高效率转基因棉花表达载体与应用的制作方法

专利名称：高效率转基因棉花表达载体与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物表达载体及其应用，特别是高效率转基因棉花表达载体与应用。
背景技术：
转基因动物最早的典型例子是1982年由美国华盛顿大学Palmiter等报告的“超 级小鼠”。但在这之前，1974年，Jaenisch等用显微注射的方法将SV40的DNA导入到小鼠的 胚囊中，在自带小鼠的肝、肾组织中检测到了 SV40的DNA，这证明将外源基因导入胚胎细胞 中并实现整合是可能的。1980年，Gordon等采用受精卵原核显微注射法，首次成功地将疱 疹病毒和SV40的DNA片段导入小鼠基因组，当时Gordon和Ruddle称这种转化小鼠为“转 基因小鼠”。转基因植物，1983年采用农杆菌介导方法培育出世界上第一例转基因植物——转 基因烟草。现在基因工程已遍及各种动植物及微生物，由于分子生物学技术的飞速发展，转 基因对于改良动植物品质、提高抗逆性以及生物医药领域正在发挥巨大的作用。国内外植物转基因方法在植物基因转化的研究中已建立了多种转化方法载体 转化系统、原生质体DNA直接导入转化、基因枪DNA导入转化、花粉管通道法等。目前应用 最多、机理研究最明确的为载体转化系统，其载体包括Ti质粒、Ri质粒及病毒转化载体等。 花粉管通道转基因方法由我国科学家发明周光宇在广泛调查国内外远缘杂交工作的基础 上，提出DNA片段杂交假说，并设计了外源DNA直接导入受体的花粉管通道法。通常转基因需要构建高效表达载体，为了使得转基因后的植株容易筛选，一般采 用双元表达载体。常用的植物表达载体为PBI121和pCambia系列。筛选标记基因是指在 遗传转化中能够使转化细胞(或个体)从众多的非转化细胞中筛选出来的标记基因。它们 通常可以使转基因细胞产生对某种选择剂具有抗性的产物，从而使转基因细胞在添加这种 选择的培养基上正常生长，而非转基因细胞由于缺乏抗性则表现出对此选择剂的敏感性， 不能生长、发育和分化。在构建载体时，筛选标记基因连接在目的基因一旁，两者各有自己 的基因调控序列(如启动子、终止子等)。目前常用的筛选标记基因主要有两大类抗生素 抗性酶基因和除草剂抗性酶基因。前者可产生对某种抗生素的抗性，后者可产生对除草剂 的抗性。使用最多的抗生素抗性酶基因包括NPTII基因(产生新霉素磷酸转移酶，抗卡那霉 素)、HPT基因(产生潮霉素磷酸转移酶，抗潮霉素)和Gent基因(抗庆大霉素)等。常用 的抗除草剂基因包括EPSP基因(产生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗草甘磷)、 GOX基因(产生草甘膦氧化酶、降解草甘膦)、bar基因(产生PPT乙酰转移酶，抗Bialaphos 或glufosinate)等。其中pCambial301和pCambia3301较为常用。近几年来，转基因植物 中筛选标记基因的生物安全性已引起全球关注。例如，人们担心转基因植物的抗生素抗性 标记基因转移进入人或动物的病原菌中，从而引起这些病原菌对抗生素的抗性，使抗生素 失去效力。pCambia3301采用的bar基因作为标记基因，对转基因后代采用喷施Basta(—种除草剂)来筛选可以获得转基因阳性植株。但经过多年研究发现，喷施Basta对于筛选棉 花转基因阳性植株准确性不高，同时由于国内许多研究部门采用我国首创的花粉管通道转 基因方法，若采用该载体更难以获得令国际同行信服的研究结果。PCAMBIA1301载体采用超霉素筛选，也不适合棉花转基因。为此我们经过多年研 究，构建了 PSPT高效植物表达载体。

发明内容
本发明的目的是提供一种植物表达载体及其应用。该植物表达载体可以高效率培 育转基因棉花。本发明所提供的植物表达载体，包括表达tfdA基因的表达盒；所述表达盒由依次 连接的CaMV35S启动子、tfdA基因和终止子组成；所述tfdA基因的核苷酸序列为序列表中 序列2，所述CaMV35S启动子的核苷酸序列为序列表中序列1。所述植物表达载体中还包括Flag标签，Flag标签的核苷酸序列为序列表中序列 3。所述植物表达载体的基础构架载体为pcambial300。