专利名称：：一种植物双向启动子bigdb3的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种植物双向启动子BI⑶B3的克隆与应用。
背景技术：
：通过导入外源基因使植物获得新的性状并能稳定遗传是植物基因工程的最终目的。花椰菜病毒CaMV35S启动子作为稳定、高效的外源启动子，一直被人们广泛的使用。然而在转基因过程中由于重复序列的出现会引起基因沉默现象，尤其是进行多个基因导入时，这种现象会更严重，从而严重影响了转基因植株的获得和后代的稳定性。而在进行两个或两个以上基因导入时，通常需要这些基因的表达量、表达时间和位置的同一性，进而确保转入基因行使正常的功能，使用35S启动子很难达到这样的要求。这些都是植物基因工程中亟待解决的问题。对于转基因引起的基因沉默现象人们已经有了比较深入的认识，引起转基因沉默有多种因素，其中最主要的就是重复序列的产生，尤其是多个基因导入时，更人为的造成了多个35S启动子插入的情况，对此至今尚无有效的解决方法。随着基因组学的发展，多种生物基因组测序已完成，经过生物信息学分析人们发现了双向启动子的存在，这为我们利用植物自身的双向启动子进行转基因操作，从而避免多基因插入引起的基因沉默现象提供了可能。
发明内容本发明的目的在于提供一种DNA片段，来源于拟南芥。本发明提供的DNA片段的核苷酸序列是如下1)或2)或3):1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)的核苷酸序列具有65%以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。序列表中的序列1由528个脱氧核糖核苷酸组成，是拟南芥基因AT5G67500和AT5G67490的基因间序列。上述高严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2,7%SDS)中，65°C预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2,7%SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65°C杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，ρΗ7·2,5%SDS)，65°C洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，ρΗ7·2,1%SDS)，65°C洗膜30min。本发明的DNA片段(启动子活性片段)还包括与来自序列表中序列1的片段的核苷酸序列互补的核苷酸序列。这里使用的术语“互补的”系指遵循碱基配对原则产生的之辰、ο本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的调控片段的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的调控片段的核苷酸序列70%或者更高同源性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同源性，，指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性，，包括与本发明的调控片段的核苷酸序列具有优选地75%或更高，更优选地85%或更高，甚至更优选地90%或更高，以及最优选地95%或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。含有上述的DNA片段的重组载体也属于本发明的保护范围之内。上述重组载体是上述的DNA片段插入载体PM0A34-G/L的多克隆位点制成的重组载体；上述载体pM0A34-G/L具体可以是将⑶S基因和LUC基因分别插入pM0A34载体的多克隆位点得到的载体。含有上述的DNA片段的转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。含有上述的DNA片段的重组菌也属于本发明的保护范围之内。上述的DNA片段在作为启动子中的应用也属于本发明的保护范围之内。进一步讲，上述启动子是双向启动子。上述应用具体可以是上述的DNA片段在驱动目的基因在植物体内表达中的应用。上述植物为双子叶植物或单子叶植物，如拟南芥或烟草。实验证明，将本发明的BI⑶Bl插入载体pM0A34-G/L中的⑶S和LUC之间后，BI⑶Bl能双向启动⑶S和LUC，说明BI⑶Bl具有双向启动功能。图1为pM0A34-G/L-BI⑶B3植物双元载体图谱。图2为转基因拟南芥GUS染色结果，A是刚萌发的种子，B是去掉种皮的刚萌发的种子，C是胚芽，D是子叶展开的幼苗，E是三片真叶的幼苗，F是花序。图3为转基因拟南芥LUC分析结果，A、B、C是不同的转基因株系。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、启动子的获得及其检测一、启动子的获得根据生物信息学分析的结果，拟南芥基因组中存在一些潜在的双向启动子序列。以拟南芥基因组DNA为模板，利用正向引物(BIGDB3-F5'-GAGCTCTAGAGCGGCCGCTGTTAGATCAGATGTGTCGGCC-3‘)和反向引物(BIGDB3_R:5'-ACGCGTCGACGGTTGATCGGAGATTGAGAGAGATC-3')扩增，扩增产物进行琼脂糖电泳分离，回收并连接到pEASY-Tl(全式金公司)克隆XLl-BLUE(AgilentTechnologies-StratageneProducts)中，I^IlJ序后确定克隆载体正确，扩增产物(命名为BIGDB3)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。二、重组表达载体的构建1、带标记基因的中间载体(pM0A34-G/L)的构建以pCambial300_221(CAMBIA公司)载体为模版，禾U用引物GUS-F5‘-ACGCGTCGACATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAAC-3‘禾PGUS-R5'-CAGCCGACCGGTTCATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3‘扩增出1812bp的GUS基因，经测序后，通过SalI和AgeI双酶切连接到pM0A34载体上(记载该材料的文献是Barrell，P.J.andConner,A.J.