标记的序列为内含子核苷酸序列)ATGTCGAAGG AAGTGAGTGA AGAAGGGGTG AGCCGAAAGG ACTATGTGGA TCCTCCACCG60GCACCGCTCA TCGACGTGGC TGAGATCAAG CTTTGGTCTT TTTACAGAGC TCTCATCGCCl 20GAATTCATCG CTACTCTCCT CTTCCTATAC GTCACCATAG CCACCGTCAT CGGCCACAAGl 80AAACAACACG ATGCATGCGA TGGTGTTGGT CTTTTGGGCA TTGCTTGGGC TTTTGGTGGC 240ATGATTTTCA TTCTTGTTTA CTGCACCGCC GGTATCTCAG G了AC厂C厂CCC CCCCCCAAAA 300 ACGACGCAGG 7CGTCACATT AACC。GCOCG．mACArI”m GTKrIT厂IG GCrAGGAACG420TGTCGTTAAT AAGGGCGGTG GCTTACATGG TAGCTCAATG TTTGGGTGCT ATTTGTGGTG 480TTGGGTTAGT TAAGGCATTC ATGAAGAGTG AATACAACTC CCTTGGCGGC GGTGTTAACA 540CGGTGGCGAC TGGTTATAAC AAAGGGACTG CTTTGGGAGC TGAGATTATT GGGACATTCG 600TGCTTGTTTA CACTGTTTTT TCAGCTACTG ACCCTAAAAG AAGTGCCCGT GATTCACATG 660TACCCGTGTT GGCTCCACTT CCTATAGGAT TTGCAGTGTT CATGGTTCAT TTGGCTACTA 720TTCCTATCAC CGGAACTGGT ATTAACCCTG CTAGAAGCTT CGGCGCCGCC GTTATTTACA 780ACAACGACAA GGCTTGGGAT GACCAC GTAA GCTTCTCTTT CTAAAAAAAA TTTCAGTGTT 840TTTTTGTTCA TTTAGTTTGT GAAACTAACA AAAATGGCGA CAATGAACAG嚣GA TA T TC T 900GGGTTGGACC AATGGTGGGA GCACTTGCGG CGGCGGCATA TCATCAGTAC ATCCTTAGAG 960CGGCGGCTAT TAAGGCTTTG GGATCTTTCC GGAGCAACCC CAGCAATTAAl o l o
全文摘要
棉花纤维特异表达的水孔蛋白家族基因GhPIP2；6。该基因的cDNA全长序列为1012bp，基因全长序列为1134bp，由3个外显子和2个内含子组成。GhPIP2；6基因编码的蛋白质为278个氨基酸，分子量约为29.6kDa，其蛋白具有很高的水通道活性。GhPIP2；6在棉纤维中特异表达，其转录产物主要在伸长期的棉纤维中积累。在酵母中表达GhPIP2；6基因能促使宿主细胞纵向伸长，细胞长度是对照的1.30～1.47倍。相反，用HgCl2处理导致该蛋白活性下降，棉纤维细胞伸长迟缓，长度变短。上述实验结果证明GhPIP2；6在棉纤维伸长过程中起重要作用，这个水孔蛋白基因对于改良棉纤维品质、增加棉花产量可能具有重要的应用价值。
文档编号C12N15/29GK101906425SQ20091027336
公开日2010年12月8日 申请日期2009年12月23日 优先权日2009年12月23日
发明者吴雅洁, 李学宝, 李登弟, 王秀兰, 阮想梅 申请人:华中师范大学