所述植物表达载体按照下述方法构建1)将CaMV35S启动子连接于tfdA基因的5'端获得的片段插入到pCambial300 的BstXI和XhoI酶切位点之间，获得重组载体A ；2)将序列表中序列3所述的Flag标签片段插入重组载体A的多克隆位点，获得所 述植物表达载体。所述步骤2)中，所述的Flag标签片段优选先用XbaI和HindIII双酶切后，回收 Flag标签片段，插入重组载体A的XbaI和HindIII之间。所述步骤1)中，所述pCAMBIA1300中驱动目的基因表达的启动子(多克隆位点前 的启动子)替换为super强启动子，所述super强启动子的核苷酸序列为序列表中序列5。所述步骤1)中，所述pCAMBIA1300的多克隆位点的酶切位点改造为Sail、KpnI, BamI、SpeI、Sail、ApaI、SmaI、SwaI、PstI、HindIII、XbaI 及 AccIII0本发明的植物表达载体可用于培育转基因棉花，并具有如下优势本发明的pSPT载体具有如下优势(1)目的基因得到超强表达。Super强启动子可以保证目的基因转化植物后得到 高剂量表达，以便于对目的基因的功能分析，同时对于提高转基因植物在抗性、产量及品质 等方面发挥作用。(2)转基因阳性植株(尤其棉花等双子叶植物)便于简易、快速、准确筛选。由于 棉花等双子叶植物对植物生长调节剂2. 4-D极为敏感，可用苗期喷施2. 4-D方法区分转基 因与野生型植株。用质量百分浓度为0. 003% -0. 005%的2. 4-D 丁酯溶液喷洒转基因幼苗， 一般7-10天即可区分正常株与异常植株，由于转基因阳性植株携带有tfdA基因，因此抗 2. 4-D表现新叶正常生长；异常株由于则不携带tfdA基因，因而新长出叶片表现畸形(图 3)。在转基因后代筛选时利用这一手段，准确性近乎可达到100%。(3)容易区分外源导入及内源基因。由于通常克隆的基因来源于植物本身，为区分 转基因与植物本身已有的基因，我们在目的基因的5’端增加了 Flag序列，在经过标记基因
4识别基础上，还可以5’端的Hag序列设计通通用引物，结合外源基因的5’端特异引物，只 需利用PCR即可证明阳性植株确实存在外源基因(图4)。(4)为花粉管转基因方法提供了铁证。棉花的花粉管通道转基因方法由我国科学 家提出，一直没有得到国际主流科学家的认可，我们利用该载体构建包含目的基因的重组 载体，利用花粉管通道转基因后，对获得的混合种子以及由此种出幼苗喷施2. 4-D识别，结 合对转基因T3代的Southern杂交(图4)及Northern杂交(图5)，有利地证明了转基因 阳性植株的可靠性，从而为花粉管通道转基因方法的可行性提供了铁证。本发明的载体的构建，对于棉花转基因研究在棉花基因重组表达载体构建、基因 转化(尤其为我国花粉管转基因提供了铁证)、转基因后代筛选、乃至整个棉花基因工程具 有极为重大的应用价值。


图1为pSPTOl载体构建过程示意图。图2为pSPT载体结构示意图。图3为转基因阳性植株田间筛选结果，阳性植株真叶生长正常(右，阳性株)，非转 基因株真叶为畸形(左，野生株)。图4为利用pSPT载体构建的pSPT_At7重组载体。图5为转pSPT_At7棉花Southern杂交检测结果图6为转pSPT_At7棉花Northern杂交检测结果图7为利用pSPT_At7载体获得的棉花转基因T3代株系图8为免去雄杂交种Fl田间表现图9为免去雄授粉过程图10为免去雄杂交种苗期表现(鉴别真假杂交种示意图)
具体实施例方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、构建便利筛选及高效转基因棉花表达载体—、高效转基因棉花表达载体的获得pSPT载体是以pCambia1300为基础进行改造的，我们所用目的基因的启动子为 Super强启动子，在启动子后面增加了 Flag序列，此外把报告基因由Hygromicin (R)基因更 换为tfdA基因，经过改造后的载体命名为pSPT(图2)。pSPT载体的构建过程如下所述将pCAMBIA1300中的CaMV35S启动子更换为Super强启动子。本实验室首先 将PCAMBIA1300的多克隆位点进行改造，改造后的位点为SalI、KpnI, BamI, SpeI, Sail、 ApaI、SmaI、SwaI、PstI、Hindi 11、XbaI 及 AccII I。