(2006)MinimalT-DNAvectorssuitableforagriculturaldeploymentoftransgenicplants,公众可从中科院遗传与发育生物学研究所获得)，构建成pM0A34_G中间载体。将pGL3_EnhancerVector(Promaga公司)经XbalI(补平)和XhoI双酶切后的产物LUC基因与中间载体pM0A34-G经SpeI(补平)和XhoI双酶切后的载体进行连接，获得携带两个标记基因GUS和LUC的表达载体pM0A34-G/L。2、表达载体pM0A34-G/L-BIGDB3的构建用SalI和NotI双酶切步骤一验证正确的克隆载体和步骤1得到的植物表达载体PM0A34-G/L，回收后经T4DNA连接酶连接得到pM0A34-G/L_BI⑶B3植物表达载体(图1)。3、表达载体pM0A34-G/L-BI⑶B3(反向)的构建将pM0A34-G/L-BIGDB3中BIGDB3序列调转方向，构建成pM0A34_G/L_BIGDB3(反向)载体。以步骤一中带有BI⑶B3基因正确序列的克隆载体为模板，利用引物BI⑶B3-F25‘-GAGCGTCGACTGTTAGATCAGATGTGTCGGCC-3‘和BIGDB3-R25‘-ACGCGCGGCCGCGGTTGATCGGAGATTGAGAGAGATC-3‘，获得BIGDB3反向片段，经测序后用SalI和NotI双酶切连接到步骤二的步骤1得到的植物表达载体PM0A34-G/L，得到pM0A34-G/L_BI⑶Bl(反向)植物表达载体。三、转化植物并培养1、导入农杆菌通过电击转化的方法将步骤二中的pM0A34-G/L-BI⑶B3阳性克隆导入农杆菌EHA105中，挑取重组农杆菌单克隆菌落转入3-4mlLB培养液中(含100μg/ml壮观霉素和50μg/ml利福平)，28°C摇菌过夜。培养得到的菌液转接于500mlLB(含100μg/ml壮观霉素和50μg/ml利福平)，28°C摇菌过夜。当菌液0D600值为1.0，收集菌液入离心管，4000rpm、20min，收集菌体。用新鲜配制的如下溶液重悬菌体溶剂为水，溶质是壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)和蔗糖，其中，壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)(Fluka74385)的浓度为0.05%和蔗糖的质量百分浓度为5%。2、转化拟南芥选取抽苔期的野生型col-0生态型拟南芥(美国俄亥俄州立大学的生物资源中心(ABRC))健壮植株，通过真空渗透法将步骤1得到的农杆菌导入拟南芥花中，用塑料膜覆盖1天，保持湿润。然后将处理过的拟南芥植株放于2225°C的光照条件下使其正常生长。收获种子，干燥条件下保存待用。四、基因表达检测1、转基因拟南芥中⑶S的表达分析选取步骤三中10个不同株系的转基因拟南芥种子，于1/2MS培养基上萌发并生长，分别取刚萌发的种子、去掉种皮的刚萌发的种子、胚芽、子叶展开的幼苗、三片真叶的幼苗以及花序进行⑶S染色分析，⑶S染色方法参见JeffersonRA,KavanaghΤΑ,BevanMW(1987)GUSfusions:b_glucuronidaseasasensitiveandveratilegenefusionmakerinhigherplants.EMBOJ6:3901_7，分析结果如图2，转基因植株中GUS基因得到表达。2、转基因拟南芥中LUC的表达分析选取⑶S基因有表达的5个不同株系的转基因拟南芥，于1/2MS培养基上萌发并生长，取生长2周幼苗进行LUC发光分析，分析结果如图3，转基因植株中LUC基因得到表达。权利要求1.一种DNA片段，其核苷酸序列是如下1)或2)或3):1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)的核苷酸序列具有65%以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的DNA片段，其特征在于所述核苷酸序列3)是与所述1)的核苷酸序列具有90%以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。3.含有权利要求1或2所述的DNA片段的重组载体。4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于所述重组载体是权利要求1或2所述的DNA片段插入载体pM0A34-G/L的多克隆位点制成的重组载体；所述载体PM0A34-G/L是将GUS基因和LUC基因分别插入pM0A34载体的多克隆位点得到的载体。5.含有权利要求1或2所述的DNA片段的转基因细胞系。6.含有权利要求1或2所述的DNA片段的重组菌。7.权利要求1或2所述的DNA片段在作为启动子中的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述启动子是双向启动子。9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于所述应用是权利要求1或2所述的DNA片段在驱动目的基因在植物体内表达中的应用。10.根据权利要求7-9任一所述的应用，其特征在于所述植物为双子叶植物或单子叶植物，优选为拟南芥。全文摘要本发明公开了一种植物双向启动子BIGDB3。该启动子的核苷酸序列是序列表中序列1所示的核苷酸序列。实验证明，将本发明的BIGDB1插入载体pMOA34-G/L中的GUS和LUC之间后，BIGDB1能双向启动GUS和LUC，说明BIGDB1具有双向启动功能。文档编号C12N15/63GK102453717SQ20101052153公开日2012年5月16日申请日期2010年10月27日优先权日2010年10月27日发明者夏然,谢旗申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所