我们首先合成 了含有 Mf el、BamI、SpeI、 SalI、ApaI、SmaI、SwaI、PstI、HindIII、XbaI、AccIII 及 HindIII 酶切位点的 DNA 片段，其 序列为CAATTG GGATCC ACTAGT GTCGACGGGCCC CCCGGG ATTTAAAT CTGCAG AAGCTT TCTAGA GTAGACAAGCTT。然后将pCAMBIA1300载体和人工合成的多克隆片段用EcoRI和HindIII酶 切，回收载体大片段和多克隆片段(再测序)，用T4连接酶连，由此完成了酶切位点的更换。然后在AccIII和XbaI之间插入Super启动子，在Super启动子5’端增加PinA酶切位点，利用AccIII和PinA酶的互补序列使得启动子之前不在具有酶切位点。经测序验证 后命名为pCAMBIA1300-Super载体。Super启动子长度为1143bp，由pMSP3535H3为模板设 计引物上游引物5’ -agtactCTAGATTCGACGGTATCGCGATAAG(引物中前面小写部分为PinA酶 切位点)，下游引物5’-tctagaGTCGATTTGGTGTATCGAGATTG(引物中前面小写部分为XbaI酶 切位点)PCR扩增PCR扩增获得(pMSP3535H3购自BVTech公司)，其序列见序列表5。PCR 扩增获得的Super启动子插入上述载体的AccIII和XbaI之间之前，先用PinA和XbaI双 酶切，然后可连接到用AccIII和XbaI酶切后的pCAMBIA1300上，由此可消除启动子前面的 酶切位点。在pCAMBIA1300-Super载体基础上，我们进行了如下改造1、CaMV35S启动子的获得首先我们设计引物获得CaMV35S启动子，5’端引物包含有BstXI酶切位点、3’端 引物包含有 NcoI :BstXI-35S-5，5’ -CCAACATGGTGGAGCACGACACTCTC-3，和 35S-NcoI_3，5 ，-CCATGGATCTCATTGCCCCCCCGGATCTG-3，，以 pCAMBIA1300 (购自金维克(中国)生物技术中 心)为模板扩增得到CaMV35S启动子(825bp)，序列为序列1。2、tfdA基因的获得以pJP4(购自DSMZ GmbH)为模板获得了 tfdA基因，以上游引物 5’ CCATGGGTGAGCGTCGTCGCAAATC(引物的 5，端加 NcoI 酶切位点)，下游引物为 5 ‘ -CTCG AGCTAGACGACGGCATCGTCCAGGGT (引物的5，端加XhoI酶切位点)，进行PCR扩增，结果获得 888bp 的片段，测序表明该片段具有 GENBANK Accesion version Number 为 AY365053. 1 的 5'端第36915-37778位核苷酸序列，即tfdA基因序列(序列表中序列2)。3、pSPT载体的构建1)将CaMV35S启动子和tfdA分别连接与pMD18_T载体上(购自华绿渊生物技术 有限公司)，再用NcoI和SalI分别酶切含有tfdA的pMD18_T载体，回收tfdA片段，然后将 该tfdA片段与经过NcoI和SalI酶切的含有CaMV35S启动子的pMD18_T载体的连接，即将 tfdA基因连接于含有CaMV35S启动子的pMD18_T载体上；将经酶切和测序表明正确的重组 载体命名为pMD18-T-35S-tfdA ；pMD18-T-35S_tfdA中，CaMV35S启动子连接于tfdA基因的 5'端。2)用BstXI和XhoI酶切pCAMBIA1300_Super载体回收载体大片段，用BstXI和 SalI酶切pMD18-T-35S-tfdA回收CaMV35S_tfdA片段，将获得载体大片段和CaMV35S_tfdA 用T4连接酶获得重组载体，经测序验证正确的含有CaMV35S和tfdA的重组载体命名为 pSPTOl(图1)。pSPTOl载体中，tfdA基因的5'端与CaMV 35S启动子相连接，3'端与 pCambial300-Super载体自身的PolyA终止子相连。3)人工合成5，端含有XbaI酶切位点、3，端含有HindIII酶切位点的Flag标签 序列TCTAGAGATGGCGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGACTATAAAGATGACGATGACAAGTCTAGAAA GCTTCTGCAGGTCGACGATTCCAAGCTT (序列表中序列 3)，用 XbaI 和 HindIII 双酶切 pSPTOl 和上 述人工合成片段，再用T4连接酶连接，将Flag标签序列插入Super强启动子的后面，构建 获得重组载体，经酶切和测序表明正确的载体命名为PSPT载体。二、pSPT载体在棉花转基因中的应用
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1、转基因实例 pSPT_At7禾Ij用pSPT载体，我们将自主克隆的基因At7(专禾Ij号ZL2005 1 0098277. 3)构建了 PSPT_GbAt7载体。用海岛棉海7124 (购自国家棉花种植资源 库)在黄萎菌毒素诱导后所获得的cDNA为模板，设计引物GbAt7引物上游引物为 5 ‘ -CCATGGCTAGCTCAATGTCCCTTAAG,下游引物为 5，-TCACTTGACGCTGTTGCAGTCAGTG,经过 PCR扩增达到350bp的GbAt7序列如序列表中序列4所示。将GbAt7 连接到 pMD18_T 上，得到 pMD18_GbAt7，用 PstI 和 KpnI 双酶切 PMD18-GbAt7和pSPT载体，然后将GbAt7连接到pSPT载体的PstI和KpnI的位点上，由此 构建获得PSPT-GbAt7重组载体。提取PSPT-GbAt7质粒，用花粉管通道方法转化自育品种GK164(已于2007年通 过了河北省新品种审定，冀审棉2007007号)。经过连续三代苗期喷施质量百分浓度为 0. 003% -0. 005%的2. 4-D 丁酯溶液，筛选获得了转PSPT_GbAt7棉花T3代株系。将筛选获得转pSPT-GbAt7棉花T3代进行Southern杂交和Northern杂交检测。 所用探针为GbAt7的ORF框，首先用PstI和KpnI酶切PSPT_GbAt7，回收GbAt7，然后用dCTP 同位素标记探针，进行Southern杂交和Northern杂交检测。研究结果表明，我们已获得了转基因纯度达到100%的转基因后代(转基因后获 得的种子，播种后经过喷施2. 4-D鉴别可获得真叶正常的Tl代植株，将Tl代上收获的自交 种子种植出苗后再进行鉴别，可获得T2代植株，对T2代分单株收获T3种子，再将T3种子 长出的棉苗用2. 4-D鉴别，凡是不再出现叶株的株系即为达到了完全纯和株行，他们的纯 度达到了 100% )的株系30个(部分Southern杂交结果如图5所示，部分Northern杂交 结果如图6所示)。2、免去雄杂交制种技术利用该载体的报告基因tfdA作为分子标记，我们不仅可以喷施2. 4-D识别转基因 后代的阳性植株，同时当用转基因后代的纯合体作为父本，用非转基因品种作为母本，在免 去雄情况下直接授粉，能获得包含母本自交和与父本杂交的混合种子，待混合种子种下出 苗后，可以通过喷施2. 4-D识别杂交种(包含tfdA报告基因)和非杂交种(不包含tfdA 报告基因)，由此可以在杂交制种时省去去雄程序-实现免去雄杂交制种。以下述棉花免去 雄杂交制种实验为例，说明本发明载体的应用。1)转tfdA基因的父本的获得我们选择棉花品种包括早熟棉花品种如采用新疆的新陆早33号(购自新疆国棉 三益种业有限责任公司)，中熟品种为GK164(自育品种，已于2007年通过了河北省新品种 审定，审定编号冀审棉2007007号，购自山东农兴种业有限公司)，中熟品种为泗棉3号 (购自合肥丰乐种业股份有限公司)等作为构建父本的材料。将步骤构建的pSPT载体利用采用花粉管通道法(王长海，蓝海燕，利用花粉管通 道法将外源质粒DNA注入棉花的改良方法，棉花学报，1999年04期)分别导入上述棉花品 种，获得Tl代种子后，首先播种于温室，待出苗后用质量百分浓度为0. 003%的2. 4-D溶液 喷于棉苗的子叶表面，10天左右淘汰畸形真叶植株保留正常株(可能为转基因植株)，然后 再通过特异引物PCR检测，并对PCR产物进行测序进一步确认阳性植株。PCR检测引物为 5，-ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGC，和 5，-GTCCGCGGTGAAGAACGCAGCGG ；PCR 获得 799bp 的片段的植株为阳性植株。将上述PCR鉴定为阳性的植株通过夏季北方种植，冬季海南加代，一般T3代即可 获得纯合株系(对T2代分单株收获，可得到T3代种子，播种出苗后可得到T3代幼苗，对幼 苗进行2. 4-D处理识别，凡是不再出现非正常叶形的即可视为纯合株系候选株系，再经过 PCR进一步验证可以确认)。将鉴定为转pSPT载体的纯合株系作为杂交父本进行如下免去 雄杂交。2)免去雄杂交利用转tfdA基因的父本，选用适合当地气候特点的优良品种作为母本，在母本不 去雄情况下，直接用父本花粉进行授粉。在棉花出苗后，通过在苗床或大田中喷施2. 4-D，由 于杂交种携带有抗2. 4-D的基因(该基因来自父本，父母本杂交及获得杂交种)，而母本自 交种则不携带抗性基因，又由于棉花对2. 4-D极为敏感，因此在极低的浓度下即可识别出 自交种(新出叶片畸形)和杂交种(新出真叶形状正常)，通过人工识别可彻底去除自交 种，从而保证田间杂交种纯度达到100%。将上述获得的转tfdA基因的父本分别与鲁棉研18进行免去雄杂交制种。免去雄 杂交制种具体方法如下所述①在父本开花后(请注意调整于母本开花期一致)，取父本花粉(父本花药可于前 一天下午5-6点钟摘取次日将要开花的花蕾，也可在次日上午6-10点直接取花粉)给母本 即将开放(花冠长度超过5cm)至开放3个小时之内的花授粉。具体操作方法为于每天早 晨7 10，取棉花父本的花粉装入小瓶，在小瓶盖子上打一小孔，大小正好可容纳棉花的柱 头进出，然后把母本将花冠撕开(若花已开则省略此步骤)，将小瓶倒置使得柱头可以进入 小瓶与其中的花粉接触，用手指轻叩小瓶底部即可完成授粉过程(图9)；棉花收获时所获 得的种子包含有杂交种和自交种。2)第二年将混合种子播种于苗床或大田，播种量适当增加，若直播于田间则最好 为穴播，每穴3粒种子较为适宜(本实施例选择大田田间播种，穴播，每穴3粒种子)，待 棉花出齐苗后喷质量百分浓度为0. 003%或0. 005%的2. 4-D溶液，注意要在无风情况下 用专用喷雾器带喷雾罩喷洒，以免影响其他双子叶植物；喷药后约15天可依据真叶形状， 保留正常叶片棉苗(杂交种)，去除畸形叶片(自交种)即可。图10为免去雄杂交种苗期 表现(识别真假杂交种示意图)。杂交种的后期移栽及田间管理完全同其他棉花杂交种， 经过识别保留的正常棉苗即免去雄杂交种Fl代植株，Fl代植株的田间表现如图8。上述 实验证明，0. 003%和0. 005%的2. 4-D溶液，可使杂交种棉苗生长正常，使非杂交种棉苗 真叶畸形，在2. 4-D 0. 003%和0. 005%作用浓度下，其作用效果没有差异，平时可以使用 0. 003% -0. 005%的2. 4-D溶液处理，筛选杂交种。对于免去雄所配制的杂交种，待种子收获后随机取样种植于温室，出苗后喷施 2. 4-D，7-10天后记录正常真叶株数，并对正常真叶的植株进行如上步骤2所述PCR检测筛 选正常株，正常株占总苗数的比例即为该混合种子的杂交种纯度。按照上述方法，经过多年反复试验证明，步骤1)授粉后获得的混合棉花种子中杂 交种的比例为通常在67%左右，而母本自交种比例33%左右；这可能是由于外来花粉比母 本自身的花粉更具有竞争力，并且本发明方法也选择了利于外来花粉竞争力的时间条件， 上述实验也证明，最终通过步骤2)筛选得到的杂交种(苗)纯度可达100%。
上述实验证明，本发明的免去雄杂交制种技术体系具有三大优点(1)制种成本 低。我们通过3年大规模试验，若在免去雄情况下直接授粉，每亩只需用工5. 6小时/天，而 人工去雄授粉每天大约需要30小时/天。因此，免去雄杂交制种技术可节约用工81. 3% ； (2)杂交种纯度可达100%。在棉花出苗后利用2. 4-D处理，经过间苗剔除自交种后，可保 证杂交种纯度达到100%; (3)自由选配组合。该项技术只需采用携带tfdA基因的父本，母 本选择不受限制，可选用当地具有优良农艺性状或品质优异的品种，与不育系技术相比，更 容易获得适合当地生态环境的优势杂交组合。由于2. 4-D为专杀双子叶植物的选择性除草剂，因此免去雄杂交制种方法同样适 合于棉花之外的其他双子叶植物。此外，利用该载体，我们还构建了具有抗病等功能的重组载体8个，通过转基因也 分别得到了多个转基因T3代纯和群体(图7)。以上实验表明，本发明的pSPT载体具有如下优势(1)目的基因得到超强表达。Super强启动子，可以保证目的基因转化植物后得到 高剂量表达，以便于对目的基因的功能分析，同时对于提高转基因植物在抗性、产量及品质 等方面发挥作用。(2)转基因阳性植株(尤其棉花等双子叶植物)便于简易、快速、准确筛选。由于 棉花等双子叶植物对植物生长调节剂2. 4-D极为敏感，可用苗期喷施2. 4-D方法区分转基 因与野生型植株。用质量百分浓度为0. 003%的2. 4-D 丁酯溶液喷洒转基因幼苗，一般7-10 天即可区分正常株与异常植株，由于转基因阳性植株携带有tfdA基因，因此抗2. 4-D表现 新叶正常生长；异常株由于则不携带tfdA基因，因而新长出叶片表现畸形(图3)。在转基 因后代筛选时利用这一手段，准确性近乎可达到100%。(3)容易区分外源导入及内源基因。由于通常克隆的基因来源于植物本身，为区分 转基因与植物本身已有的基因，我们在目的基因的5’端增加了 Flag序列，在经过标记基因 识别基础上，还可以5 ’端的Hag序列设计通通用引物，结合外源基因的5 ’端特异引物，只 需利用PCR即可证明阳性植株确实存在外源基因(图4)。(4)为花粉管转基因方法提供了铁证。棉花的花粉管通道转基因方法由我国科学 家提出，一直没有得到国际主流科学家的认可，我们利用该载体构建包含目的基因的重组 载体，利用花粉管通道转基因后，对获得的混合种子以及由此种出幼苗喷施2. 4-D识别，结 合对转基因T3代的Southern杂交(图4)及Northern杂交(图5)，有利地证明了转基因 阳性植株的可靠性，从而为花粉管通道转基因方法的可行性提供了铁证。
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权利要求
一种植物表达载体，包括表达tfdA基因的表达盒；所述表达盒由依次连接的CaMV35S启动子、tfdA基因和终止子组成；所述tfdA基因的核苷酸序列为序列表中序列2，所述CaMV35S启动子的核苷酸序列为序列表中序列1。
2.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体中还包括 Flag标签，所述Flag标签的核苷酸序列为序列表中序列3。
3.根据权利要求1或2所述的植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体的基础 构架载体为PCAMBIA1300。
4.根据权利要求1或2或3所述的植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体按 照下述方法构建1)将CaMV35S启动子连接于tfdA基因的5'端获得的片段插入到pCAMBIA1300的 BstXI和XhoI酶切位点之间，获得重组载体A ；2)将序列表中序列3所述的Flag标签片段插入重组载体A的多克隆位点，获得所述植 物表达载体。
5.根据权利要求4所述的植物表达载体，其特征在于所述步骤1)中，所述 PCAMBIA1300中驱动目的基因表达的启动子替换为super强启动子，所述super强启动子的 核苷酸序列为序列表中序列5。
6.根据权利要求5所述的植物表达载体，其特征在于所述步骤1)中，所述 PCAMBIA1300 的多克隆位点的酶切位点改造为 Sail、KpnI, BamI, SpeI, Sail、ApaI, SmaI, SwaI、PstI、HindIII、XbaI及 AccIII。
7.根据权利要求4或5或6所述的植物表达载体，其特征在于所述步骤2)中，所述 的Flag标签片段先用XbaI和HindIII双酶切后，回收Flag标签片段，插入重组载体A的 XbaI 和 HindIII 之间。
8.权利要求1-7中任意一项所述的植物表达载体在培育转基因棉花中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种植物表达载体及其应用。该植物表达载体包括表达tfdA基因的表达盒；所述表达盒由依次连接的CaMV35S启动子、tfdA基因和终止子组成；所述tfdA基因的核苷酸序列为序列表中序列2，所述CaMV35S启动子的核苷酸序列为序列表中序列1。本发明的载体的构建，对于棉花转基因研究在棉花基因重组表达载体构建、基因转化(尤其为我国花粉管转基因提供了铁证)、转基因后代筛选、乃至整个棉花基因工程具有极为重大的应用价值。
文档编号C12N15/82GK101962658SQ20101052170
公开日2011年2月2日 申请日期2010年10月21日 优先权日2010年10月21日
发明者巩志忠, 张定朋, 王妍卿, 罗祖勇, 陈智忠, 齐俊生 申请人:中国农业大学